本發(fā)明涉及一種植物葉片DNA提取方法。
背景技術(shù)：
DNA提取是實(shí)驗(yàn)室最常見的分子操作之一，尤其是在植物育種的大規(guī)模分子標(biāo)記鑒定工作中，往往需要提取成千上萬(wàn)份材料的DNA，采用傳統(tǒng)的提取方法會(huì)存在效率偏低的問(wèn)題；而先進(jìn)的儀器提取需要購(gòu)買試劑盒等配套耗材試劑，成本較高；普通的快速提取技術(shù)雖然大大簡(jiǎn)化了提取過(guò)程，但是對(duì)于前期的研磨過(guò)程基本依賴儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)室硬件條件提出了要求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是通過(guò)簡(jiǎn)化研磨條件，調(diào)整試劑配比，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟，進(jìn)而提供一種極其簡(jiǎn)易且高效的植物葉片DNA提取方法，該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求非常低，所用儀器、試劑極其簡(jiǎn)單，且操作簡(jiǎn)便，效果好，適用于番茄、黃瓜葉片的快速提取，尤其適用于不同樣品的大規(guī)模提取。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種植物葉片DNA簡(jiǎn)化快速提取方法，包括如下步驟：
一、取樣
將鮮嫩的植物葉片0.1～0.2g置于1.5mL離心管中。
二、研磨
取石英砂于裝有葉片樣本的離心管中，加入200～400μl、0.4MNaOH溶液，用滅過(guò)菌的1000μl移液器槍頭直接進(jìn)行研磨，磨至無(wú)明顯葉塊為止，蓋好管蓋并用封口膜封口，以防止沸水浴時(shí)管蓋被蒸汽頂開。
三、沸水浴
將研磨后封好的離心管置于沸水浴中0.5～1.5min。
四、離心
將離心管置于離心機(jī)中常溫離心。
五、獲取DNA
吸取30～50μl上清液，加入到新的離心管中，同時(shí)按上清液與緩沖液體積比為1:9的比例添加0.1MTris-cl緩沖液(pH8.0)。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
1、所用藥品簡(jiǎn)單。只有石英砂、NaOH和Tris-cl三種實(shí)驗(yàn)室常規(guī)藥品，使用起來(lái)安全可靠。
2、所用儀器簡(jiǎn)單。只用到電磁爐(或其它加熱設(shè)備)和普通離心機(jī)，一般實(shí)驗(yàn)室均可滿足。
3、研磨過(guò)程優(yōu)化。本方法中利用石英砂直接在堿液中研磨，既降低了研磨所需條件(如液氮研磨和研磨機(jī)研磨需要使用液氮或相應(yīng)儀器設(shè)備)，又提高了DNA析出效率，一舉兩得。
4、操作簡(jiǎn)便。操作過(guò)程非常簡(jiǎn)單快捷，一個(gè)實(shí)驗(yàn)人員每小時(shí)可提取100個(gè)樣品左右。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明與CTAB方法提取DNA的擴(kuò)增結(jié)果。
具體實(shí)施方式
下面本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此，凡是對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式提供了一種植物葉片DNA簡(jiǎn)化快速提取方法，具體操作步驟如下：
一、取樣
鮮嫩的番茄或黃瓜葉片0.1～0.2g，直接置于1.5mL離心管中，標(biāo)記好樣品名稱或編號(hào)。48小時(shí)內(nèi)提取可于4℃保存，48小時(shí)以后提取置于-20℃保存，且不要反復(fù)凍融。
二、研磨
取適量石英砂(由于不同批次樣品品質(zhì)不同，可以預(yù)先研磨1～2個(gè)，以手感便于磨碎樣品為準(zhǔn)，用量不做嚴(yán)格要求，但要保證每個(gè)樣品添加量基本一致，方便后續(xù)離心)于裝有葉片樣本的離心管中，加入300μl、0.4M NaOH溶液，用滅過(guò)菌的1000μl移液器槍頭直接進(jìn)行研磨，磨至無(wú)明顯葉塊為止，蓋好管蓋，并用封口膜在管蓋和管口接觸處纏繞兩圈做安全封(防止水浴時(shí)管蓋被蒸汽頂開)。試驗(yàn)過(guò)程中注意樣品總重量配平。
