【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種啟動(dòng)子、重組間質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

骨關(guān)節(jié)炎(oa，osteoarthritis)又名退行性骨關(guān)節(jié)炎，為關(guān)節(jié)軟骨的退行性變，并在關(guān)節(jié)邊緣有骨刺形成。隨著人類平均壽命的延長(zhǎng),骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率越來越高。炎癥會(huì)導(dǎo)致軟骨的退變，而軟骨退變又能刺激炎癥的惡化，從而使得病情愈加嚴(yán)重。

治療骨關(guān)節(jié)炎的方法主要有物理治療和藥物治療，物理治療主要針對(duì)輕度患者，達(dá)到減輕疼痛和維持關(guān)節(jié)功能的目的。藥物治療采用的藥物主要有：鎮(zhèn)痛藥，cox-2抑制劑，類固醇，滑液補(bǔ)充劑等。然而，這些治療方法的效率有限，特異性不明顯，不能有效改善病情。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有骨關(guān)節(jié)炎治療方法效果較差的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種啟動(dòng)子、重組間質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題的一技術(shù)方案是提供一種啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子的序列如seqidno:2所示。

本發(fā)明還提供一種重組間質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，包括：提供tnfα抗體基因及上述的啟動(dòng)子，構(gòu)建得到慢病毒表達(dá)質(zhì)粒；其中，所述tnfα抗體基因的序列如seqidno:1所示；將所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝，獲得病毒液；在所述病毒液中感染間充質(zhì)干細(xì)胞，得到所需的重組間質(zhì)干細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建包括：步驟s11：將所述tnfα抗體基因和所述啟動(dòng)子克隆進(jìn)穿梭質(zhì)粒pgfp，獲得穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp；步驟s12：以所述穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp作為載體，加入所述tnfα抗體基因得到tnfα-ab質(zhì)粒載體；步驟s13：轉(zhuǎn)化所述tnfα-ab質(zhì)粒載體并進(jìn)行質(zhì)粒抽提得到所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。

優(yōu)選地，所述tnfα抗體基因通過采用核酸內(nèi)切酶xho1和核酸內(nèi)切酶xba1對(duì)所述穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp進(jìn)行雙酶切得到。

優(yōu)選地，所述雙酶切的時(shí)間為3-24h。

優(yōu)選地，所述步驟s12為利用tnfα抗體基因以及穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得tnfα-ab質(zhì)粒載體；所述連接反應(yīng)的反應(yīng)體系中所述穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp的濃度為2-3ng/μl，所述tnfα抗體基因摩爾數(shù)為所述穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp摩爾數(shù)的2-4倍。

優(yōu)選地，所述步驟s12還包括在反應(yīng)體系中加入dna連接酶和連接緩沖液；所述反應(yīng)體系中dna連接酶的體積百分比為2-3％，連接緩沖液的體積百分比為8-12％。

優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化所述tnfα-ab質(zhì)粒載體具體包括以下步驟：將所述tnfα-ab質(zhì)粒載體加入大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，混合均勻后得到混合溶液；將該混合溶液冰浴20-50min，經(jīng)40-45℃熱休克作用30-90s后再冰浴1-4min；然后將混合溶液置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到含有所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的培養(yǎng)液。

本發(fā)明還提供一種重組間質(zhì)干細(xì)胞，該重組間質(zhì)干細(xì)胞整合有啟動(dòng)子和tnfα抗體基因；所述啟動(dòng)子的序列如seqidno:2所示，所述tnfα抗體基因的序列如seqidno:1所示。

本發(fā)明還提供一種重組間質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，將上述重組間質(zhì)干細(xì)胞用于制備治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所提供的一種啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可以在炎癥因子tnfα存在的情況下正向激活表達(dá)tnfα抗體基因，利用該啟動(dòng)子能得到用于治療骨關(guān)節(jié)炎且治療效果好的重組間質(zhì)干細(xì)胞。

本發(fā)明還提供的一種重組間質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，利用上述啟動(dòng)子制備得到重組間質(zhì)干細(xì)胞，該重組間質(zhì)干細(xì)胞在炎癥環(huán)境下會(huì)被炎癥因子tnfα激活，能穩(wěn)定地結(jié)合到炎癥位點(diǎn)，從而增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的抗炎與免疫調(diào)節(jié)能力，因而能用于治療骨關(guān)節(jié)炎且治療效果好。

本發(fā)明還提供一種重組間質(zhì)干細(xì)胞，該重組間質(zhì)干細(xì)胞中整合有啟動(dòng)子和tnfα抗體基因，在炎癥環(huán)境下會(huì)被炎癥因子tnfα激活，能穩(wěn)定地結(jié)合到炎癥位點(diǎn)，從而增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的抗炎與免疫調(diào)節(jié)能力，因而能用于治療骨關(guān)節(jié)炎且治療效果好。

