本發(fā)明涉及分子標記鑒定領域，具體涉及一種利用特定引物組鑒別口蝦蛄的南方群體和北方群體的方法。
背景技術：
口蝦蛄屬于蝦蛄科下的口蝦蛄屬，為我國重要的經濟種類。中國沿海的口蝦蛄種群因地理、海流等因素在長江入?？谔幐綦x為南方群體和北方群體兩個種群，其外部形態(tài)特征十分相似，因而無法從外部形態(tài)上準確區(qū)分這兩個種群。
分子遺傳標記可快速、高效和靈敏地檢測出基因組DNA的多態(tài)性，是當前用于分析水產生物種質鑒定與群體遺傳特性的主要標記。利用電泳圖譜分析技術，以條帶的擴增情況來反映物種的特異遺傳信息，操作方法簡單、結果分析方便。
中國專利CN1680601A，專利名稱中國明對蝦微衛(wèi)星三重PCR家系識別技術，公告日期2009年7月8日，公開了一種利用三個引物RS1101、RS0683、H081組成的PCR技術對中國明對蝦家系進行識別的方法，三個引物對應的堿基序列分別為：RS1101的正向序列CGAGTGGCAGCGAGTCCT，反向序列TATTCCCACGCTCTTGTC；RS0683的正向序列為ACACTCACTTATGTCACACTGC，反向序列為TACACACCAACACTCAATCTCC；H081的正向序列為ACAAACACATTCTGTCCATT，反向序列為GATAGAGAGGTCAACAAACG。利用此三重PCR技術，經過常規(guī)PCR擴增一次性獲得三個微衛(wèi)星位點上的中國明對蝦個體的遺傳信息，進而通過這些不同個體間顯示的這種遺傳信息的差異來對它們進行區(qū)分和識別。但是該三重PCR家系識別技術作為對中國明對蝦家系的特定識別，無法有效鑒別開口蝦蛄的南方群體和北方群體。
技術實現要素：
針對無法通過外部形態(tài)準確區(qū)分口蝦蛄的南方群體和北方群體，而上述專利中的中國明對蝦微衛(wèi)星三重PCR家系識別技術也無法有效鑒別口蝦蛄的南方群體和北方群體的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種特定的引物組并利用該特定引物組通過合適的PCR擴增途徑擴增鑒別上述兩類口蝦蛄種群的方法。
本發(fā)明提供如下的技術方案：
一種利用特定引物組鑒別兩類口蝦蛄種群的方法，所述兩類口蝦蛄種群包括生活在長江入海口以南中國沿海海域的南方群體、生活在長江入?？谝员敝袊睾：Ｓ虻谋狈饺后w，所述特定引物組由一條正向引物CR1和兩條反向引物CR2、CR3組成，對應的堿基序列分別為：
CR1：TCAAATAGAAAACAAATAGCCAG；
CR2：CATAATTTATCCTATCAAGATAATC；
CR3：GATTATCTTGATAGGATAAATTATG。
作為本發(fā)明的優(yōu)選，利用特定引物組鑒別兩類口蝦蛄種群的方法包括以下步驟：
（1）利用南方群體的或北方群體的口蝦蛄個體樣品制備樣本DNA；
（2）將包含樣本DNA和特定引物組的PCR擴增體系進行PCR擴增；
（3）將PCR擴增產物電泳檢測并通過凝膠成像系統拍照、記錄，對電泳結果判定。
作為本發(fā)明的優(yōu)選，通過以下方法判定電泳結果：PCR擴增產物只在近500 bp處出現一條特異亮帶的為南方群體，PCR擴增產物分別在近300 bp和近500 bp處各出現一條特異亮帶的為北方群體。
作為本發(fā)明的優(yōu)選，樣本DNA由經苯酚/氯仿抽提法從口蝦蛄個體樣品的50～100 mg的背部肌肉中提取的基因組DNA溶于100(l雙蒸水中制得。
作為本發(fā)明的優(yōu)選，PCR擴增體系的體積為25 (l，其組成分別為：10×buffer 2.5 (L、濃度為2.5 mmol/L的dNTP 2 (L、濃度為10 (mol/L的CR1 1.5 (l、濃度為10 (mol/L的CR2 1.3 (l、濃度為10 (mol/L的CR3 0.2 (l、濃度為5 U/(l 的Taq酶0.2 (l、樣本DNA 2 (l、余量為H2O。
作為本發(fā)明的優(yōu)選，PCR擴增的反應條件為：將PCR擴增體系置于PCR儀中在94 ℃下保溫3 min進行預變性，然后經40個溫度循環(huán)處理，然后72 ℃下保持10 min，其中每個溫度循環(huán)包括：94 ℃保持45 s、50 ℃保持45 s、72 ℃保持45 s。
作為本發(fā)明的優(yōu)選，電泳檢測條件為：瓊脂糖凝膠質量濃度為1.5%、電泳電壓140V、電泳時間20 min。
