本發(fā)明涉及一種金線蓮莖腐病菌分子檢測(cè)引物及其檢測(cè)方法，專用于金線蓮莖腐病菌高靈敏度快速分子檢測(cè)，克服了傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法繁雜且準(zhǔn)確性低的缺點(diǎn)，屬于農(nóng)作物病害檢測(cè)、鑒定及防治技術(shù)的領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

金線蓮又稱金線蘭，蘭科開唇蘭等，屬多年生草本植物，珍稀民間中草藥，素有“藥王”“金草”“神藥”等美稱，具有清熱退火、滋養(yǎng)強(qiáng)壯、潤(rùn)肺保肝及消腫解毒等功效，已廣泛應(yīng)用于高血壓、糖尿病、腎病、腫瘤等的治療和保健等方面。野生金線蓮對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻，繁殖率低，生長(zhǎng)緩慢，且由于其獨(dú)有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，致使人工過度采挖，已面臨滅絕的境地。目前金線蓮主要通過人工栽培，但在栽培過程中病害問題也日漸突顯。

最近，在福建省多個(gè)金線蓮種植地出現(xiàn)了莖腐病病樣，該病對(duì)金線蓮不同生長(zhǎng)期皆可造成危害，發(fā)病時(shí)植株莖基部先出現(xiàn)黃褐色水漬狀病斑，病斑擴(kuò)大至繞莖周，病部組織腐爛干枯縊縮呈線狀。該病蔓延迅速，病情越來越嚴(yán)重，幼苗迅速倒伏死亡，出現(xiàn)大面積猝倒，嚴(yán)重威脅金線蓮的健康生產(chǎn)。通過對(duì)病樣采集、病菌分離鑒定，柯赫氏法則驗(yàn)證，最終確定金線蓮莖腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

目前對(duì)金線蓮莖腐病的鑒定大多仍沿用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法。傳統(tǒng)的病原菌鑒定技術(shù)是在分離培養(yǎng)獲得相應(yīng)病原物的基礎(chǔ)上，通過形態(tài)學(xué)觀察和柯赫氏法則來判斷病原物的種類。整個(gè)過程常常需要耗費(fèi)大量的勞動(dòng)力和時(shí)間，一般需要幾天才能完成，而且要求操作者具備專業(yè)的病原菌分離、形態(tài)學(xué)鑒定知識(shí)和豐富的經(jīng)驗(yàn)，因此以病原菌形態(tài)學(xué)特征為判斷基礎(chǔ)的傳統(tǒng)病原菌診斷方法，因其耗時(shí)長(zhǎng)，效率低，難以滿足對(duì)金線蓮莖腐病診斷的實(shí)際需要，因其很容易錯(cuò)過病害防治的最佳時(shí)期。

近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以PCR技術(shù)為代表的分子檢測(cè)方法得到了迅速的發(fā)展和應(yīng)用，尤其是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的應(yīng)用在很大程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的不足。這類方法普遍具有快速、準(zhǔn)確、靈敏且不需要進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)的特點(diǎn)，在控制植物病害的傳播、成災(zāi)中已經(jīng)開始發(fā)揮重要作用。因此，建立一套快速、靈敏、準(zhǔn)確的金線蓮莖腐病菌檢測(cè)診斷技術(shù)不僅非常必要，而且十分迫切。

核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列是由交替的保守區(qū)和可變區(qū)組成，在微生物基因組中以多拷貝出現(xiàn)，具有種的特異性，因此該序列成為在種的水平鑒定病原菌極好的目標(biāo)。為此，我們利用真菌通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增金線蓮莖腐病菌的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)并進(jìn)行克隆測(cè)序，通過序列比對(duì)，設(shè)計(jì)出一對(duì)金線蓮莖腐病菌特異性引物，建立金線蓮莖腐病菌快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的監(jiān)測(cè)技術(shù)體系。此技術(shù)可應(yīng)用于金線蓮莖腐病菌引起病害顯癥之前的早期監(jiān)測(cè)，對(duì)于確定病害防治最佳時(shí)期具有重要的作用，為防治策略的制定提供科學(xué)依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中金線蓮莖腐病菌傳統(tǒng)檢測(cè)方法對(duì)操作者的實(shí)驗(yàn)技能和實(shí)際經(jīng)驗(yàn)有很高的要求，且十分耗時(shí)，無法達(dá)到快速檢驗(yàn)的問題，提供金線蓮莖腐病菌的特異分子檢測(cè)引物以及結(jié)果可靠、易于操作、特異性強(qiáng)、靈敏度高的金線蓮莖腐病菌的快速分子檢測(cè)體系和程序。該方法可用于金線蓮莖腐病菌引起病害顯癥之前的早期監(jiān)測(cè)，對(duì)確定病害防治最佳時(shí)期具有十分重要的意義。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