本發(fā)明還提供一種重組間質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，將上述重組間質(zhì)干細(xì)胞用于制備治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物，所得到的藥物治療骨關(guān)節(jié)炎的效果好。

【附圖說明】

圖1是本發(fā)明中重組間質(zhì)干細(xì)胞的制備方法的流程示意圖。

圖2是本發(fā)明中重組間質(zhì)干細(xì)胞的制備方法的步驟s1的流程示意圖。

圖3是本發(fā)明中穿梭質(zhì)粒pgfp的圖譜。

圖4是本發(fā)明中穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp的圖譜。

圖5是本發(fā)明中第三代慢病毒包裝質(zhì)粒的圖譜。

圖6是本發(fā)明中加入翻譯序列和綠色熒光蛋白序列的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖7是本發(fā)明中慢病毒感染msc后的效率鑒定圖。

圖8是本發(fā)明中rt-pcr檢測(cè)msc在慢病毒感染后，tnfα-ab的表達(dá)情況。

圖9是westernblotting檢測(cè)細(xì)胞中tnfα-ab的表達(dá)情況。

圖10是he染色檢測(cè)經(jīng)治療后組織炎癥浸潤(rùn)情況是否改善。

圖11為elisa技術(shù)經(jīng)治療后炎癥小鼠脾臟細(xì)胞的增殖檢測(cè)。

圖12為elisa技術(shù)檢測(cè)經(jīng)治療后炎癥小鼠炎癥因子的表達(dá)。

圖13為real-timepcr技術(shù)檢測(cè)經(jīng)治療后炎癥小鼠mrna水平上炎癥因子的表達(dá)。

【具體實(shí)施方式】

為了使本發(fā)明的目的，技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施實(shí)例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例一

本發(fā)明提供一種啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子的序列如seqidno:2所示。該啟動(dòng)子可以在炎癥因子tnfα存在的情況下正向激活表達(dá)tnfα抗體基因，利用該啟動(dòng)子能得到用于治療骨關(guān)節(jié)炎且治療效果好的重組間質(zhì)干細(xì)胞。

本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子在炎癥因子tnfα存在的情況下正向激活表達(dá)tnfα抗體基因的作用機(jī)理是：炎癥因子tnfα有多個(gè)下游信號(hào)通路，其中最重要的一個(gè)下游信號(hào)通路是nf-κb轉(zhuǎn)錄因子的激活；而炎癥因子tnfα激活nf-κb通路有眾多信號(hào)分子參與，如tnfr相關(guān)因子、受體相互作用蛋白(rip，receptor-interactingprotein)、絲裂原活化蛋白激酶3(map3k，mitogen-activatedproteinkinaseki-nase3)、ikk復(fù)合物、白介素10(il-10)等；本發(fā)明在眾多信號(hào)分子中篩選出與炎癥因子tnfα關(guān)系密切的il-10，通過將il-10與cag啟動(dòng)子相結(jié)合從而得到所述啟動(dòng)子。因此當(dāng)炎癥因子tnfα表達(dá)升高時(shí)，可激活il-10的表達(dá)，據(jù)此設(shè)計(jì)的啟動(dòng)子可正向激活表達(dá)tnfα抗體基因。

實(shí)施例二

如圖1所示，一種重組間質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，包括：

步驟s1：提供tnfα抗體基因及上述的啟動(dòng)子，構(gòu)建得到慢病毒表達(dá)質(zhì)粒；其中，所述tnfα抗體基因的序列如seqidno:1所示；

步驟s2：將所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝，獲得病毒液；

步驟s3：在所述病毒液中感染間充質(zhì)干細(xì)胞，得到所需的重組間質(zhì)干細(xì)胞。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)可以直接購(gòu)買，或者是從動(dòng)物骨髓中進(jìn)行提取。在本發(fā)明的具體操作中是從c57/bl6小鼠骨髓中提取得到msc，c57/bl6小鼠購(gòu)于香港大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

利用上述啟動(dòng)子制備得到重組間質(zhì)干細(xì)胞，該重組間質(zhì)干細(xì)胞在炎癥環(huán)境下會(huì)被炎癥因子tnfα激活，能穩(wěn)定地結(jié)合到炎癥位點(diǎn)，從而增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的抗炎與免疫調(diào)節(jié)能力，因而能用于治療骨關(guān)節(jié)炎且治療效果好。

優(yōu)選的，請(qǐng)一并參閱圖2，步驟s1也即所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建包括：

步驟s11：將所述tnfα抗體基因和所述啟動(dòng)子克隆進(jìn)穿梭質(zhì)粒pgfp，獲得穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp；