本發(fā)明的一種利用特定引物組鑒別兩類口蝦蛄種群的方法基于分子生物學原理，根據口蝦蛄的南方群體和北方群體的基因組DNA的序列差異設計三條特異引物：正向引物CR1、反向引物CR2和反向引物CR3，并利用特異引物對南方群體與北方群體的基因組DNA進行PCR擴增，PCR擴增產物經過凝膠電泳檢測所得的電泳譜圖顯示：口蝦蛄的南方群體的PCR擴增產物僅在近500 bp處出現一條特異亮帶，而北方群體的PCR擴增產物在近300 bp和近500 bp處分別出現一條特異亮帶，從而準確、簡單、快捷的區(qū)分兩類口蝦蛄種群。
本發(fā)明的有益效果如下：
本發(fā)明設計特定引物組對兩類口蝦蛄種群的樣本DNA進行PCR擴增并電泳檢測，利用電泳譜圖中出現的明顯差異可以準確的區(qū)分口蝦蛄的南方群體和北方群體，而且具有準確、靈敏、操作簡單、快速、高效的優(yōu)點。
附圖說明
圖1是兩類口蝦蛄種群的基因組DNA經特定引物組PCR擴增后的PCR擴增產物的電泳譜圖。
圖中口蝦蛄的北方群體的PCR擴增產物在近300 bp和近500 bp處各出現一條特異亮帶，南方群體的PCR擴增產物在近500 bp處出現一條特異亮帶。
具體實施方式
下面就本發(fā)明的具體實施方式作進一步說明：
實施例1
一種利用特定引物組鑒別兩類口蝦蛄種群的方法，兩類口蝦蛄種群包括生活在長江入海口以南中國沿海海域的南方群體，例如舟山群島海域或鎮(zhèn)江海域的口蝦蛄種群，生活在長江入?？谝员敝袊睾：Ｓ虻谋狈饺后w，例如連云港海域或大連海域的口蝦蛄種群，特定引物組由一條正向引物CR1和兩條反向引物CR2、CR3組成，對應的堿基序列分別為：
CR1：TCAAATAGAAAACAAATAGCCAG；
CR2：CATAATTTATCCTATCAAGATAATC；
CR3：GATTATCTTGATAGGATAAATTATG。
該利用特定引物組鑒別兩類口蝦蛄種群的方法包括以下優(yōu)選步驟：
（1）提取基因組DNA：利用口蝦蛄的南方群體或北方群體的口蝦蛄個體樣品制備樣本DNA，優(yōu)選將口蝦蛄個體樣品的50～100 mg背部肌肉經苯酚/氯仿提取法提取基因組DNA，并將提取后的基因組DNA溶于100 (l雙蒸水中制得樣本DNA。
（2）PCR擴增：將包含樣本DNA和特定引物組的PCR擴增體系進行PCR擴增，制取樣本DNA的PCR擴增產物，其中PCR擴增體系的體積為25 (l，其組成優(yōu)選為：10×buffer 2.5 (L、濃度為2.5 mmol/L的dNTP 2 (L、濃度為10 (mol/L的CR1 1.5 (l、濃度為10 (mol/L的CR2 1.3 (l、濃度為10 (mol/L的CR3 0.2 (l、濃度為5 U/(l 的Taq酶0.2 (l、樣本DNA 2 (l、余量為H2O。PCR擴增的反應條件為：將PCR擴增體系置于PCR儀中在94 ℃下保溫3 min進行預變性，然后經40個溫度循環(huán)處理，然后72 ℃下保持10 min，其中每個溫度循環(huán)包括：94 ℃保持45 s、50 ℃保持45 s、72 ℃保持45 s。
（3）電泳檢測：將PCR擴增產物置于瓊脂糖凝膠質量濃度為1.5%的TBE溶液中進行電泳試驗，電泳電壓為140V，電泳時間為20 min。利用凝膠成像系統對電泳結果拍照、記錄并讀帶，對電泳結果進行判定。
對電泳譜圖的結果的判定依據如下：如圖1所示，當PCR擴增產物的電泳譜圖僅在近500 bp處出現一條特異亮條帶時為口蝦蛄的南方群體；當PCR擴增產物的電泳譜圖分別在近300 bp和近500 bp處各出現一條特異亮條帶時口蝦蛄的北方群體。
本發(fā)明采用特定引物組擴增兩類口蝦蛄種群的基因組DNA，凝膠電泳檢測的電泳譜圖顯示出清晰的條帶差異，可準確、簡便的區(qū)分口蝦蛄的南方群體和北方群體。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋大學
<120> 一種利用特定引物組鑒別兩類口蝦蛄種群的方法
<130> JWE163558
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcaaatagaa aacaaatagc cag 23
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cataatttat cctatcaaga taatc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gattatcttg ataggataaa ttatg 25