本發(fā)明涉及桑黃，特別涉及一種桑黃工廠化液體發(fā)酵過程中酶活規(guī)律的測定方法。

（二）

背景技術(shù)：

藥用真菌桑黃具有抗癌、抗氧化、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)、抗炎、降血脂和抗病毒等作用 ，在傳統(tǒng)中藥中，其被用于治療傷口、腹痛和淋病。最近的研究強(qiáng)調(diào)了其抗癌和肝臟保護(hù)功能。其含有三萜、黃酮、多糖等活性成分。

當(dāng)前，桑黃產(chǎn)品大部分依賴于桑黃子實體，桑黃子實體生長對環(huán)境的依賴性很高，生長周期長，產(chǎn)量不穩(wěn)定。利用液體培養(yǎng)可以較容易地對各種生長影響因素進(jìn)行控制和優(yōu)化，獲得穩(wěn)定高產(chǎn)。

本研究旨在利用成本較低的農(nóng)產(chǎn)品下腳料和礦物質(zhì)成分，對它們進(jìn)行適宜的配比，利用合適的方法進(jìn)行煮制，來獲得桑黃液體培養(yǎng)產(chǎn)物（菌絲體及活性物質(zhì)產(chǎn)量）的高產(chǎn)。在進(jìn)行液體培養(yǎng)的過程中進(jìn)行酶活的跟蹤測定，了解多種酶活的產(chǎn)生規(guī)律，有研究報道的桑黃酶活產(chǎn)生規(guī)律，是基于少量實驗室液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的前提下獲得的，該規(guī)律是在工廠發(fā)酵罐中進(jìn)行小試時獲得的，更具有生產(chǎn)實用性。該規(guī)律的把握可以有效指導(dǎo)控制培養(yǎng)基成分的靈活添加，對于桑黃的擴(kuò)大生產(chǎn)及工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

（三）

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，為了獲得穩(wěn)定的液體發(fā)酵高產(chǎn)，同時降低成本，本專利進(jìn)行了桑黃液體發(fā)酵過程中酶活規(guī)律的研究。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種桑黃培養(yǎng)過程中酶的測定方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）配制培養(yǎng)基：

培養(yǎng)基由以下重量的原料制成：麥麩6-8%，玉米粉2-4%，蛋白胨1-3%，MgSO₄·7H₂O 0.05-0.15%，KH₂PO₄ 0.10-0.15%，K₂HPO₄·3H₂O 0.02-0.04%，其余為水，

配制方法：麥麩放入足量的水中，煮沸45-55min，四層紗布過濾，向濾液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄和K₂HPO₄·3H₂O ，調(diào)pH值為6，配制6L培養(yǎng)基；

（2）裝罐：將培養(yǎng)基裝入10L的發(fā)酵罐；

（3）滅菌：在攪拌狀態(tài)下，夾層蒸汽加熱到105-115℃；關(guān)閉攪拌，改為直接進(jìn)蒸汽升溫至119℃—124℃，壓力0.1±0.05Mpa，保溫滅菌；

（4）接種：火焰圈保護(hù)接種，向滅菌后的培養(yǎng)基中接入處于迅速生長期的培養(yǎng)8d的桑黃液體菌種；

（5）培養(yǎng)：T為28±0.5℃；罐壓為0.05±0.005Mpa；空氣流量：0-92h，0.20m3/h,93-358h,0.30m3/h，359-422h，0.20m3/h階段性調(diào)節(jié)；攪拌：0-62h，20Hz，63-160h，30Hz，161-332h，20Hz，333-422h，10Hz，

取樣對培養(yǎng)基中的多種酶活進(jìn)行測定。

取樣分別對培養(yǎng)液的淀粉酶、羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、漆酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚酶活性進(jìn)行測定，測定方法如下：

淀粉酶活性測定：可溶性淀粉溶液中加入粗酶液，32-45℃水浴準(zhǔn)確保溫，取出后加入配制的DNS試劑，沸水浴加熱，取出冷卻后加入蒸餾水，混勻，通過紫外可見分光光度計測520nm處的OD值；

羧甲基纖維素酶活性測定：羧甲基纖維素鈉溶液中加入粗酶液，42-55℃水浴保溫，取出后加入配制的DNS試劑，沸水浴加熱，取出冷卻后加入蒸餾水，混勻，紫外可見分光光度計測520nm處的OD值；

半纖維素酶活性測定：小麥半纖維素溶液中加入粗酶液，42-55℃水浴保溫，取出后加入配制的DNS試劑,沸水浴加熱，取出冷卻后加入蒸餾水，混勻，紫外可見分光光度計測520nm處的OD值；

果膠酶活性測定：在果膠溶液中加入粗酶液，42-55℃水浴保溫，取出后加入配制的DNS試劑,沸水浴加熱，取出冷卻后加入蒸餾水，混勻，紫外可見分光光度計測520nm處的OD值；

漆酶活性測定：鄰聯(lián)甲苯胺溶液、醋酸鹽緩沖液和粗酶液混合得反應(yīng)液，20-35℃保溫后，用紫外分光光度計于600nm處測光密度值；

鄰苯二酚氧化酶活性測定：鄰苯二酚溶液、磷酸鹽緩沖液、粗酶液混合得反應(yīng)液，反應(yīng)液20-35℃保溫后，用紫外分光光度計于400nm處測光密度值；

愈創(chuàng)木酚酶活性測定：愈創(chuàng)木酚溶液、醋酸鹽緩沖液和粗酶液混合得反應(yīng)液，反應(yīng)液20-35℃保溫后，用紫外分光光度計于490nm處測光密度值。

取樣對分別對培養(yǎng)液的淀粉酶、羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、漆酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚酶活性進(jìn)行測定，優(yōu)選測定方法如下：