1．根據(jù)金線蓮莖腐病菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列由交替的保守區(qū)和可變區(qū)組成的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了對(duì)金線蓮莖腐病菌具有特異擴(kuò)增作用的一對(duì)PCR引物，序列如下：

ITS403f：5’-CCCAACCCCTGTGACATAC-3’；

ITS403r：5’-ATTACCAGTAACGAGGGTT-3’。

2． 金線蓮莖腐病菌快速檢測(cè)體系的建立

（1）金線蓮莖腐病菌特異PCR快速檢測(cè)體系的建立

所述PCR反應(yīng)體系25.0 μl，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，58℃退火30sec ，72℃延伸1min，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

（2）金線蓮莖腐病菌巢式PCR快速檢測(cè)體系的建立

以真菌通用引物（ITS1/ ITS4）進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25.0 μL，包括2×TaqPCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L的引物（（ITS1/ ITS4）各0.2 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，55℃退火30 sec ，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

分別取1 μL第一輪PCR產(chǎn)物做為DNA模板，用引物(ITS403f / ITS403r)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系25.0 μl，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL，25ng DNA模板1 μL，不足部分由dd H₂O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，58℃退火30sec ，72℃延伸1min，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

本發(fā)明的關(guān)鍵性技術(shù)是金線蓮莖腐病菌的高效特異擴(kuò)增的引物序列及其擴(kuò)增方法。為了檢測(cè)金線蓮莖腐病菌特異引物準(zhǔn)確性，本發(fā)明以我國(guó)福建、浙江、江西、臺(tái)灣等省的18株金線蓮莖腐病菌和其它25種真菌為供試材料，采用CTAB法提取供試菌株基因組DNA，具體方法如下：

取50mg 冷凍干燥后的菌絲粉于1.5ml離心管中，加入900μl 2% CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取液（2% CTAB；100 m mol/L Tris-HCl, PH 8.0；20mmol/L EDTA,pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90μl 10% SDS（十二烷基苯磺酸鈉）后振蕩混勻，于55～60℃水浴1.5 h，每10 min顛倒混勻一次,水浴1.5h后離心（12,000rpm）8min，取上清液加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（體積比25:24:1），顛倒使充分混勻，12,000rpm離心12 min，取上清液（水相），加入等體積氯仿/異戊醇(體積比24:1)，顛倒使充分混勻，12,000rpm離心5min，吸上清，加0.1體積的3mol/L NaAC溶液和2倍體積的冰無水乙醇, 置-20℃冰箱中沉淀30 min以上，12,000rpm離心5 min，輕輕地倒去上清液，加入700μl冰70%乙醇進(jìn)行洗滌（稍離心，傾掉上清），在超凈工作臺(tái)上自然晾干無酒精味后用1×TE（10mmol/LTris-HCL,0.1mmol/LEDTA,pH8.0）溶液進(jìn)行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度并稀釋至25ng/μL待用。

經(jīng)對(duì)供試25種真菌和18株金線蓮莖腐病菌的特異性進(jìn)行PCR驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系25.0μL，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，58℃退火30sec ，72℃延伸1min，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。此特異引物在金線蓮莖腐病菌中特異性地?cái)U(kuò)增出403bp的產(chǎn)物。這說明該引物可被用于發(fā)病植株中金線蓮莖腐病菌快速可靠的檢測(cè)和鑒定。

本發(fā)明有益效果：本發(fā)明方法適用于植株中金線蓮莖腐病菌的快速可靠的檢測(cè)和鑒定，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中金線蓮莖腐病菌引起的病害防治具有重要的實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和積極效果：

1、特異性強(qiáng)：本發(fā)明檢測(cè)方法是根據(jù)ITS序列由交替的保守區(qū)和可變區(qū)組成的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一對(duì)金線蓮莖腐病菌特異引物進(jìn)行檢測(cè)。已經(jīng)對(duì)來自我國(guó)福建、浙江、江西、臺(tái)灣等省的金線蓮莖腐病菌和其它25種不同真菌進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果具有很強(qiáng)的特異性。