步驟s12：以所述穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp作為載體，加入所述tnfα抗體基因得到tnfα-ab質(zhì)粒載體；

步驟s13：轉(zhuǎn)化所述tnfα-ab質(zhì)粒載體并進(jìn)行質(zhì)粒抽提得到所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。

通過將tnfα抗體基因和啟動(dòng)子克隆進(jìn)穿梭質(zhì)粒pgfp，并以獲得的穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp為載體，再加入tnfα抗體基因，從而得到穩(wěn)定的含有tnfα抗體基因和啟動(dòng)子的tnfα-ab質(zhì)粒載體；并且能讓所述啟動(dòng)子工作及表達(dá)tnfα抗體基因；經(jīng)轉(zhuǎn)化tnfα-ab質(zhì)粒載體并進(jìn)行質(zhì)粒抽提得到所需的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。

其中穿梭質(zhì)粒pgfp由廣州復(fù)能基因有限公司提供，所述穿梭質(zhì)粒pgfp的圖譜如圖3所示。穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp的圖譜如圖4所示，圖4中的il-cagpromoter即為所述啟動(dòng)子。

優(yōu)選地，所述tnfα抗體基因通過采用核酸內(nèi)切酶xho1和核酸內(nèi)切酶xba1對(duì)所述穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp進(jìn)行雙酶切得到。利用所述穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp獲得tnfα抗體基因，保證在整個(gè)制備過程中所用的tnfα抗體基因的一致性，從而保證最終所得的重組間質(zhì)干細(xì)胞的性能穩(wěn)定性。并且根據(jù)穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp的基因序列，對(duì)內(nèi)切酶進(jìn)行選擇，即選用核酸內(nèi)切酶xho1和核酸內(nèi)切酶xba1進(jìn)行雙酶切，從而保證得到完整且穩(wěn)定的tnfα抗體基因。當(dāng)然在另外一些實(shí)施例中，由于已經(jīng)給出tnfα抗體基因的序列，也可以直接合成或者利用pcr擴(kuò)增技術(shù)得到所述tnfα抗體基因。

優(yōu)選地，所述雙酶切的時(shí)間為3-24h。這樣能保證酶切的效果，即酶切完全。其中更好的是雙酶切的時(shí)間為6-12h。

優(yōu)選地，所述步驟s12為利用tnfα抗體基因以及穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得tnfα-ab質(zhì)粒載體；所述連接反應(yīng)的反應(yīng)體系中所述穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp的濃度為2-3ng/μl，所述tnfα抗體基因摩爾數(shù)為所述穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp摩爾數(shù)的2-4倍。

通過確定穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp的濃度以及tnfα抗體基因與穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp的摩爾數(shù)之間的用量比，所述連接反應(yīng)較為穩(wěn)定，且能有效減少反應(yīng)產(chǎn)物中的雜質(zhì)，在這里雜質(zhì)指的是除所需的tnfα-ab質(zhì)粒載體以外的物質(zhì)。更好的是，所述穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp的濃度為2.5ng/μl，所述tnfα抗體基因摩爾數(shù)為所述穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp摩爾數(shù)的3倍。

優(yōu)選地，所述步驟s12還包括在反應(yīng)體系中加入dna連接酶和連接緩沖液；所述反應(yīng)體系中dna連接酶的體積百分比為2-3％，連接緩沖液的體積百分比為8-12％。通過確定dna連接酶及連接緩沖液的體積百分比，保證反應(yīng)的快速性和穩(wěn)定性。其中，dna連接酶為t4dnaligase，連接緩沖液為10×ligationbuffer；在較優(yōu)的實(shí)施例中，所述反應(yīng)體系中dna連接酶的體積百分比為2.5％，連接緩沖液的體積百分比為10％。

具體的，以連接反應(yīng)的反應(yīng)體系總體積是20μl為例，在反應(yīng)體系中包括50ng穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp、2μl10×ligationbuffer、0.5μlt4dnaligase，然后加雙蒸水或超純水至20μl即可。

優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化所述步驟s13中tnfα-ab質(zhì)粒載體具體包括以下步驟：將所述tnfα-ab質(zhì)粒載體加入大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，混合均勻后得到混合溶液；將該混合溶液冰浴20-50min，經(jīng)40-45℃熱休克作用30-90s后再冰浴冷卻1-4min；然后將混合溶液置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到含有所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的培養(yǎng)液。首先，通過選用大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，既能保證tnfα-ab質(zhì)粒載體的表達(dá)，并且不會(huì)對(duì)tnfα-ab質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化造成負(fù)面影響，該處的負(fù)面影響指的是大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中不存在能降解tnfα-ab質(zhì)粒載體的特異的內(nèi)切酶體系，以及不對(duì)tnfα-ab質(zhì)粒載體的dna進(jìn)行修飾等。其次，通過將混合溶液冰浴20-50min后熱休克，緊接著置于冰上1-4min的操作，保證轉(zhuǎn)化效率。

