本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療流感病毒的一類化合物和涉及含有這些化合物的組合物和制劑。具體涉及如結(jié)構(gòu)式i的一類化合物及其制備方法和在抗流感病毒中的用途。
背景技術(shù)：
：流感病毒（influenzavirus）為人類急性下呼吸道感染的重要病原體，包括人流感病毒和動(dòng)物流感病毒，它是由正粘病毒（orthomyxoviridae）科的rna病毒引起的，極易在哺乳動(dòng)物和鳥類當(dāng)中進(jìn)行傳播導(dǎo)致流行，每年都有死亡的案例出現(xiàn)，對人類的健康造成了很大的威脅，也受到了越來越多的關(guān)注。人流感病毒主要分為甲（a）、乙（b）、丙（c）三型，是流感的病原體，其中甲型流感病毒極易發(fā)生變異，多次引起世界性的大流行。其中，自從1900年以來在世界范圍內(nèi)造成了多次的大流行，導(dǎo)致至少5000萬的人不幸喪生。例如1918-1919年世界上暴發(fā)了歷史上最著名的嚴(yán)重流感大流行，災(zāi)難性的“西班牙流感”（h1n1甲型流感病毒）在全世界至少奪去了2000萬-4000萬人得性命，在這場流感之后，美國人的平均壽命下降了10年。1957年，暴發(fā)了“亞洲流感”(病毒類型h2n2)，流感兩周后騷擾了亞洲的所有國家，接著又在澳洲、美洲和歐洲登陸，漫游了無數(shù)國家。此次全球仍然有200多萬人遭遇厄運(yùn)。隨后的1968年7月，由甲型流感病毒(h3n2)所致的“香港流感”在香港大規(guī)模暴發(fā)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國共有3.4萬人因感染致死，整個(gè)倫敦很多人染病，需要大批志愿者進(jìn)行護(hù)理。1977年1月，“俄羅斯流感”(病毒類型h1n1)在前蘇聯(lián)出現(xiàn)并流行，1997年，開始出現(xiàn)禽流感病毒(h5n1)，盡管該病毒很少感染人，但仍然奪去了18個(gè)人的生命，這些人大都與家禽有過直接接觸。2003年，自從2003年以來，全球有400多例禽流感致死的病例。2009年4月，墨西哥、美國等多個(gè)國家和地區(qū)相繼暴發(fā)甲型h1n1流感。眾多的歷史數(shù)據(jù)表明，流感病毒依然是全球健康和人類安全的主要威脅，對人類的影響深遠(yuǎn)，但是目前對流感病毒的標(biāo)準(zhǔn)療法依然不足。流感的最常見癥狀為發(fā)冷、發(fā)熱、喉嚨肌肉酸痛、嚴(yán)重頭痛、咳嗽、身體虛弱等癥狀，其中喉嚨痛、發(fā)熱、咳嗽是最常見的癥狀，且流感加重之后，經(jīng)常會引起肺炎，而肺炎對于一些兒童和老人來說是致命的。人們通常很容易將流感和感冒發(fā)生混淆，而流感是傳染性很強(qiáng)的急性呼吸道傳染病，病毒存在于病人的呼吸道中，在病人咳嗽、打噴嚏時(shí)經(jīng)飛沫傳染給別人，是比感冒更為嚴(yán)重的疾病。流感一般10-50年就要爆發(fā)一次大的流行，給人類的身體健康帶來了嚴(yán)重的威脅，也帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，基于小分子的抗病毒靶標(biāo)主要有質(zhì)子選擇性m2離子通道和蛋白神經(jīng)酰胺酶(na)。但是目前針對這兩種靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的藥物其耐藥性是很常見的，抗流感病毒藥物的耐藥性日益增加。幾乎100%的2008流感病毒h1n1樣品對神經(jīng)酰胺酶抑制劑奧司他韋（達(dá)菲）耐藥，大神多數(shù)的h3n2對金剛烷m2離子通道有耐藥性，而且沒有一種藥物顯示出對2010的h5n1禽流感病毒顯示出有效的抗性。因此，基于目前抗流感病毒藥物的形勢，市場上目前對新的預(yù)防和抵抗流感病毒藥物有著很大的需求。我們的發(fā)明目標(biāo)也是提供有效的治療和預(yù)防病毒的感染，尤其是提供抵抗流感病毒感染的化合物，以及這些化合物的制備方法和這些化合物的使用方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是公開下述結(jié)構(gòu)通式i所示的一類全新的抗流感病毒化合物及這類化合物的制備方法和使用該化合物的抗病毒用途。