淀粉酶活性測定：試管中加入0.4-0.6%的可溶性淀粉溶液1-2mL，可溶性淀粉溶液用0.05-0.15mol/L乙酸鹽緩沖液配置，加稀釋8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL混勻，32-45℃水浴準(zhǔn)確保溫20-50min，取出后立即加入配制的DNS試劑1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷卻后加入蒸餾水18-25mL，混勻，紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸10-20min滅活的酶液作對照，酶活性以樣品與底物反應(yīng)20-40min后光密度的改變值表示；

羧甲基纖維素酶活性測定：試管中加入0.4-0.6%的羧甲基纖維素鈉溶液1-2mL，羧甲基纖維素鈉溶液用0.05-0.15mol/L檸檬酸鹽緩沖液配制，加稀釋8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴準(zhǔn)確保溫20-40min，取出后立即加入配制的DNS試劑1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷卻后加入蒸餾水18-25mL，混勻，紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸10-20min滅活的酶液作對照，酶活性以樣品與底物反應(yīng)20-40min后光密度的改變值表示；

半纖維素酶活性測定：試管中加入0.4-0.6%的小麥半纖維素溶液1-2mL，小麥半纖維素溶液用0.05-0.15mol/L乙酸鹽緩沖液配制，加稀釋8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴準(zhǔn)確保溫20-40min，取出后立即加入配制的DNS試劑1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷卻后加入蒸餾水18-25mL，混勻，紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸10-20min滅活的酶液作對照，酶活性以樣品與底物反應(yīng)20-40min后光密度的改變值表示；

果膠酶活性測定：試管中加入0.5-1.5%的果膠溶液1-2mL,用0.05-0.15mol/L乙酸鹽緩沖液配制，加稀釋8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴準(zhǔn)確保溫20-40min，取出后立即加入配制的DNS試劑1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷卻后加入蒸餾水18-25mL，混勻，紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸10-20min滅活的酶液作對照酶活性以樣品與底物反應(yīng)20-40min后光密度的改變值表示；

漆酶活性測定：試管中加入鄰聯(lián)甲苯胺溶液0.3-0.7mL，0.05-0.15mol/L醋酸鹽緩沖液3-4mL和稀釋8-12倍的粗酶液0.05-0.2mL，反應(yīng)液20-35℃保溫20-40min后，立即用紫外分光光度計于600nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

鄰苯二酚氧化酶活性測定：試管中加入0.05-0.15mol/L鄰苯二酚溶液1-3mL， 0.02-0.08mol/L磷酸鹽緩沖液1-3mL和稀釋8-12倍的粗酶液0.05-0.2mL，反應(yīng)液20-35℃保溫20-40min后，立即用紫外分光光度計于400nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

愈創(chuàng)木酚酶活性測定：試管中加入80mmol/L的愈創(chuàng)木酚溶液0.3-0.7mL，0.05-0.15mol/L醋酸鹽緩沖液2-4mL和稀釋8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，反應(yīng)液20-35℃保溫20-40min后，立即用紫外分光光度計于490nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示。

取樣對分別對培養(yǎng)液的淀粉酶、羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、漆酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚酶活性進(jìn)行測定，更優(yōu)選測定方法如下：

淀粉酶活性測定：試管中加入0.4-0.6%的可溶性淀粉溶液1-2mL，可溶性淀粉溶液用0.05-0.15mol/L、pH5-6.5的乙酸鹽緩沖液配置，加稀釋8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL混勻，32-45℃水浴準(zhǔn)確保溫20-50min，取出后立即加入配制的DNS試劑1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷卻后加入蒸餾水18-25mL，混勻，紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸10-20min滅活的酶液作對照，酶活性以樣品與底物反應(yīng)20-40min后光密度的改變值表示；

羧甲基纖維素酶活性測定：試管中加入0.4-0.6%的羧甲基纖維素鈉溶液1-2mL，羧甲基纖維素鈉溶液用0.05-0.15mol/L 、pH4-5.5的檸檬酸鹽緩沖液配制，加稀釋8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴準(zhǔn)確保溫20-40min，取出后立即加入配制的DNS試劑1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷卻后加入蒸餾水18-25mL，混勻，紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸10-20min滅活的酶液作對照，酶活性以樣品與底物反應(yīng)20-40min后光密度的改變值表示；

半纖維素酶活性測定：試管中加入0.4-0.6%的小麥半纖維素溶液1-2mL，小麥半纖維素溶液用0.05-0.15mol/L、pH4-5.5乙酸鹽緩沖液配制，加稀釋8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴準(zhǔn)確保溫20-40min，取出后立即加入配制的DNS試劑1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷卻后加入蒸餾水18-25mL，混勻，紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸10-20min滅活的酶液作對照，酶活性以樣品與底物反應(yīng)20-40min后光密度的改變值表示；

果膠酶活性測定：試管中加入0.5-1.5%的果膠溶液1-2mL,用0.05-0.15mol/L、pH4-5.5的乙酸鹽緩沖液配制，加稀釋8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，42-55℃水浴準(zhǔn)確保溫20-40min，取出后立即加入配制的DNS試劑1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷卻后加入蒸餾水18-25mL，混勻，紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸10-20min滅活的酶液作對照酶活性以樣品與底物反應(yīng)20-40min后光密度的改變值表示；

漆酶活性測定：試管中加入鄰聯(lián)甲苯胺溶液0.3-0.7mL，0.05-0.15mol/L、pH4-5.5的醋酸鹽緩沖液3-4mL和稀釋8-12倍的粗酶液0.05-0.2mL，反應(yīng)液20-35℃保溫20-40min后，立即用紫外分光光度計于600nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