具體的，可以直接將連接反應(yīng)后得到的反應(yīng)產(chǎn)物直接加入大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中。如，取12μl所述反應(yīng)產(chǎn)物加到50μl大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；再進(jìn)行熱休克，42℃金屬浴50s，迅速再次冰浴1-2min，加入500μl已溫育至37℃無抗性的lb培養(yǎng)基；在37℃，200rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)1h，培養(yǎng)后以8000rpm的轉(zhuǎn)速離心，去部分上清后涂布于含腺苷一磷酸(amp，adenosinemonophosphate)的lb平板上，37℃下倒置培養(yǎng)過夜；挑取單克隆菌落于無抗性的lb培養(yǎng)基中，按體積比1:300加入amp，于37℃，200rpm的條件下?lián)u床培養(yǎng)12h，得到培養(yǎng)液。

在轉(zhuǎn)化得到所述培養(yǎng)液后進(jìn)行質(zhì)粒抽提即可獲得所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。質(zhì)粒抽提是為了去除rna、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，得到相對(duì)純凈的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。具體的，可以是使用質(zhì)粒小提試劑盒l(wèi)ot#l0802進(jìn)行質(zhì)粒抽提，步驟如下：

1)柱平衡，吸附柱加入500μl平衡液，12000rpm離心1min；

2)取過夜的培養(yǎng)液3ml，分兩次加入1.5mlep管中，12000rpm離心1min，盡量吸出上清液，收集菌體細(xì)胞；

3)向沉淀中加250μl溶液p1，用槍徹底懸浮沉淀；

4)加入250μl溶液p2，溫和上下翻轉(zhuǎn)6～8次，使菌體充分溶解；

5)加入350μl溶液p3，立即溫和上下翻轉(zhuǎn)6～8次直至出現(xiàn)絮狀沉淀，12000rpm離心10min；

6)將上清加入吸附柱中，12000rpm離心30s，重復(fù)該步操作一次；

7)加入600μl的漂洗液，12000rpm離心30s，重復(fù)該步操作一次；

8)12000rpm離心2min，去除漂洗液，室溫開蓋晾干；

9)加入40μlddh2o洗脫，靜置2min中，12000rpm離心2min，得到慢病毒表達(dá)質(zhì)粒tnfα-gfp。

其中，所用的平衡液、溶液p1、溶液p2、溶液p3及漂洗液均為質(zhì)粒小提試劑盒l(wèi)ot#l0802內(nèi)提供。

進(jìn)一步的是，在步驟s2中，慢病毒包裝是將所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒與包裝載體一同轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，即可得到所需病毒液。具體的可以是選用239ft細(xì)胞作為包裝細(xì)胞，并且使用lipofectamine2000試劑盒進(jìn)行慢病毒包裝。優(yōu)選地，在進(jìn)行慢病毒包裝，也即轉(zhuǎn)染前24h，消化293ft細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以5×10⁶接種于10cm培養(yǎng)皿中，使其轉(zhuǎn)染時(shí)293ft細(xì)胞融合率達(dá)80％～90％。

然后可以按照lipofectamine2000說明書的步驟，將慢病毒表達(dá)質(zhì)粒tnfα-gfp及穿梭質(zhì)粒pgfp分別加入慢病毒包裝質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293ft。質(zhì)粒用量分別為(10μgpgfp+6.52μgpmdl+2.52μgprsv-rev+3.52μgpmd2.g)及(36μgtnfα-gfp+12μgpmdl+6μgprsv-rev+18μgpmd2.g)。轉(zhuǎn)染48h后，收獲包裝細(xì)胞293ft產(chǎn)生的病毒上清，置于4℃溫度下暫存。加入新鮮293ft培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24h，第二次收集病毒上清，與第一次收集的病毒上清混合，經(jīng)0.45μm濾膜過濾并按照peg-it說明書將病毒濃縮。分裝濃縮后的病毒液，置于-80℃溫度下保存。

其中，慢病毒包裝質(zhì)粒為addgene公司提供的第三代慢病毒包裝質(zhì)粒，該第三代慢病毒包裝質(zhì)粒的圖譜如圖5所示。

如前文所述，間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)可以是從動(dòng)物骨髓中進(jìn)行提取。msc的提取可以是通過骨髓沖洗法獲?。和ㄟ^貼壁培養(yǎng)法去雜細(xì)胞，大約傳代4次后，顯微鏡下可見msc為較規(guī)則的長(zhǎng)梭形，排列有方向性，呈現(xiàn)漩渦狀、輻射狀生長(zhǎng)趨勢(shì)。