本發(fā)明提供了式i化合物或其在藥學(xué)上可接受的鹽。其中異惡唑5元雜環(huán)為具有鄰近-ar取代基或鄰近-ar取代基的連接點(diǎn)5元異惡唑雜環(huán)ar為芳基或者雜芳基；r為-ch或者-n；n代表鏈長為0-1個(gè)碳原子x代表-f,-cl,-br,-cf3；y代表-no2,-cl,-br,-cho,-cn；z代表-ch或者-n；w代表-ch或者-n；特別的，在式i化合物的進(jìn)一步實(shí)施方案中，優(yōu)選的異惡唑5元雜環(huán)為具有鄰近-ar取代基或鄰近-ar取代基的連接點(diǎn)5元異惡唑雜環(huán)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中ar優(yōu)選自：其中l(wèi)為h，鹵素，氰基，羥基，氨基，烷基，烷氧基，烷基氨基或酰胺基；m為h，鹵素，氰基，羥基，氨基，烷基，烷氧基，烷基氨基或酰胺基；q為h，鹵素，氰基，羥基，氨基，烷基，烷氧基，烷基氨基或酰胺基；u為h，鹵素，氰基，羥基，氨基，烷基，烷氧基，烷基氨基或酰胺基；甚至更優(yōu)選的ar選自：尤其優(yōu)選的ar為甲氧基、硫氧基、氟、氯或硝基取代的苯基。尤其優(yōu)選的是ar為甲氧基、硫氧基、氟、氯取代的苯基。如以上闡述的那樣，其中r優(yōu)選為-ch或者-n。尤其優(yōu)選的r為-n。優(yōu)選實(shí)施方案中，鏈長n為0-1個(gè)碳原子。尤其優(yōu)選n為鏈長為0個(gè)碳原子。取代基x為-f、-cl或-cf3，更加優(yōu)選為-f或-cl。取代基y為-no2、-cl或-br，更加優(yōu)選為-no2或-br。優(yōu)選實(shí)施方案中，其中z為-ch或者-n。更為優(yōu)選z為-ch。優(yōu)選實(shí)施方案中，其中w為-ch或者-n。更為優(yōu)選w為-ch。根據(jù)以上的實(shí)施方案，優(yōu)選的式i化合物，包括其藥學(xué)上可接受的鹽，包括以下：。本發(fā)明提供了一種藥用組合物，包含一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物，其中所述化合物可以有效治療或預(yù)防病毒感染。包括上述任一所述的式i化合物和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑在治療或預(yù)防病毒感染中的用途。附圖說明圖1為不同孔板中陽性藥物利巴韋林的重復(fù)性結(jié)果圖。圖2為wy01細(xì)胞毒性及對流感病毒h1n1的抑制作用圖。圖3為wy02細(xì)胞毒性及對流感病毒h1n1的抑制作用圖。圖4為wy03細(xì)胞毒性及對流感病毒h1n1的抑制作用圖。圖5為wy04細(xì)胞毒性及對流感病毒h1n1的抑制作用圖。圖6為wy05細(xì)胞毒性及對流感病毒h1n1的抑制作用圖。圖7為wy06細(xì)胞毒性及對流感病毒h1n1的抑制作用圖。圖8為wy07細(xì)胞毒性及對流感病毒h1n1的抑制作用圖。圖9為wy08細(xì)胞毒性及對流感病毒h1n1的抑制作用圖。圖10為wy09細(xì)胞毒性及對流感病毒h1n1的抑制作用圖。圖11為wy10細(xì)胞毒性及對流感病毒h1n1的抑制作用圖。圖12為wy11細(xì)胞毒性及對流感病毒h1n1的抑制作用圖。圖13為wy12細(xì)胞毒性及對流感病毒h1n1的抑制作用圖。圖14為wy13細(xì)胞毒性及對流感病毒h1n1的抑制作用圖。圖15為wy14細(xì)胞毒性及對流感病毒h1n1的抑制作用圖。。圖16為wy15細(xì)胞毒性及對流感病毒h1n1的抑制作用圖。圖17為wy16細(xì)胞毒性及對流感病毒h1n1的抑制作用圖。圖18為wy17細(xì)胞毒性及對流感病毒h1n1的抑制作用圖。具體實(shí)施方式本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。