鄰苯二酚氧化酶活性測定：試管中加入0.05-0.15mol/L鄰苯二酚溶液1-3mL， 0.02-0.08mol/L、pH5-7的磷酸鹽緩沖液1-3mL和稀釋8-12倍的粗酶液0.05-0.2mL，反應(yīng)液20-35℃保溫20-40min后，立即用紫外分光光度計于400nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

愈創(chuàng)木酚酶活性測定：試管中加入80mmol/L的愈創(chuàng)木酚溶液0.3-0.7mL，0.05-0.15mol/L、pH4-5.5的醋酸鹽緩沖液2-4mL和稀釋8-12倍的粗酶液0.3-0.7mL，反應(yīng)液20-35℃保溫20-40min后，立即用紫外分光光度計于490nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示。

取樣對分別對培養(yǎng)液的淀粉酶、羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、漆酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚酶活性進(jìn)行測定，優(yōu)選測定方法如下：

淀粉酶活性測定：試管中加入0.4-0.6%的可溶性淀粉溶液1-2ml，可溶性淀粉溶液用pH5.2-6.3，0.05-0.15mol/L的乙酸鹽緩沖液配置，加稀釋9-11倍的粗酶液0.3-0.7mL混勻，32-42℃水浴準(zhǔn)確保溫20-40min，取出后立即加入配制的DNS試劑1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷卻后加入蒸餾水19-23mL，混勻，紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸10-20min滅活的酶液作對照，酶活性以樣品與底物反應(yīng)20-40min后光密度的改變值表示；

羧甲基纖維素酶活性測定：試管中加入0.4-0.6%的羧甲基纖維素鈉溶液1-2ml，羧甲基纖維素鈉溶液用pH4-5.2、0.05-0.15mol/L檸檬酸鹽緩沖液配制，加稀釋9-11倍的粗酶液0.3-0.7mL，47-53℃水浴準(zhǔn)確保溫20-40min，取出后立即加入配制的DNS試劑1-2mL，沸水浴2-8min，取出冷卻后加入蒸餾水19-23mL，混勻，紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸10-20min滅活的酶液作對照，酶活性以樣品與底物反應(yīng)20-40min后光密度的改變值表示；

半纖維素酶活性測定：試管中加入0.4-0.6%的小麥半纖維素溶液1-2ml，小麥半纖維素溶液用pH4-5.2、0.05-0.15mol/L乙酸鹽緩沖液配制，加稀釋9-11倍的粗酶液0.3-0.7mL，47-53℃水浴準(zhǔn)確保溫20-40min，取出后立即加入配制的DNS試劑1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷卻后加入蒸餾水19-23mL，混勻，紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸10-20min滅活的酶液作對照，酶活性以樣品與底物反應(yīng)20-40min后光密度的改變值表示；

果膠酶活性測定：試管中加入0.5-1.5%的果膠溶液1-2ml，果膠溶液用pH4-5、0.05-0.15mol/L乙酸鹽緩沖液配制, 加稀釋9-11倍的粗酶液0.3-0.7mL，47-53℃水浴準(zhǔn)確保溫20-40min，取出后立即加入配制的DNS試劑1-2mL,沸水浴2-8min，取出冷卻后加入蒸餾水19-23mL，混勻，紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸10-20min滅活的酶液作對照，酶活性以樣品與底物反應(yīng)20-40min后光密度的改變值表示；

漆酶活性測定：試管中加入鄰聯(lián)甲苯胺溶液0.3-0.7mL、0.05-0.15mol/L、pH4.2-5.2醋酸鹽緩沖液2.8-3.8mL和稀釋9-11倍的粗酶液0.05-0.15mL，反應(yīng)液24-32℃保溫20-40min后，立即用紫外分光光度計于600nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

鄰苯二酚氧化酶活性測定：試管中加入0.05-0.15mol/L的鄰苯二酚溶液1-3mL、 0.03-0.06mol/L、pH5.5-6.5磷酸鹽緩沖液1-3mL和稀釋9-11倍的粗酶液0.05-0.15mL，反應(yīng)液24-32℃保溫20-40min后，立即用紫外分光光度計于400nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

愈創(chuàng)木酚酶活性測定：試管中加入80mmol/L的愈創(chuàng)木酚溶液0.3-0.7mL，0.05-0.15mol/L、pH4.2-5.2醋酸鹽緩沖液2-4mL和稀釋9-11倍的粗酶液0.3-0.7mL，反應(yīng)液24-32℃保溫20-40min后，立即用紫外分光光度計于490nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示。

取樣對分別對培養(yǎng)液的淀粉酶、羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、漆酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚酶活性進(jìn)行測定，最優(yōu)選測定方法如下：

淀粉酶活性測定：試管中加入0.5%的可溶性淀粉溶液1.5mL，可溶性淀粉溶液用pH5.8，0.1mol/L乙酸鹽緩沖液配置，加稀釋10倍的粗酶液0.5mL混勻，38℃水浴準(zhǔn)確保溫30min，取出后立即加入配制的DNS試劑1.5mL，沸水浴5min，取出冷卻后加入蒸餾水21.5mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸15min滅活的酶液作對照，重復(fù)測試，酶活性以樣品與底物反應(yīng)30min后光密度的改變值表示；

羧甲基纖維素酶活性測定：試管中加入0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液1.5mL，羧甲基纖維素鈉溶液用pH4.6,0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液配制，加稀釋10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴準(zhǔn)確保溫30min，取出后立即加入配制的DNS試劑1.5mL，沸水浴5min，取出冷卻后加入蒸餾水21.5mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸15min滅活的酶液作對照，重復(fù)測試，酶活性以樣品與底物反應(yīng)30min后光密度的改變值表示；

半纖維素酶活性測定：試管中加入0.5%的小麥半纖維素溶液1.5mL，小麥半纖維素溶液用pH4.6,0.1mol/L乙酸鹽緩沖液配制，加稀釋10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴準(zhǔn)確保溫30min，取出后立即加入配制的DNS試劑1.5mL,沸水浴5min，取出冷卻后加入蒸餾水21.5mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸15min滅活的酶液作對照，重復(fù)測試，酶活性以樣品與底物反應(yīng)30min后光密度的改變值表示；