在步驟s3中間充質(zhì)干細(xì)胞的感染具體可以為：消化msc細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以1×10⁶每孔的密度接種于6孔板中，將病毒上清及polybrene(終濃度為8μg/ml)加入6孔板中。

實(shí)施例三

一種重組間質(zhì)干細(xì)胞，整合有啟動(dòng)子和tnfα抗體基因；所述啟動(dòng)子的序列如seqidno:2所示，所述tnfα抗體基因的序列如seqidno:1所示。即采用上述重組間質(zhì)干細(xì)胞的制備方法制備得到。該重組間質(zhì)干細(xì)胞中整合有啟動(dòng)子和tnfα抗體基因，在炎癥環(huán)境下會(huì)被炎癥因子tnfα激活，能穩(wěn)定地結(jié)合到炎癥位點(diǎn)，從而增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的抗炎與免疫調(diào)節(jié)能力，因而能用于治療骨關(guān)節(jié)炎且治療效果好。

實(shí)施例四

一種重組間質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，將上述重組間質(zhì)干細(xì)胞用于制備治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物，所得到的藥物治療骨關(guān)節(jié)炎的效果好。所述重組間質(zhì)干細(xì)胞可以單獨(dú)給藥，或者以藥物組合物的形式給藥?？梢岳斫?，所述藥物組合物包含重組間質(zhì)干細(xì)胞和載體或賦形劑。其制劑形式取決于所選擇的給藥途徑，可以按照本領(lǐng)域熟知的常識(shí)進(jìn)行制造，所述重組間質(zhì)干細(xì)胞存在于細(xì)胞相容的介質(zhì)中，如0.9％生理鹽水中或制成緩控制劑等。

設(shè)置一個(gè)實(shí)驗(yàn)組、一個(gè)空載體對(duì)照組及一個(gè)空白對(duì)照組進(jìn)行測(cè)試。實(shí)驗(yàn)組為以本發(fā)明中利用所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒感染的msc，也就是進(jìn)行重組后得到的所述重組間質(zhì)干細(xì)胞，記為msc-tnfα-ab?？蛰d體對(duì)照組為利用穿梭質(zhì)粒pgfp感染的msc，記為msce?？瞻讓?duì)照組為未進(jìn)行慢病毒感染的msc，記為msc。

并且為方便確認(rèn)通過所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒制得的病毒液中能成功感染所述間充質(zhì)干細(xì)胞，可以是在所述啟動(dòng)子中設(shè)計(jì)一段翻譯序列及熒光蛋白序列。如圖6所示，在所述啟動(dòng)子中加入翻譯序列(ires)和綠色熒光蛋白序列(gfp，greenfluorescentprotein)。這樣在間充質(zhì)干細(xì)胞感染成功后的細(xì)胞，通過顯微鏡可以觀察到細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。具體的，在感染48h后在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(gfp)的表達(dá)情況。即在488nm波長(zhǎng)激發(fā)光下，可見絕大多數(shù)細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。

一、慢病毒感染后的效率鑒定

對(duì)上述實(shí)驗(yàn)組、空載體對(duì)照組和空白對(duì)照組進(jìn)行感染測(cè)試，結(jié)果如圖7所示，在msc-tnfα-ab和msce中出現(xiàn)綠色熒光蛋白(gfp)的表達(dá)，在msc中無gfp的表達(dá)。

二、tnfα抗體基因(tnfα-ab)的表達(dá)鑒定

對(duì)上述實(shí)驗(yàn)組、空載體對(duì)照組和空白對(duì)照組進(jìn)行tnfα抗體基因(tnfα-ab)的表達(dá)鑒定。具體操作為：

分別收集1×10⁶的msc，msce及msc-tnfα-ab，按照qiagen公司的rneasyminikit(目錄號(hào)74104)提取細(xì)胞總rna，根據(jù)takaoa公司的primescriptfirststoandcdnasynthesiskit(目錄號(hào)6110a)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將總rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna，用takaoataq^tm(目錄號(hào)r001a)并以60℃為退火溫度進(jìn)行pcr。

pcr所用引物序列如下：

小鼠msc-tnfα-ab基因產(chǎn)物長(zhǎng)度(257bp)：

f：5’-gctagagtggctctcgca-3’(seqidno:3)

r：5’-cgaaggggcggaacttaa-3’(seqidno:4)

小鼠β-actin基因(genbank登錄號(hào)：nm_007393.3)(產(chǎn)物長(zhǎng)度448bp)：

f：5’-agagggaaatcgtgcgtgac-3’(seqidno:5)

r：5’-tgctggaaggtggacagtgag-3’(seqidno:6)

