本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域,具體涉及一種用于單分子測序文庫模板構(gòu)建的帶標(biāo)簽接頭及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
以pacbioii測序平臺為代表的第三代單分子測序?qū)嶒炛?,在進行測序之前,需要構(gòu)建測序文庫模板,通過將dna樣本打斷到一定長度,然后對打斷的dna進行修復(fù)和末端補平、加接頭、純化等后續(xù)操作,完成文庫模板制備。
通常加接頭采用的接頭并不帶有標(biāo)簽序列,每個測序文庫模板只能包含一種樣品,對于dna總長度在幾kb到幾百mb的樣本如病毒基因組、bac基因組文庫、yac基因組文庫、質(zhì)粒等,一個測序文庫進行一輪測序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量遠超出獲得理想結(jié)果所需的目標(biāo)測序量,造成了測序資源浪費。
通過將目標(biāo)測序序列連接dna序列標(biāo)簽,可以將多個樣本進行混合,建立為一個測序文庫模板,通過后續(xù)反應(yīng),構(gòu)建測序文庫,進行測序。一個測序反應(yīng)可以完成對多個樣品的測序,節(jié)省測序資源,降低測序成本。目前市場上的帶標(biāo)簽引物試劑盒價格昂貴,使用受到嚴(yán)重限制。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
本發(fā)明提供了一種用于單分子測序文庫模板構(gòu)建的帶標(biāo)簽接頭及其應(yīng)用,提高pacbio測序平臺一次測序反應(yīng)的樣本通量,有效降低測序成本,為dna總長度在幾kb到幾百mb的樣本如病毒基因組、bac基因組文庫、yac基因組文庫、質(zhì)粒等提供高效低成本的加標(biāo)簽構(gòu)建測序文庫模板的方法。
一種用于單分子測序文庫構(gòu)建的帶標(biāo)簽接頭,其堿基序列如下列序列編號no.1~no.96所示:
no.1:5'pcattcgcaatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagattgcgaatg3';
no.2:5'pcatctctgatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatcagagatg3';
no.3:5'pcatcctagatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatctaggatg3';
no.4:5'pcatggatcatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatgatccatg3';
no.5:5'pcatgcaagatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatcttgcatg3';
no.6:5'pcatatggaatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagattccatatg3';
no.7:5'pcatctcgaatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagattcgagatg3';
no.8:5'pcatgctcgatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatcgagcatg3';
no.9:5'pcataccaaatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatttggtatg3';
no.10:5'pcatccggtatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagataccggatg3';
no.11:5'pcataactcatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatgagttatg3';
no.12:5'pcatttgaaatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatttcaaatg3';
no.13:5'pcatactatatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatatagtatg3';
no.14:5'pcatttggaatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagattccaaatg3';
no.15:5'pcatcgaccatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatggtcgatg3';
no.16:5'pcattaatgatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatcattaatg3';
no.17:5'pcataggtaatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagattacctatg3';
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no.22:5'pcatgcattatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagataatgcatg3';
no.23:5'pcatgatctatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatagatcatg3';