果膠酶活性測定：試管中加入1%的果膠溶液1.5mL，果膠溶液用pH4.5,0.1mol/L乙酸鹽緩沖液配制，加稀釋10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴準(zhǔn)確保溫30min，取出后立即加入配制的DNS試劑1.5mL,沸水浴5min，取出冷卻后加入蒸餾水21.5mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸15min滅活的酶液作對照，重復(fù)測試，酶活性以樣品與底物反應(yīng)30min后光密度的改變值表示；

漆酶活性測定：試管中加入鄰聯(lián)甲苯胺溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸鹽緩沖液3.4mL和稀釋10倍的粗酶液0.1mL，反應(yīng)液28℃保溫30min后，立即用7230G型紫外分光光度計于600nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

鄰苯二酚氧化酶活性測定：試管中加入0.1M的鄰苯二酚溶液2.0mL ，0.05mol/L、pH6.0磷酸鹽緩沖液2.0mL和稀釋10倍的粗酶液0.1mL，反應(yīng)液28℃保溫30min后，立即用7230G型紫外分光光度計于400nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

愈創(chuàng)木酚酶活性測定：試管中加入80mmol/L的愈創(chuàng)木酚溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸鹽緩沖液3.0mL和稀釋10倍的粗酶液0.5mL，反應(yīng)液28℃保溫30min后，立即用7230G型紫外分光光度計于490nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明原料選取方便，成本低，利用研究所得配方可以獲得桑黃菌絲體及胞外活性物質(zhì)的高產(chǎn)。菌絲體產(chǎn)量達(dá)到4.6217g/100mL（46.217mg/mL）。遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Kim DH等的菌絲體產(chǎn)量1.42 g / 100mL和李翠翠等的菌絲體產(chǎn)量0.356 g / 100mL。胞外黃酮產(chǎn)量達(dá)到16.198mg/mL。胞外三萜類化合物產(chǎn)量達(dá)到5.736mg/mL。

淀粉酶、羧甲基纖維素酶、半纖維素酶都在培養(yǎng)的第7天達(dá)到酶活高峰，OD值為0.27；果膠酶在培養(yǎng)的第6天達(dá)到酶活高峰，OD值為0.136；漆酶、愈創(chuàng)木酚酶在培養(yǎng)的第2天達(dá)到酶活高峰，OD值分別為0.066和0.114；愈創(chuàng)木酚酶在第8天又出現(xiàn)第二個小高峰，OD值為0.102；鄰苯二酚氧化酶在培養(yǎng)的第10天和15天分別產(chǎn)生一個酶活高峰，OD值分別為0.351和0.415。

在發(fā)酵過程中，通過測試可知，淀粉酶、羧甲基纖維素酶、半纖維素酶都在培養(yǎng)的第7天達(dá)到酶活高峰；果膠酶在培養(yǎng)的第6天達(dá)到酶活高峰；漆酶、愈創(chuàng)木酚酶在培養(yǎng)的第2天達(dá)到酶活高峰，愈創(chuàng)木酚酶在第8天又出現(xiàn)第二個小高峰；鄰苯二酚氧化酶在培養(yǎng)的第10天和15天分別產(chǎn)生一個酶活高峰，第15天的更高一些。

酶活性反應(yīng)菌絲生長過程中對培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用情況。淀粉酶酶活說明桑黃具有降解多糖類物質(zhì)的能力，羧甲基纖維素酶酶活說明桑黃具有降解纖維素的能力，半纖維素酶酶活說明桑黃具有降解半纖維素的能力，果膠酶酶活說明桑黃具有降解果膠的能力，漆酶、愈創(chuàng)木酚酶、鄰苯二酚氧化酶酶活說明桑黃具有降解木質(zhì)素的能力。7種酶酶活高峰先后出現(xiàn)，漆酶、愈創(chuàng)木酚酶最早達(dá)到高峰，之后是果膠酶，然后是淀粉酶、羧甲基纖維素酶、半纖維素酶，最后是鄰苯二酚氧化酶，說明桑黃對木質(zhì)素有優(yōu)先利用的特點，再利用果膠，之后利用淀粉、羧甲基纖維素、半纖維素，鄰苯二酚氧化酶的活性高峰說明桑黃在液體培養(yǎng)的中后期更多利用木質(zhì)素。這些規(guī)律的把握，對于工廠化液體培養(yǎng)時適時補(bǔ)充合適的營養(yǎng)成分具有較高的指導(dǎo)意義。

（四）附圖說明

圖1為淀粉酶酶活變化規(guī)律圖；

圖2為羧甲基纖維素酶酶活變化規(guī)律圖；

圖3為半纖維素酶酶活變化規(guī)律圖；

圖4為果膠酶酶活變化規(guī)律圖；

圖5為漆酶酶活變化規(guī)律圖；

圖6為鄰苯二酚氧化酶酶活變化規(guī)律圖；

圖7為愈創(chuàng)木酚氧化酶酶活變化規(guī)律圖。

（五）具體實施方式

實施例1

1.配制培養(yǎng)基：

按照配方組成（麥麩7%，玉米粉3%，蛋白胨2%，MgSO₄·7H₂O 0.1%，KH₂PO₄ 0.12%，K₂HPO₄·3H₂O 0.03% ）

配制方法（麥麩放入足量的水中，煮沸50min，四層紗布過濾，向濾液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄和K₂HPO₄·3H₂O ，調(diào)pH值為6）配制6L培養(yǎng)基。