結(jié)果顯示，相比空白對(duì)照組msc以及空載體對(duì)照組msce，實(shí)驗(yàn)組msc-tnfα-ab病毒感染后的msc-tnfα-ab細(xì)胞中tnfα-ab表達(dá)水平顯著提高(圖8)，證明實(shí)驗(yàn)組msc-tnfα-ab病毒感染msc效果良好，可使其穩(wěn)定過表達(dá)tnfα-ab。

三、檢測(cè)構(gòu)建的msc-tnfα-ab可被炎癥因子tnfα特異調(diào)節(jié)啟動(dòng)

為檢測(cè)體外msc細(xì)胞培養(yǎng)中在加入炎癥因子tnfα后tnfα-ab的表達(dá)情況。

1.msc-tnfα-ab細(xì)胞培養(yǎng)：

msc-tnfα-ab細(xì)胞培養(yǎng)基為：在dmef/f12培養(yǎng)基中含有10％胎牛血清(fbs)，100u/ml青鏈霉素，1％非必須氨基酸，0.1％β-巰基乙醇，5ng/ml的egf，5ng/ml的fgf。

1)在進(jìn)行無菌培養(yǎng)前，將實(shí)驗(yàn)室所需材料高壓滅菌；紫外燈照射30min；穿戴細(xì)胞間專用實(shí)驗(yàn)服和手套，用75％酒精擦拭雙手；顯微鏡下，觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞密度匯合至70％以上則需傳代，關(guān)閉紫外燈，打開風(fēng)機(jī)，同時(shí)用酒精棉球擦拭超凈臺(tái)，點(diǎn)燃酒精燈。

2)在打開培養(yǎng)皿蓋，去除細(xì)胞培養(yǎng)上清，pbs洗滌后，去除pbs。

3)將胰酶加入培養(yǎng)皿內(nèi)，在培養(yǎng)箱放置13min。顯微鏡下隨時(shí)觀察，見到細(xì)胞的突起消失，變圓時(shí)，立即加入等體積完全培養(yǎng)基終止消化。注意不要消化時(shí)間過長(zhǎng)，否則細(xì)胞會(huì)被胰酶消化掉。

4)終止后移液器輕輕吹打，使其從瓶壁上脫落分散到培養(yǎng)基中，吸取細(xì)胞懸液并轉(zhuǎn)移至ep管中，400xg離心3min。重懸細(xì)胞，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮图?xì)胞習(xí)性按不同比例分皿繼續(xù)培養(yǎng)。

5)傳代后觀察，傳代或換液24～48h，注意細(xì)胞是否被污染，污染的細(xì)胞培養(yǎng)液變渾濁，鏡下可見有大量菌絲或其他懸濁物。如果細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)特性改變，胞質(zhì)內(nèi)顆粒性物質(zhì)增多，盡管培養(yǎng)液不變渾濁，考慮可能有支原體污染。

2.westernblot檢測(cè)msc-tnfα-ab被炎癥因子tnfα激活情況

選取50μmol/l濃度的tnfα炎癥因子處理對(duì)數(shù)期的msc-tnfα-ab細(xì)胞，置于光鏡下觀察，細(xì)胞體外生長(zhǎng)良好，細(xì)胞呈梭形，輪廓清楚。為了確定tnfα-ab的表達(dá)情況，選取了msc組(對(duì)照組)，tnfα-組(未加炎癥因子tnfα刺激)和tnfα+組(已加炎癥因子tnfα刺激)同時(shí)進(jìn)行了總蛋白提取。所述蛋白提取使用ripa(sigma，目錄號(hào)r0278)試劑，按照說明書進(jìn)行。

調(diào)整細(xì)胞密度為70％-80％，pbs洗細(xì)胞兩遍，加入8ml無酚紅dmem(gibco，目錄號(hào)21063-029)。將細(xì)胞裂解后收集蛋白，所得細(xì)胞蛋白經(jīng)(boadford(bio-oad)，目錄號(hào)5000202)方法進(jìn)行定量后，用于常規(guī)westernblotting(蛋白質(zhì)印跡法)實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)靶蛋白為tnfα-ab，內(nèi)參照為β-actin(santacruz，目錄號(hào)sc-47778)，westernblot結(jié)果顯示tnfα+組tnfα-ab表達(dá)明顯(圖9)。

tnfα是重要的炎癥因子之一，加入tnfα炎癥因子處理msc-tnfα-ab細(xì)胞符合炎癥浸潤(rùn)的實(shí)際情況。實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)過本發(fā)明改造過的新型細(xì)胞系，在無tnfα炎癥因子刺激時(shí)，不會(huì)表達(dá)tnfα-ab。而在tnfα炎癥因子的刺激下，發(fā)揮其正反饋調(diào)節(jié)上調(diào)tnfα-ab的表達(dá)非常明顯，這說明本發(fā)明的細(xì)胞系msc-tnfα-ab達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