實(shí)施例1：本發(fā)明所述的式i衍生物中具有代表性的化合物結(jié)構(gòu)如下：wy-01、wy-02、wy-03、wy-04、wy-05、wy-06、wy-07、wy-08、wy-09、wy-10、wy-11、wy-12、wy-13、wy-14、wy-15、wy-16、wy-17。實(shí)施例2：化合物1（wy-01）的合成將化合物11a(100mg,0.433mmol)溶解于20ml吡啶中，加入加入84.7mg（0.764mmol）seo2，回流反應(yīng)3.5h。將反應(yīng)液過濾，濾液減壓濃縮，然后加入適量乙醚與1mhcl萃取，合并有機(jī)層，然后有機(jī)層用水洗2次，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮得到90.38mg淺黃色半固體12a。將12a(90.38mg,0.346mmol)和13a(95.90mg,0.346mmol),edci(265.31mg,1.384mmol),diea(66.972mg,0.519mmol)溶解于15ml二氯甲烷中，然后室溫?cái)嚢?-4小時(shí)。加入水溶解，然后用二氯甲烷提取，合并有機(jī)層。然后有機(jī)層用水洗2遍，飽和食鹽水洗1次，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮得粗品。然后經(jīng)柱層析分離得wy-01淡黃色固體130mg。收率為57.72%。mp：182-184℃1hnmr{400mhz,cdcl3(tms),δ(ppm)}:2.78(s,3h),3.22-3.24(m,2h),3.33-3.36(m,2h),3.41(br,s,2h),3.48-3.51(m,2h),3.78(s,3h),6.98-7.00(d,1h),7.09-7.11(d,1h),7.39-7.41(dd,1h),7.45-7.47(dd,1h)。實(shí)施例3：化合物2（wy-02）的合成制備方法類似于實(shí)施例1，但所用原料為11b和13b。得到目標(biāo)化合物wy-02為淺黃色固體。收率65.3%。mp：174-176℃。1hnmr{400mhz,cdcl3(tms),δ(ppm)}:2.77(s,3h),3.11-3.14(t,2h),3.22-3.24(t,2h),3.40-3.42(t,2h),3.50-3.52(m,2h),3.77(s,3h),6.98-7.00(d,1h),6.87-6.92(m,1h),6.96-6.98(d,1h),7.06-7.09(m,1h),7.39-7.41(dd,1h),7.92-7.95(dd,1h),7.44-7.48(dd,1h),7.99-8.02(dd,1h)。實(shí)施例4：化合物3（wy-03）的合成制備方法類似于實(shí)施例1，但所用原料為11c和13c。得到目標(biāo)化合物wy-03為白色固體。收率62.4%。mp：176-178℃。1hnmr{400mhz,cdcl3(tms),δ(ppm)}:2.76(s,3h),3.03-3.05(t,2h),3.13-3.15(t,2h),3.42-3.44(t,2h),3.51-3.53(m,2h),3.77(s,3h),6.97-7.01(m,2h),7.05-7.09(m,1h),7.38-7.40(d,1h),7.44-7.48(m,1h),8.09-7.12(dd,1h),8.25-8.26(dd,1h)。實(shí)施例5：化合物4（wy-04）的合成制備方法類似于實(shí)施例1，但所用原料為11d和13d。得到目標(biāo)化合物wy-04為黃色固體。收率56.6%。mp：152-154℃。1hnmr{400mhz,cdcl3(tms),δ(ppm)}:2.42(s,3h),2.75(s,3h),2.92-2.95(m,2h),3.13-3.15(m,2h),3.22-3.25(m,2h),3.41-3.47(m,2h),3.78(s,3h),7.01-7.03(d,1h),7.07-7.10(m,1h),7.37-7.39(d,1h),7.47-7.50(m,1h),8.09(s,1h)。