2.裝罐：將培養(yǎng)基裝入10L的發(fā)酵罐（生產(chǎn)廠家：揚(yáng)州新亞；容積：10L；電機(jī)配置：200w，50Hz，1300rpm；攪拌：兩層圓盤直葉攪拌，一層攪拌槳；空氣噴管：多孔圓環(huán)下噴式噴管）。

3.滅菌：在攪拌狀態(tài)下，夾層蒸汽加熱到110℃；關(guān)閉攪拌，改為直接進(jìn)蒸汽升溫至119℃—124℃，壓力0.1±0.05Mpa，保溫20min滅菌。

4.接種：火焰圈保護(hù)接種。向滅菌后的培養(yǎng)基中以10%的比例接入處于迅速生長期的培養(yǎng)8d的桑黃液體菌種。

5.培養(yǎng)：提供條件，開始培養(yǎng)（T：28±0.5℃；罐壓：0.05±0.005Mpa；空氣流量：0-92h，0.20m3/h,93-358h,0.30m3/h，359-422h，0.20m3/h階段性調(diào)節(jié)；攪拌：0-62h，20Hz，63-160h，30Hz，161-332h，20Hz，333-422h，10Hz）。

每天定時取樣對培養(yǎng)液的多種酶活進(jìn)行測定，測定方法如下：

淀粉酶活性測定：試管中加入0.5%的可溶性淀粉溶液1.5mL，可溶性淀粉溶液用pH5.8，0.1mol/L乙酸鹽緩沖液配置，加稀釋10倍的粗酶液0.5mL混勻，38℃水浴準(zhǔn)確保溫30min，取出后立即加入配制的DNS試劑1.5mL，沸水浴5min，取出冷卻后加入蒸餾水21.5mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸15min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)30min后光密度的改變值表示；

羧甲基纖維素酶活性測定：試管中加入0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液1.5mL，羧甲基纖維素鈉溶液用pH4.6,0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液配制，加稀釋10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴準(zhǔn)確保溫30min，取出后立即加入配制的DNS試劑1.5mL，沸水浴5min，取出冷卻后加入蒸餾水21.5mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸15min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)30min后光密度的改變值表示；

半纖維素酶活性測定：試管中加入0.5%的小麥半纖維素溶液1.5mL，小麥半纖維素溶液用pH4.6,0.1mol/L乙酸鹽緩沖液配制，加稀釋10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴準(zhǔn)確保溫30min，取出后立即加入配制的DNS試劑1.5mL,沸水浴5min，取出冷卻后加入蒸餾水21.5mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸15min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)30min后光密度的改變值表示；

果膠酶活性測定：試管中加入1%的果膠溶液1.5mL，果膠溶液用pH4.5,0.1M乙酸鹽緩沖液配制，加稀釋10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴準(zhǔn)確保溫30min，取出后立即加入配制的DNS試劑1.5mL,沸水浴5min，取出冷卻后加入蒸餾水21.5mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸15min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)30min后光密度的改變值表示；

漆酶活性測定：試管中加入鄰聯(lián)甲苯胺溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸鹽緩沖液3.4mL和稀釋10倍的粗酶液0.1mL，反應(yīng)液28℃保溫30min后，立即用7230G型紫外分光光度計于600nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

鄰苯二酚氧化酶活性測定：試管中加入0.1mol/L的鄰苯二酚溶液2.0mL ，0.05mol/L、pH6.0磷酸鹽緩沖液2.0mL和稀釋10倍的粗酶液0.1mL，反應(yīng)液28℃保溫30min后，立即用7230G型紫外分光光度計于400nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

愈創(chuàng)木酚酶活性測定：試管中加入80mmol/L的愈創(chuàng)木酚溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸鹽緩沖液3.0mL和稀釋10倍的粗酶液0.5mL，反應(yīng)液28℃保溫30min后，立即用7230G型紫外分光光度計于490nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示。

通過測試圖1-7可知，淀粉酶、羧甲基纖維素酶、半纖維素酶都在培養(yǎng)的第7天達(dá)到酶活高峰，OD值為0.27；果膠酶在培養(yǎng)的第6天達(dá)到酶活高峰，OD值為0.136；漆酶、愈創(chuàng)木酚酶在培養(yǎng)的第2天達(dá)到酶活高峰，OD值分別為0.066和0.114；愈創(chuàng)木酚酶在第8天又出現(xiàn)第二個小高峰，OD值為0.102；鄰苯二酚氧化酶在培養(yǎng)的第10天和15天分別產(chǎn)生一個酶活高峰，OD值分別為0.351和0.415。

實施例2

1.配制培養(yǎng)基：

按照配方組成（麥麩6%，玉米粉4%，蛋白胨3%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，KH₂PO₄ 0.10%，K₂HPO₄·3H₂O 0.04% ）

配制方法（麥麩放入足量的水中，煮沸55min，四層紗布過濾，向濾液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄和K₂HPO₄·3H₂O ，調(diào)pH值為6）配制6L培養(yǎng)基。

2.裝罐：將培養(yǎng)基裝入10L的發(fā)酵罐（生產(chǎn)廠家：揚(yáng)州新亞；容積：10L；電機(jī)配置：200w，50Hz，1300rpm；攪拌：兩層圓盤直葉攪拌，一層攪拌槳；空氣噴管：多孔圓環(huán)下噴式噴管）。

3.滅菌：在攪拌狀態(tài)下，夾層蒸汽加熱到110℃；關(guān)閉攪拌，改為直接進(jìn)蒸汽升溫至119℃—124℃，壓力0.1±0.05Mpa，保溫20min滅菌。