四、he染色鑒定炎癥組織

小鼠骨關(guān)節(jié)炎是經(jīng)典的移植模型，本實(shí)施例應(yīng)用該移植模型。

1.制備骨關(guān)節(jié)炎炎癥浸潤(rùn)小鼠模型

將純化的天然膠原溶于11m的醋酸制成濃度為1mg/ml的溶液，與等量的福氏佐劑或不完全佐劑混合成穩(wěn)定的乳劑；用1ml乳劑分4～6個(gè)部位注射小鼠背部皮內(nèi)，注射部位會(huì)出現(xiàn)小潰瘍(在7～10天后自愈)；21天后，將15mg膠原溶于15ml1m的醋酸中，注入小鼠腹腔再次免疫。

初次注射后14～60天后，出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫，通常發(fā)生于關(guān)節(jié)遠(yuǎn)端，后足踝關(guān)節(jié)是最常累積的部位。急性期病理改變可分為兩期，免疫10天后，關(guān)節(jié)內(nèi)只有一些纖維沉積物而滑膜細(xì)胞無改變；12天后，肉眼可見踝關(guān)節(jié)紅腫，膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫，光鏡下滑膜細(xì)胞增多，滑膜層數(shù)增至3～7層，并向軟骨骨面爬行，滑膜及滑膜下組織有纖維沉積。電鏡下則見滑膜細(xì)胞變圓，細(xì)胞間接觸減少，絲狀偽足增多，細(xì)胞內(nèi)溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增大、增多；19天后進(jìn)入第二期，增生的滑膜由6～10μm增厚至200～250μm，形成血管翳，其中有大量單核細(xì)胞、多形核巨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，在微血管周圍形成微膿腫，可見到單核細(xì)胞侵入軟骨連接處的軟組織；6～7周后，炎癥進(jìn)入慢性期，水腫仍存在，浸潤(rùn)的細(xì)胞以cd+4的t細(xì)胞為主，關(guān)節(jié)內(nèi)出現(xiàn)瘢痕，顆粒狀增生組織，軟骨及軟骨下骨被破壞，最后導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎形成。

2.移植檢測(cè)

分別將2×106msc-tnfα-ab，msc，以及等體積的pbs(control組)移植到患處。一周以后將小鼠麻醉，頸椎脫臼處死，采集小鼠組織，4％多聚甲醛固定后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋和he染色，觀察移植部位細(xì)胞的保存情況和免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。he染色分析顯示，control組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。msc-tnfα-ab組明顯降低了炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，mscs組炎癥緩解情況介于兩組之間，隨機(jī)選取每只受體小鼠的三張切片并在高倍視野下計(jì)數(shù)(400倍)，統(tǒng)計(jì)受體小鼠的炎癥細(xì)胞數(shù)。

結(jié)果顯示，pbs組浸潤(rùn)的平均炎癥細(xì)胞數(shù)為235±70.4，msc-tnfα-ab組浸潤(rùn)的平均炎癥細(xì)胞數(shù)為103.4±29.6，mscs組浸潤(rùn)的平均炎癥細(xì)胞數(shù)為112.8±15.2。該數(shù)據(jù)表明，msc-tnfα-ab移植組更明顯的降低炎癥反應(yīng)，緩解炎癥癥狀，已經(jīng)達(dá)到本發(fā)明的預(yù)期治療效果(圖10)。

五、炎癥因子變化檢測(cè)

本發(fā)明采集了受體小鼠脾臟，分離小鼠脾臟細(xì)胞進(jìn)行了脾細(xì)胞增殖檢測(cè)，cd4+t細(xì)胞，cd3+t細(xì)胞，th1以及th2細(xì)胞亞群分析檢測(cè)，以及炎癥因子mrna水平和血清中常規(guī)炎癥因子蛋白水平的檢測(cè)。

將小鼠脾細(xì)胞體外培養(yǎng)72h，在到達(dá)12h前，加入1×brdu。并進(jìn)行brdu和mtt檢測(cè)。結(jié)果如圖11所示，圖11中(a)為進(jìn)行brdu檢測(cè)的450nm波長(zhǎng)得到的光密度(od值)，圖11中(b)為進(jìn)行mtt檢測(cè)的570nm波長(zhǎng)得到的光密度(od值)。結(jié)果顯示：在細(xì)胞增殖方面，control組炎癥細(xì)胞增殖明顯，msc-tnfα-ab組具有較低的增殖水平，msc組處于兩者之間。這表明mscs-tnfab能夠有效的抑制炎癥細(xì)胞的增殖情況(圖11)。

本發(fā)明分析檢測(cè)脾細(xì)胞種t細(xì)胞的亞群變化。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，msc-tnfα-ab組治療的受體小鼠脾細(xì)胞種th細(xì)胞和th2以及整體cd4+t細(xì)胞亞群比例明顯降低，結(jié)果表示，msc-tnfα-ab治療明顯抑制了小鼠體內(nèi)t細(xì)胞數(shù)目，降低了th1細(xì)胞和th2細(xì)胞亞群比例.