實(shí)施例6：化合物5（wy-05）的合成制備方法類似于實(shí)施例1，但所用原料為11e和13e。得到目標(biāo)化合物wy-05為類白色半固體。收率61.6%。1hnmr{400mhz,cdcl3(tms),δ(ppm)}:2.37(s,3h),2.82(s,3h),2.97-2.99(t,2h),3.12-3.15(t,2h),3.36-3.39(t,2h),3.57-3.59(t,2h),6.98-7.01(d,1h),7.31-7.35(m,1h),7.37-7.41(m,2h),7.44-7.49(m,1h),8.11-8.14(dd,1h),8.27(d,1h)。實(shí)施例7：化合物6（wy-06）的合成制備方法類似于實(shí)施例1，但所用原料為11f和13f。得到目標(biāo)化合物wy-06為類白色半固體。收率67.7%。mp：145-147℃。1hnmr{400mhz,cdcl3(tms),δ(ppm)}:2.78(s,3h),2.99-3.01(t,2h),3.07-3.09(t,2h),3.45-3.50(m,4h),6.97-7.00(d,1h),7.46-7.53(m,5h),8.08-8.11(dd,1h),8.23-8.24(d,1h)。實(shí)施例8：化合物7（wy-07）的合成制備方法類似于實(shí)施例1，但所用原料為11f和13f。得到目標(biāo)化合物wy-07為淡黃色固體。收率57.1%。mp：186-188℃。1hnmr{400mhz,cdcl3(tms),δ(ppm)}:2.79(s,3h),3.00(s,2h),3.19(s,2h),3.48(s,2h),3.64(s,2h),7.03-7.05(d,1h),7.33-7.37(m,1h),7.41-7.43(d,1h),7.59-7.60(d,1h),8.09-8.11(d,1h),8.24(s,1h)。實(shí)施例9：化合物8（wy-08）的合成制備方法類似于實(shí)施例1，但所用原料為11h和13h。得到目標(biāo)化合物wy-08為淺白色固體。收率63.9%。mp：146-148℃。1hnmr{400mhz,cdcl3(tms),δ(ppm)}:2.79(s,3h),3.09-3.12(t,2h),3.21-3.24(t,2h),3.53-3.56(t,2h),3.66-3.69(t,2h),7.03-7.06(d,1h),7.14-7.18(m,1h),7.28-7.32(m,1h),7.48-7.52(m,1h),7.55-7.59(m,1h),8.12-8.14(dd,1h),8.28-8.29(d,1h)。實(shí)施例10：化合物9（wy-09）的合成制備方法類似于實(shí)施例1，但所用原料為11i和13i。得到目標(biāo)化合物wy-09為棕色半固體。收率46.2%。1hnmr{400mhz,cdcl3(tms),δ(ppm)}:2.78(s,3h),3.13-3.18(m,4h),3.53-3.55(t,2h),3.65-3.67(t,2h),7.02-7.04(d,1h),7.58-7.60(d,1h),7.70-7.73(m,1h),7.77-7.80(m,1h),8.09-8.12(dd,1h),8.25-8.26(d,1h),8.28-8.30(d,1h)。實(shí)施例11：化合物10（wy-10）的合成制備方法類似于實(shí)施例1，但所用原料為11j和13j。得到目標(biāo)化合物wy-10為淺黃色半固體。收率62.7%。mp：92-94℃。1hnmr{400mhz,cdcl3(tms),δ(ppm)}:2.75(s,3h),3.26-3.40(m,4h),3.45-3.48(m,2h),3.56-3.59(m,2h),3.73-3.75(m,3h+2h),6.94-6.97(d,1h),6.99-7.02(d,1h),7.03-7.07(m,1h),7.36-7.39(m,1h),7.42-7.47(m,1h),8.01-8.05(m,1h),8.21-8.23(d,1h)。實(shí)施例12：化合物11（wy-11）的合成制備方法類似于實(shí)施例1，但所用原料為11k和13k。得到目標(biāo)化合物wy-11為類白色固體。