4.接種：火焰圈保護(hù)接種。向滅菌后的培養(yǎng)基中以10%的比例接入處于迅速生長期的培養(yǎng)8d的桑黃液體菌種。

5.培養(yǎng)：提供條件，開始培養(yǎng)（T：28±0.5℃；罐壓：0.05±0.005Mpa；空氣流量：0-92h，0.20m3/h,93-358h,0.30m3/h，359-422h，0.20m3/h階段性調(diào)節(jié)；攪拌：0-62h，20Hz，63-160h，30Hz，161-332h，20Hz，333-422h，10Hz）。

每天定時取樣對培養(yǎng)液的多種酶活進(jìn)行測定，測定方法如下：

淀粉酶活性測定：試管中加入0.4%的可溶性淀粉溶液2ml，可溶性淀粉溶液用pH6.3，0.05mol/L的乙酸鹽緩沖液配置，加稀釋9倍的粗酶液0.3mL混勻，32℃水浴準(zhǔn)確保溫40min，取出后立即加入配制的DNS試劑1mL，沸水浴2min，取出冷卻后加入蒸餾水23mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸10min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)40min后光密度的改變值表示；

羧甲基纖維素酶活性測定：試管中加入0.4%的羧甲基纖維素鈉溶液2ml，羧甲基纖維素鈉溶液用pH4、0.15mol/L檸檬酸鹽緩沖液配制，加稀釋11倍的粗酶液0.7mL，47℃水浴準(zhǔn)確保溫40min，取出后立即加入配制的DNS試劑2mL，沸水浴8min，取出冷卻后加入蒸餾水19mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸20min滅活的酶液作對照，酶活性以樣品與底物反應(yīng)20min后光密度的改變值表示；

半纖維素酶活性測定：試管中加入0.4%的小麥半纖維素溶液2ml，小麥半纖維素溶液用pH4、0.05mol/L乙酸鹽緩沖液配制，加稀釋9倍的粗酶液0.3mL，53℃水浴準(zhǔn)確保溫20min，取出后立即加入配制的DNS試劑1mL,沸水浴2min，取出冷卻后加入蒸餾水23mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸10min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)40min后光密度的改變值表示；

果膠酶活性測定：試管中加入1.5%的果膠溶液1ml，果膠溶液用pH4、0.05mol/L乙酸鹽緩沖液配制, 加稀釋11倍的粗酶液0.7mL， 53℃水浴準(zhǔn)確保溫20min，取出后立即加入配制的DNS試劑2mL,沸水浴8min，取出冷卻后加入蒸餾水19mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸20min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)20min后光密度的改變值表示；

漆酶活性測定：試管中加入鄰聯(lián)甲苯胺溶液0.3mL、0.15mol/L、pH5.2醋酸鹽緩沖液2.8mL和稀釋11倍的粗酶液0.15mL，反應(yīng)液24℃保溫40min后，立即用7230G型紫外分光光度計于600nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

鄰苯二酚氧化酶活性測定：試管中加入0.15mol/L的鄰苯二酚溶液1mL、 0.06mol/L、pH5.5磷酸鹽緩沖液1mL和稀釋9倍的粗酶液0.05mL，反應(yīng)液32℃保溫20min后，立即用7230G型紫外分光光度計于400nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

愈創(chuàng)木酚酶活性測定：試管中加入80mmol/L的愈創(chuàng)木酚溶液0.3mL，0.05mol/L、pH4.2醋酸鹽緩沖液4mL和稀釋11倍的粗酶液0.7mL，反應(yīng)液24℃保溫40min后，立即用7230G型紫外分光光度計于490nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示。

實施例3

1.配制培養(yǎng)基：

按照配方組成（麥麩8%，玉米粉2%，蛋白胨1%，MgSO₄·7H₂O 0.15%，KH₂PO₄ 0.15%，K₂HPO₄·3H₂O 0.02% ）

配制方法（麥麩放入足量的水中，煮沸45min，四層紗布過濾，向濾液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄和K₂HPO₄·3H₂O ，調(diào)pH值為6）配制6L培養(yǎng)基。

2.裝罐：將培養(yǎng)基裝入10L的發(fā)酵罐（生產(chǎn)廠家：揚(yáng)州新亞；容積：10L；電機(jī)配置：200w，50Hz，1300rpm；攪拌：兩層圓盤直葉攪拌，一層攪拌槳；空氣噴管：多孔圓環(huán)下噴式噴管）。

3.滅菌：在攪拌狀態(tài)下，夾層蒸汽加熱到110℃；關(guān)閉攪拌，改為直接進(jìn)蒸汽升溫至119℃—124℃，壓力0.1±0.05Mpa，保溫20min滅菌。

4.接種：火焰圈保護(hù)接種。向滅菌后的培養(yǎng)基中以10%的比例接入處于迅速生長期的培養(yǎng)8d的桑黃液體菌種。

5.培養(yǎng)：提供條件，開始培養(yǎng)（T：28±0.5℃；罐壓：0.05±0.005Mpa；空氣流量：0-92h，0.20m3/h,93-358h,0.30m3/h，359-422h，0.20m3/h階段性調(diào)節(jié)；攪拌：0-62h，20Hz，63-160h，30Hz，161-332h，20Hz，333-422h，10Hz）。

每天定時取樣對培養(yǎng)液的多種酶活進(jìn)行測定，測定方法如下：

淀粉酶活性測定：試管中加入0.6%的可溶性淀粉溶液1ml，可溶性淀粉溶液用pH5.2，0.05mol/L的乙酸鹽緩沖液配置，加稀釋11倍的粗酶液0.7mL混勻，42℃水浴準(zhǔn)確保溫20min，取出后立即加入配制的DNS試劑2mL，沸水浴8min，取出冷卻后加入蒸餾水19mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸20min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)20min后光密度的改變值表示；

羧甲基纖維素酶活性測定：試管中加入0.6%的羧甲基纖維素鈉溶液1ml，羧甲基纖維素鈉溶液用pH5.2、0.05mol/L檸檬酸鹽緩沖液配制，加稀釋9倍的粗酶液0.3mL，53℃水浴準(zhǔn)確保溫20min，取出后立即加入配制的DNS試劑1mL，沸水浴2min，取出冷卻后加入蒸餾水23mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸10min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)40min后光密度的改變值表示；