no.24:5'pcatcaataatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagattattgatg3';
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no.27:5'pcatcaattatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagataattgatg3';
no.28:5'pcatagataatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagattatctatg3';
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no.96:5'pcatcgcagatctctctcttttcctcctcctccgttgttgttgttgagagagatctgcgatg3'。
本發(fā)明帶標(biāo)簽接頭每一條序列由5’端和3’端8對互補堿基組成具有唯一性標(biāo)簽,中間45個堿基為pacbio測序平臺通用接頭序列,該序列包含與測序引物結(jié)合的序列。
本發(fā)明還提供了一種利用帶標(biāo)簽接頭構(gòu)建單分子測序文庫的模板方法,包括如下步驟:
(1)將打斷后已進行末端補平的dna樣本作為起始樣本;
(2)對每一個樣本,從96條且未被選擇過的帶標(biāo)簽接頭序列中選擇任意一條序列作為該樣本接頭;
(3)對各個樣本及其對應(yīng)接頭進行連接反應(yīng);
(4)將所有樣本等量混合建立一個測序文庫模板。
步驟(1)所述起始樣本為經(jīng)打斷后已進行末端補平的dna樣本,該dna樣本可以是但不局限于病毒基因組、bac基因組文庫、yac基因組文庫、質(zhì)粒等為幾kb到幾百mb長度的待測dna樣本。
步驟(2)中對每一個樣本,從no.1~no.96所示96條帶標(biāo)簽接頭序列中選擇任一序列作為連接接頭,其選擇原則為:確定每一起始樣本編號,對每一個編號樣本,從no.1~no.96中選擇一條序列,確定每一個樣本的標(biāo)簽序列;每個編號的樣本可選no.1~no.96中的任何一對,但不同編號的樣本不能選擇同一帶標(biāo)簽接頭。
利用本發(fā)明提供的帶標(biāo)簽接頭可以將96個打斷后已進行末端補平的dna樣本分別連接不同的帶標(biāo)簽接頭,然后等量混合成為一個測序文庫模板,用于進行后續(xù)建庫和測序,大大節(jié)約了建庫和測序成本,提高了建庫和測序效率。
步驟(3)所述連接反應(yīng),反應(yīng)體系為:
總反應(yīng)體系為20μl
步驟(3)所述連接反應(yīng)其反應(yīng)體系中的t4dna連接酶和t4dna連接酶緩沖液可以是takara公司產(chǎn)品,當(dāng)然也可以是其他公司同類產(chǎn)品。
步驟(3)所述連接反應(yīng),反應(yīng)條件為:22℃連接30min,65℃,5min終止反應(yīng)。
步驟(4)所述將所有樣本等量混合建立一個測序文庫模板,可采用quibit2.0進行濃度測定,并將所有樣本進行等量混合,當(dāng)然也可以采用q-pcr等其他手段進行濃度測定后等量混合。
本發(fā)明利用帶標(biāo)簽接頭構(gòu)建單分子測序文庫模板,可以一次性將96個打斷后經(jīng)dna末端補平的不同dna樣本進行混合,用于后續(xù)建庫和測序,大大節(jié)約了試劑耗材成本,提高了單個測序反應(yīng)的樣本通量。與pacbio公司提供的帶標(biāo)簽接頭相比,可以達到同樣的連接效率,但試劑成本大大降低。本發(fā)明帶標(biāo)簽接頭可用于所有基于pacbio單分子測序平臺dna文庫構(gòu)建。
附圖說明
圖1是7個樣本的混合測序結(jié)果總覽。
具體實施方式
為進一步闡述本發(fā)明目的、技術(shù)方案和優(yōu)點,下面結(jié)合本發(fā)明的優(yōu)選實施例對本說明進行詳細的闡述,但本發(fā)明并非局限于本實施例范圍內(nèi)。
實施例中未注明具體技術(shù)條件的,按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻或產(chǎn)品說明書所描述的技術(shù)條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商的,均為本領(lǐng)域常規(guī)產(chǎn)品。
實施例1
將打斷后已進行末端補平的dna樣本作為起始樣本:
皰疹病毒為雙鏈dna病毒,大小約為140kb,將打斷為3-10kb經(jīng)過末端補平的7株皰疹病毒dna作為構(gòu)建測序文庫的起始樣本。
實施例2
以上述7個樣本為例實施
將7個樣本依次編號為1至7,從no.1~no.96條帶標(biāo)簽接頭序列中各自選取一條序列作為該樣本接頭序列,制作樣本與接頭對應(yīng)表
實施例3
對上述7個樣本及其對應(yīng)接頭進行連接反應(yīng)
連接反應(yīng)體系為:
總反應(yīng)體系為20μl
連接反應(yīng)條件為:22℃連接30min,65℃,5min終止反應(yīng)。
實施例4
將所有樣本等量混合建立一個測序文庫模板
將連接后的7個樣本各取10μl,轉(zhuǎn)移至一個新的0.2μl離心管得到用于后續(xù)繼續(xù)建庫測序用的含有7個樣本的混合測序文庫模板,直接用于下一步建庫測序或置于-20℃冰箱備用。
sequencelisting
<110>哈爾濱博泰生物科技有限公司
<120>用于單分子測序文庫模板構(gòu)建的帶標(biāo)簽接頭及其應(yīng)用
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