收率55.7%。mp：80-82℃。1hnmr{400mhz,cdcl3(tms),δ(ppm)}:2.74(s,3h),3.34-3.37(m,2h),3.50-3.56(m,2h),3.58-3.63(m,2h),3.73-3.78(m,3h+2h),6.74-6.81(d,1h),6.92-6.94(d,1h),7.03-7.07(m,1h),7.36-7.40(m,1h),7.42-7.46(m,1h),7.88-7.90(m,1h),7.93-7.96(m,1h)。實(shí)施例13：化合物12（wy-12）的合成制備方法類似于實(shí)施例1，但所用原料為11l和13l。得到目標(biāo)化合物wy-12為類白色半固體。收率59.1%。mp：102-104℃。1hnmr{400mhz,cdcl3(tms),δ(ppm)}:2.77(s,3h),3.32-3.34(m,2h),3.37-3.43(m,4h),3.57-3.60(m,2h),3.63-3.68(m,2h),7.01-7.03(d,1h),6.92-6.94(d,1h),7.07-7.09(m,1h),7.27-7.29(m,1h),7.46-7.54(m,2h),8.03-8.05(m,1h),8.24-8.25(m,1h)。實(shí)施例14：化合物13（wy-13）的合成制備方法類似于實(shí)施例1，但所用原料為11m和13m。得到目標(biāo)化合物wy-13為深黃色半固體。收率52.1%。1hnmr{400mhz,cdcl3(tms),δ(ppm)}:1.63-1.67(m,2h),183-1.89(m,2h),2.50-2.51(m,1h),2.78(s,3h),3.44-3.48(m,2h),3.62-3.64(m,2h),7.03-7.05(d,1h),7.32-7.36(m,1h),7.41-7.43(m,1h),7.56-7.60(m,1h),8.10-8.12(m,1h),8.24-8.26(d,1h)。實(shí)施例15：化合物14（wy-14）的合成制備方法類似于實(shí)施例1，但所用原料為11n和13n。得到目標(biāo)化合物wy-14為乳黃色半固體。收率53.5%。1hnmr{400mhz,cdcl3(tms),δ(ppm)}:1.65-1.69(m,2h),184-1.89(m,2h),2.51-2.52(m,1h),2.77(s,3h),3.45-3.49(m,2h),3.63-3.65(m,2h),3.78(s,3h),7.02-7.04(d,1h),7.34-7.38(m,1h),7.42-7.44(m,1h),7.56-7.60(m,1h),8.07-8.09(m,1h),8.27-8.28(d,1h),8.48-8.49(d,1h).實(shí)施例16：化合物15（wy-15）的合成制備方法類似于實(shí)施例1，但所用原料為11o和13o。得到目標(biāo)化合物wy-15為黃色固體。收率50.1%。mp:84-86℃1hnmr{400mhz,cdcl3(tms),δ(ppm)}:1.65-1.69(m,2h),184-1.89(m,2h),2.51-2.52(m,1h),2.77(s,3h),3.45-3.49(m,2h),3.63-3.65(m,2h),7.02-7.06(d,1h),7.15-7.18(m,1h),7.28-7.32(m,1h),7.48-7.52(m,1h),7.55-7.59(m,1h),8.13-8.14(dd,1h),8.29-8.31(d,1h)。實(shí)施例17：化合物16（wy-16）的合成制備方法類似于實(shí)施例1，但所用原料為11p和13p。得到目標(biāo)化合物wy-16為白色固體。收率62.1%。mp:146-148℃1hnmr{400mhz,cdcl3(tms),δ(ppm)}:2.84(s,3h),3.07-3.09(m,5h),3.14-3.16(m,2h),3.38-3.39(m,2h),3.54-3.55(m,2h),7.02-7.04(d,1h),7.64-7.66(d,1h),7.70-7.73(m,1h),7.76-7.80(m,1h),8.09-8.14(m,2h),8.23-8.24(d,1h)。