半纖維素酶活性測定：試管中加入0.6%的小麥半纖維素溶液1ml，小麥半纖維素溶液用pH5.2、0.15mol/L乙酸鹽緩沖液配制，加稀釋11倍的粗酶液0.7mL，47℃水浴準(zhǔn)確保溫40min，取出后立即加入配制的DNS試劑2mL,沸水浴8min，取出冷卻后加入蒸餾水19mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸20min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)20min后光密度的改變值表示；

果膠酶活性測定：試管中加入0.5%的果膠溶液2ml，果膠溶液用pH5、0.15mol/L乙酸鹽緩沖液配制, 加稀釋9倍的粗酶液0.3mL，47℃水浴準(zhǔn)確保溫20min，取出后立即加入配制的DNS試劑1mL,沸水浴2min，取出冷卻后加入蒸餾水23mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸10min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)40min后光密度的改變值表示；

漆酶活性測定：試管中加入鄰聯(lián)甲苯胺溶液0.7mL、0.05mol/L、pH4.2醋酸鹽緩沖液3.8mL和稀釋9倍的粗酶液0.05mL，反應(yīng)液32℃保溫20min后，立即用7230G型紫外分光光度計于600nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

鄰苯二酚氧化酶活性測定：試管中加入0.05mol/L的鄰苯二酚溶液3mL、 0.03mol/L、pH5.5磷酸鹽緩沖液3mL和稀釋11倍的粗酶液0.15mL，反應(yīng)液24℃保溫40min后，立即用7230G型紫外分光光度計于400nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

愈創(chuàng)木酚酶活性測定：試管中加入80mmol/L的愈創(chuàng)木酚溶液0.7mL， 0.15mol/L、pH5.2醋酸鹽緩沖液2mL和稀釋9倍的粗酶液0.3mL，反應(yīng)液32℃保溫20min后，立即用7230G型紫外分光光度計于490nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示。

實施例4

1.配制培養(yǎng)基：

按照配方組成（麥麩7%，玉米粉3%，蛋白胨2%，MgSO₄·7H₂O 0.1%，KH₂PO₄ 0.12%，K₂HPO₄·3H₂O 0.03% ）

配制方法（麥麩放入足量的水中，煮沸50min，四層紗布過濾，向濾液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄和K₂HPO₄·3H₂O，調(diào)pH值為6）配制6L培養(yǎng)基。

2.裝罐：將培養(yǎng)基裝入10L的發(fā)酵罐（生產(chǎn)廠家：揚(yáng)州新亞；容積：10L；電機(jī)配置：200w，50Hz，1300rpm；攪拌：兩層圓盤直葉攪拌，一層攪拌槳；空氣噴管：多孔圓環(huán)下噴式噴管）。

3.滅菌：在攪拌狀態(tài)下，夾層蒸汽加熱到110℃；關(guān)閉攪拌，改為直接進(jìn)蒸汽升溫至119℃—124℃，壓力0.1±0.05Mpa，保溫20min滅菌。

4.接種：火焰圈保護(hù)接種。向滅菌后的培養(yǎng)基中以10%的比例接入處于迅速生長期的培養(yǎng)8d的桑黃液體菌種。

5.培養(yǎng)：提供條件，開始培養(yǎng)（T：28±0.5℃；罐壓：0.05±0.005Mpa；空氣流量：0-92h，0.20m3/h,93-358h,0.30m3/h，359-422h，0.20m3/h階段性調(diào)節(jié)；攪拌：0-62h，20Hz，63-160h，30Hz，161-332h，20Hz，333-422h，10Hz）。

每天定時取樣對培養(yǎng)液的多種酶活進(jìn)行測定，測定方法如下：

淀粉酶活性測定：試管中加入0.5%的可溶性淀粉溶液1.5mL，可溶性淀粉溶液用pH5.8，0.1mol/L乙酸鹽緩沖液配置，加稀釋8倍的粗酶液0.7mL混勻，32℃水浴準(zhǔn)確保溫50min，取出后立即加入配制的DNS試劑1.5mL，沸水浴5min，取出冷卻后加入蒸餾水21.5mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸15min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)30min后光密度的改變值表示；

羧甲基纖維素酶活性測定：試管中加入0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液1.5mL，羧甲基纖維素鈉溶液用pH4.6,0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液配制，加稀釋8倍的粗酶液0.3mL，42℃水浴準(zhǔn)確保溫40min，取出后立即加入配制的DNS試劑1.5mL，沸水浴5min，取出冷卻后加入蒸餾水21.5mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸15min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)30min后光密度的改變值表示；

半纖維素酶活性測定：試管中加入0.5%的小麥半纖維素溶液1.5mL，小麥半纖維素溶液用pH4.6,0,1mol/L乙酸鹽緩沖液配制，加稀釋10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴準(zhǔn)確保溫30min，取出后立即加入配制的DNS試劑1.5mL,沸水浴5min，取出冷卻后加入蒸餾水21.5mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸15min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)30min后光密度的改變值表示；

果膠酶活性測定：試管中加入1%的果膠溶液1.5mL，果膠溶液用pH4.5,0.1mol/L乙酸鹽緩沖液配制，加稀釋8倍的粗酶液0.3mL，42℃水浴準(zhǔn)確保溫40min，取出后立即加入配制的DNS試劑1.5mL,沸水浴5min，取出冷卻后加入蒸餾水18mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸15min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)30min后光密度的改變值表示；

漆酶活性測定：試管中加入鄰聯(lián)甲苯胺溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸鹽緩沖液3mL和稀釋8倍的粗酶液0.05mL，反應(yīng)液35℃保溫30min后，立即用7230G型紫外分光光度計于600nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