2、靈敏度高：巢式PCR對(duì)金線蓮莖腐病菌的檢測(cè)靈敏度在DNA水平上可達(dá)到10fg/25 μL，具有很高的靈敏性。

3、實(shí)用性好：本發(fā)明所設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，可用于金線蓮莖腐病菌的高靈敏度快速檢測(cè)，因此本方法的實(shí)用性強(qiáng)，可滿足金線蓮莖腐病菌進(jìn)行快速可靠的檢測(cè)和鑒定的需要。

4、操作簡(jiǎn)便快速：應(yīng)用本發(fā)明方法，對(duì)帶金線蓮莖腐病菌的植株進(jìn)行病菌DNA提取、PCR擴(kuò)增和常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳后即可判定結(jié)果，無需對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，整個(gè)檢測(cè)過程可在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所要檢測(cè)的金線蓮莖腐病菌的特異PCR擴(kuò)增圖

圖中：M為DL2000 DNA Marker；1為陰性對(duì)照；2-5為尖孢鐮刀菌；6：黃色鐮刀菌；7：燕麥鐮刀菌；8：雪腐鐮刀菌；9：禾谷鐮刀菌；10：炭疽病菌。

圖2為本發(fā)明金線蓮莖腐病菌的靈敏性檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果圖

圖中：M為DL2000 DNA Marker ；1為陰性對(duì)照；2-9分別為1 ng/μL，

100pg/μL，10 pg/μL，1 pg/μL，100 fg/μL，10 fg/μL，1 fg/μL，100 ag/μL的不同濃度金線蓮莖腐病菌DNA。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容包括金線蓮莖腐病菌的特異檢測(cè)引物，所設(shè)計(jì)的引物及其序列為（ITS403f：5’-CCCAACCCCTGTGACATAC-3’和ITS403r：5’-ATTACCAGTAACGAGGGTT-3’）。利用該引物可從金線蓮莖腐病菌中特異擴(kuò)增出403bp的產(chǎn)物。

實(shí)施例1：引物對(duì)金線蓮莖腐病菌的特異性擴(kuò)增

1．金線蓮莖腐病菌的特異檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系25.0 μl，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，58℃退火30sec ，72℃延伸1min，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2．檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)的特異性：除了來自我國(guó)福建、浙江、江西、臺(tái)灣等省等省的金線蓮莖腐病菌DNA可特異地?cái)U(kuò)增出403bp的產(chǎn)物外，檢測(cè)了25種其他真菌DNA均未能擴(kuò)增出任何產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的特異性。

實(shí)施例2：引物對(duì)金線蓮莖腐病菌的靈敏度檢測(cè)

1．DNA濃度稀釋：提取的金線蓮莖腐病菌基因組DNA，經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，采用系列濃度稀釋。

2．金線蓮莖腐病菌的靈敏度檢測(cè)

采用10倍濃度系列稀釋法將提取的金線蓮莖腐病菌DNA依次稀釋成，1 ng/μL，100 pg/μL，10 pg/μL，1 pg/μL，100 fg/μL，10 fg/μL，1 fg/μL，100 ag/μL共8個(gè)不同濃度梯度，采用巢式PCR對(duì)引物的靈敏度進(jìn)行測(cè)定。

分別取1μL不同濃度的金線蓮莖腐病菌基因組DNA為模板，以真菌通用引物（ITS1/ITS4）進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25.0 μL，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物（（ITS1/ ITS4）各0.2 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O補(bǔ)足。

PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，55℃退火30 sec ，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。分別取1 μL第一輪PCR產(chǎn)物做為DNA模板，用引物(ITS403f / ITS403r)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系25.0 μl，包括2×Taq PCR Master Mix12.5μL，10 μmol/L 的引物(ITS403f / ITS403r)各0.5 μL， DNA模板25ng，不足部分由dd H₂O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，58℃退火30sec ，72℃延伸1min，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

3．檢測(cè)結(jié)果：

在25.0μL反應(yīng)體系中，金線蓮莖腐病菌基因組DNA可獲得明顯擴(kuò)增條帶，檢測(cè)靈敏度可達(dá)10 fg/25μL。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120> 一種金線蓮莖腐病菌分子檢測(cè)引物及其檢測(cè)方法

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccaacccct gtgacatac 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

attaccagta acgagggtt 19