實(shí)施例18：化合物17（wy-17）的合成制備方法類似于實(shí)施例1，但所用原料為11q和13q。得到目標(biāo)化合物wy-17為淡黃色固體。收率45.4%。mp:126-128℃。1hnmr{400mhz,cdcl3(tms),δ(ppm)}:1.84-1.86(m,2h),1.98-199(m,2h),2.75(s,3h),314-3.16(m,2h),3.42-3.45(m,4h),3.51-3.54(m,2h),3.74(s,3h),6.92-6.95(d,1h),7.04-7.07(m,1h),7.12-7.14(d,1h),7.35-7.37(dd,1h),7.42-7.46(m,1h),8.03-8.06(dd,1h),8.24-8.25(d,1h)。實(shí)施例19：抗病毒活性實(shí)驗(yàn)1.材料1.1毒株甲型流感病毒（a/pr/8/34h1n1），實(shí)驗(yàn)室傳代保存。1.2細(xì)胞模型狗腎細(xì)胞系mdck,本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。培養(yǎng)條件:dmem+10%胎牛血清，37℃，5%co2。1.3送試樣品自供樣品，樣品溶解的溶劑和濃度見表2。2.方法2.1藥物的細(xì)胞毒性檢測采用了alamarblue?（invitrogen）試劑盒檢測藥物對細(xì)胞的毒性作用。實(shí)驗(yàn)原理：alamarblue?是一種氧化還原指示劑，能根據(jù)代謝活性產(chǎn)生吸光度變化和熒光信號。alamarblue?易溶于水,其氧化形式進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)線粒體酶還原產(chǎn)生可測量的熒光及顏色變化，用于細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖的定量分析以及體外細(xì)胞毒性研究。這種測定是基于具有代謝活性的細(xì)胞將試劑轉(zhuǎn)換成熒光和比色指示劑的能力，受損和無活性細(xì)胞具有較低的天然代謝活性，對應(yīng)的信號較低。因此熒光信號強(qiáng)弱，可以反映細(xì)胞活性的高低。方法步驟：mdck細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后備用。用細(xì)胞維持液（dmem+2%血清）將藥物從起始濃度連續(xù)3倍梯度稀釋9個(gè)梯度，每梯度2個(gè)復(fù)孔。加藥培養(yǎng)72h后，光鏡下觀察藥物引起的細(xì)胞病變效應(yīng)（cpe），加入alamarblue?，37℃孵育2h，熒光檢測alamarblue?的還原情況，激發(fā)光570nm，發(fā)射光595nm。細(xì)胞活性（%）=（樣品孔-空白對照）/（細(xì)胞對照-空白對照）*100%2.2藥物對流感病毒的抑制試驗(yàn)鑒于基于病毒引起的細(xì)胞病變效應(yīng)檢測不夠靈敏和不便于定量分析。我們采用檢測流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性來代表病毒的復(fù)制水平，是更為準(zhǔn)確和可定量的方法。實(shí)驗(yàn)原理：流感病毒神經(jīng)氨酸酶（na），又稱唾液酸酶，是一種表面糖蛋白，具有酶活性，對a、b型流感病毒的復(fù)制有重要作用。它可以裂解細(xì)胞表面流感病毒受體末端的唾液酸殘基，幫助子代病毒粒子的釋放，并防止病毒粒子聚集，促進(jìn)病毒的擴(kuò)散。神經(jīng)氨酸酶是抗流感病毒藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室采用munana作為底物檢測流感病毒na活性。munana（4-methylumbelliferyl-α-n-acetyl-neuraminate）是流感病毒na的特異性底物，在na作用下產(chǎn)生的催化產(chǎn)物在355nm激發(fā)光照射下，可以產(chǎn)生460nm熒光，熒光強(qiáng)度的變化，可以靈敏反映神經(jīng)氨酸酶活性。