三、沸水浴
事先用電磁爐等加熱設(shè)備將水加熱至沸騰，將研磨后封好的樣品插在浮漂上，置于水面上水浴1min，及時(shí)撈起。
四、離心
將管壁的水擦干或晾干，置于離心機(jī)中在8000rpm的轉(zhuǎn)速下常溫離心3min，小心取出。
五、獲取DNA
小心吸取50μl上清液，加入到新的離心管中，同時(shí)加入450μl、0.1MTris-cl緩沖液(pH8.0)，寫好名稱或編號(hào)(常規(guī)PCR20微升體系可取3微升作為模板)。
本實(shí)施方式的方法為微量提取技術(shù)，按照本實(shí)施方式方法提取的DNA樣品電泳檢測(cè)無(wú)條帶，可采用常規(guī)PCR檢測(cè)。
本實(shí)施方式中，藥品成分及配比如下：
NaOH溶液：分析純NaOH固體，ddH2O，終濃度為0.4M。
Tris-cl緩沖液：分析純Tris-cl粉末，ddH2O，終濃度為0.1M。
具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式以番茄Ty-2基因的鑒定標(biāo)記擴(kuò)增為例，對(duì)比本發(fā)明與傳統(tǒng)CTAB提取方法的實(shí)驗(yàn)效果。
CTAB法提取過(guò)程：
(1)用無(wú)菌槍頭將液氮中速凍好的葉片研磨成粉末，磨好后迅速加入700μL在65℃水浴中預(yù)熱的CTAB溶液，蓋好蓋子充分混勻。
(2)將混勻的樣品置于65℃水浴1h，水浴過(guò)程中每隔幾分鐘將樣品上下翻動(dòng)，使其受熱均勻，并使組織樣本與溶液充分接觸。
(3)水浴結(jié)束后，將樣品取出在室溫下冷卻，冷卻后加入700μL氯仿：異戊醇(24:1)混合液，混勻后靜置10min。
(4)靜置后的樣品置于離心機(jī)中18℃下13000rpm離心10min，取上清液400mL，置于新的EP管中，加入等體積的氯仿：異戊醇(24:1)混合液，充分混勻后室溫下靜置10min。
(5)靜置后的樣品置于離心機(jī)中18℃下13000rpm離心10min，取上清液400mL，置于新的EP管中，加入等體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，上下翻轉(zhuǎn)EP管，輕輕混勻。于-20℃冰箱內(nèi)靜置20min。
(6)將靜置后的樣品取出，置于離心機(jī)中4℃下12000rpm離心10min，棄去上清液，用500μL的80％乙醇將沉淀洗滌2次，置于超凈工作臺(tái)中室溫吹干。
(7)在EP管中加入300μL無(wú)菌水溶解DNA，溶解后加入4μL濃度為10mg/mL的RNase A，37℃水浴1h。
(8)水浴后再加入300μL ddH2O，充分混勻后，加入600μL的氯仿：異戊醇(24:1)混合液，充分混勻后靜置10min。
(9)4℃下12000rpm離心10min，小心吸取上清液400mL，加入80μL在-20℃下預(yù)冷的NaAc，輕輕混勻，混勻后在-20℃下靜置20min。
(10)4℃下12000rpm離心10min，棄去上清液。用200μL的80％乙醇將沉淀洗滌2～3次，洗滌后在超凈工作臺(tái)吹干。
(11)在干燥好的DNA沉淀中加入20～40μL無(wú)菌去離子水溶解DNA。
本發(fā)明提取過(guò)程：見具體實(shí)施方式一。
PCR體系及反應(yīng)條件設(shè)置見表1和表2：
表1反應(yīng)體系
表2反應(yīng)程序
擴(kuò)增在以上PCR體系及反應(yīng)條件下進(jìn)行，選擇性擴(kuò)增完成后，取5μl預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物和1μl Loading Buffer混合后在0.8％瓊脂糖膠中檢測(cè)選擇性擴(kuò)增結(jié)果。
擴(kuò)增結(jié)果見圖1。擴(kuò)增結(jié)果顯示，按照本發(fā)明方法提取的DNA擴(kuò)增效果與CTAB方法提取DNA的擴(kuò)增效果基本一致，擴(kuò)增條帶清晰，亮度較高，符合檢測(cè)用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。