鄰苯二酚氧化酶活性測定：試管中加入0.1mol/L的鄰苯二酚溶液2.0mL ，0.05mol/L、pH6.0磷酸鹽緩沖液2.0mL和稀釋8倍的粗酶液0.05mL，反應(yīng)液20℃保溫40min后，立即用7230G型紫外分光光度計于400nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

愈創(chuàng)木酚酶活性測定：試管中加入80mmol/L的愈創(chuàng)木酚溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸鹽緩沖液3.0mL和稀釋8倍的粗酶液0.3mL，反應(yīng)液20℃保溫40min后，立即用7230G型紫外分光光度計于490nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示。

實施例5

1.配制培養(yǎng)基：

按照配方組成（麥麩7%，玉米粉3%，蛋白胨2%，MgSO₄·7H₂O 0.1%，KH₂PO₄ 0.12%，K₂HPO₄·3H₂O 0.03% ）

配制方法（麥麩放入足量的水中，煮沸50min，四層紗布過濾，向濾液中依次加入玉米粉、蛋白胨、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄和K₂HPO₄·3H₂O ，調(diào)pH值為6）配制6L培養(yǎng)基。

2.裝罐：將培養(yǎng)基裝入10L的發(fā)酵罐（生產(chǎn)廠家：揚(yáng)州新亞；容積：10L；電機(jī)配置：200w，50Hz，1300rpm；攪拌：兩層圓盤直葉攪拌，一層攪拌槳；空氣噴管：多孔圓環(huán)下噴式噴管）。

3.滅菌：在攪拌狀態(tài)下，夾層蒸汽加熱到110℃；關(guān)閉攪拌，改為直接進(jìn)蒸汽升溫至119℃—124℃，壓力0.1±0.05Mpa，保溫20min滅菌。

4.接種：火焰圈保護(hù)接種。向滅菌后的培養(yǎng)基中以10%的比例接入處于迅速生長期的培養(yǎng)8d的桑黃液體菌種。

5.培養(yǎng)：提供條件，開始培養(yǎng)（T：28±0.5℃；罐壓：0.05±0.005Mpa；空氣流量：0-92h，0.20m3/h,93-358h,0.30m3/h，359-422h，0.20m3/h階段性調(diào)節(jié)；攪拌：0-62h，20Hz，63-160h，30Hz，161-332h，20Hz，333-422h，10Hz）。

每天定時取樣對培養(yǎng)液的多種酶活進(jìn)行測定，測定方法如下：

淀粉酶活性測定：試管中加入0.5%的可溶性淀粉溶液1.5mL，可溶性淀粉溶液用pH5.8，0.1mol/L乙酸鹽緩沖液配置，加稀釋12倍的粗酶液0.3mL混勻，45℃水浴準(zhǔn)確保溫20min，取出后立即加入配制的DNS試劑1.5mL，沸水浴5min，取出冷卻后加入蒸餾水21.5mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸15min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)30min后光密度的改變值表示；

羧甲基纖維素酶活性測定：試管中加入0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液1.5mL，羧甲基纖維素鈉溶液用pH4.6,0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液配制，加稀釋12倍的粗酶液0.7mL，55℃水浴準(zhǔn)確保溫20min，取出后立即加入配制的DNS試劑1.5mL，沸水浴5min，取出冷卻后加入蒸餾水21.5mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸15min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)30min后光密度的改變值表示；

半纖維素酶活性測定：試管中加入0.5%的小麥半纖維素溶液1.5mL，小麥半纖維素溶液用pH4.6,0.1mol/L乙酸鹽緩沖液配制，加稀釋10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴準(zhǔn)確保溫30min，取出后立即加入配制的DNS試劑1.5mL,沸水浴5min，取出冷卻后加入蒸餾水21.5mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸15min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)30min后光密度的改變值表示；

果膠酶活性測定：試管中加入1%的果膠溶液1.5mL，果膠溶液用pH4.5,0.1mol/L乙酸鹽緩沖液配制，加稀釋12倍的粗酶液0.7mL，55℃水浴準(zhǔn)確保溫20min，取出后立即加入配制的DNS試劑1.5mL,沸水浴5min，取出冷卻后加入蒸餾水25mL，混勻，7230G型紫外可見分光光度計測520nm處的OD值，以煮沸15min滅活的酶液作對照，每組3個重復(fù)，酶活性以樣品與底物反應(yīng)30min后光密度的改變值表示；

漆酶活性測定：試管中加入鄰聯(lián)甲苯胺溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸鹽緩沖液4mL和稀釋12倍的粗酶液0.2mL，反應(yīng)液20℃保溫30min后，立即用7230G型紫外分光光度計于600nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

鄰苯二酚氧化酶活性測定：試管中加入0.1mol/L的鄰苯二酚溶液2.0mL ，0.05mol/L、pH6.0磷酸鹽緩沖液2.0mL和稀釋12倍的粗酶液0.2mL，反應(yīng)液35℃保溫20min后，立即用7230G型紫外分光光度計于400nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示；

愈創(chuàng)木酚酶活性測定：試管中加入80mmol/L的愈創(chuàng)木酚溶液0.5mL，0.1mol/L、pH4.6醋酸鹽緩沖液3.0mL和稀釋12倍的粗酶液0.7mL，反應(yīng)液35℃保溫20min后，立即用7230G型紫外分光光度計于490nm處測光密度值，酶活單位以反應(yīng)前后OD值的變化表示。

需要說明的是，雖然本發(fā)明已將較佳實施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明方法。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方案范圍的情況下，都可以利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例。因此未脫離本發(fā)明方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化及修飾，均應(yīng)落在本發(fā)明方案保護(hù)的范圍內(nèi)。