病毒感染細(xì)胞并加藥培養(yǎng)一定時(shí)間后，取培養(yǎng)液上清進(jìn)行神經(jīng)氨酸酶活性檢測，在反應(yīng)底物過量時(shí)，酶促反應(yīng)的速度與酶濃度是呈正比的，所以根據(jù)此原理可以檢測na酶活來反映上清中病毒粒子的滴度方法步驟：（1）細(xì)胞鋪板：將mdck細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～14h后備用。（2）病毒感染細(xì)胞：藥物從2倍最高測試濃度起連續(xù)3倍梯度稀釋9個(gè)梯度；將孔板中培養(yǎng)基棄去，同時(shí)加入藥物和病毒液于細(xì)胞孔中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1h后，棄上清培養(yǎng)基，pbs洗滌后，再次加入梯度稀釋藥物。置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，輔以觀察細(xì)胞病變（cpe）。取培養(yǎng)液上清進(jìn)行神經(jīng)氨酸酶活力檢測。篩選中設(shè)兩個(gè)平行孔。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照孔(正常細(xì)胞)，酶活對照孔（病毒感染后未加藥物孔），陽性藥物對照孔（感染后加利巴韋林）。（3）神經(jīng)氨酸酶活性檢測：實(shí)驗(yàn)操作：96孔黑色微量板中加入20μl底物（munana），吸取病毒培養(yǎng)液40μl上清加入孔板中，避光置于37℃孵育60min，加入100μl終止液/孔終止反應(yīng)，多功能檢測儀上測定熒光值。激發(fā)波長為：355nm，發(fā)射波長485nm。計(jì)算各檢測孔中na被抑制率。抑制率（%）=100-（樣品孔-空白對照）/（酶活對照-空白對照）*100%3.結(jié)果3.1藥物樣品對細(xì)胞的毒性檢測及對神經(jīng)氨酸酶抑制活性檢測藥物樣品稀釋所用溶劑，最高溶解濃度，最高測試濃度，cc50，ec50以及si(選擇指數(shù))如表2所示。不同孔板中陽性藥物利巴韋林的重復(fù)性如圖1所示。圖中顯示陽性藥物利巴韋林有較好的重復(fù)性。表2各藥物樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品編號溶劑最高測試濃度（μg/ml）cc50（μm）ec50（μm）siwy-01dmso10.4211.1839.5721.17wy-02dmso20.83nd0.961>46.29wy-03dmso20.83ndnd-wy-04dmso125.00ndnd-wy-05dmso20.83nd1.377>29.98wy-06dmso125.00nd0.725>382.50wy-07dmso125.00nd5.060>47.21wy-08dmso10.42ndnd-wy-09dmso94.37nd3.847>51.99wy-10dmso20.83ndnd-wy-11dmso125ndnd-wy-12dmso20.83ndnd-wy-13dmso13.07nd4.647>5.38wy-14dmso96.7815.270.74020.63wy-15dmso47.19nd24.906>4.02wy-16dmso106.59nd5.278>37.89wy-17dmso102.59nd2.490>80.32ribavirindmso175μm~199.6μm31.31μm6.37“nd”：表示未檢測到明顯細(xì)胞毒性；未檢測到病毒抑制活性；“-”：表示無選擇指數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：化合物的活性已經(jīng)達(dá)到較高水平，本發(fā)明所述的式i衍生物中具有代表性的化合物有顯著的抗病毒活性。本發(fā)明并不局限于前述的具體實(shí)施方式。本發(fā)明擴(kuò)展到任何在本說明書中披露的新特征或任何新的組合，以及披露的任一新的方法或過程的步驟或任何新的組合。當(dāng)前第1頁12