為了進(jìn)一步確定炎癥細(xì)胞的表達(dá)情況，本發(fā)明檢測(cè)是否整體t細(xì)胞的比例有所降低，cd3是t細(xì)胞的表面標(biāo)記物，本發(fā)明檢測(cè)了被治療小鼠脾細(xì)胞cd3+的t細(xì)胞比例以及foxp3的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg)。結(jié)果顯示，msc-tnfα-ab組cd3t細(xì)胞比例明顯降低，由23.1％下降至17.4％，treg比例明顯上升，由2.9％上升至4.32％。以上結(jié)果表明，msc-tnfα-ab能夠有效抑制t細(xì)胞比例，促進(jìn)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞增加。此外本發(fā)明通過real-timepcr和elisa技術(shù)分別檢測(cè)了脾臟和血清中常規(guī)炎癥因子白介素2(il-2)，白介素4(il-4)，il-10，γ干擾素(ifn-γ)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(tgf-β)和foxp3的表達(dá)；即圖12中(a)為利用elisa技術(shù)檢測(cè)得到的il-2濃度，圖12中(b)為利用elisa技術(shù)檢測(cè)得到的il-4濃度，圖12中(c)為利用elisa技術(shù)檢測(cè)得到的il-10濃度，圖12中(d)為利用elisa技術(shù)檢測(cè)得到的ifn-γ濃度，圖12中(e)為利用elisa技術(shù)檢測(cè)得到的foxp3濃度。elisa實(shí)驗(yàn)使用試劑盒(uscn，目錄號(hào)e91866mu)，按照說明書進(jìn)行。其中il-2，ifn-γ為th1細(xì)胞炎癥因子，tgf-β能夠有效促進(jìn)t細(xì)胞向treg分化并誘導(dǎo)treg表達(dá)foxp3和il-10。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，msc-tnfα-ab抑制了血清中il-2，il-4的表達(dá)，促進(jìn)了il-10，ifn-γ和tgf-β1的表達(dá)(圖12)。

在mrna水平上，msc-tnfα-ab組抑制了il-2，il-4的表達(dá)，促進(jìn)了il-10，foxp3和tgf-β1的表達(dá)(圖13)。具體的，圖13中(a)為il-2的相對(duì)mrna水平，圖13中(b)為il-4的相對(duì)mrna水平，圖13中(c)為il-10的相對(duì)mrna水平，圖13中(d)為foxp3的相對(duì)mrna水平，圖13中(e)為ifn-γ的相對(duì)mrna水平，圖13中(a)為il-2的相對(duì)mrna水平，圖13中(a)為tgf-β1的相對(duì)mrna水平。

以上結(jié)果表明，msc-tnfα-ab治療抑制了促炎癥因子的表達(dá)和釋放，促進(jìn)抑炎癥因子的表達(dá)和釋放。

作為一種新型干細(xì)胞治療方法，本發(fā)明構(gòu)建的新型細(xì)胞系msc-tnfα-ab可明顯減緩炎癥反應(yīng)及抑制多種炎癥因子，為骨關(guān)節(jié)炎的炎癥浸潤(rùn)反應(yīng)起到了有效的緩解作用。

上述實(shí)驗(yàn)中所需試劑見表1。

表1慢病毒包裝質(zhì)粒及穿梭質(zhì)粒信息

上述實(shí)驗(yàn)中293ft及小鼠骨髓msc培養(yǎng)基成分見表2。

表2慢病毒制備及msc感染所需的試劑信息

上述實(shí)驗(yàn)中293ft及小鼠骨髓msc培養(yǎng)基成分見表3。

表3293ft細(xì)胞及小鼠骨髓msc培養(yǎng)基配方

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的一種啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子的序列如seqidno:2所示。該啟動(dòng)子可以在炎癥因子tnfα存在的情況下正向激活表達(dá)tnfα抗體基因，利用該啟動(dòng)子能得到用于治療骨關(guān)節(jié)炎且治療效果好的重組間質(zhì)干細(xì)胞。

本發(fā)明還提供一種重組間質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，包括：提供tnfα抗體基因及上述的啟動(dòng)子，構(gòu)建得到慢病毒表達(dá)質(zhì)粒；其中，所述tnfα抗體基因的序列如seqidno:1所示；將所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝，獲得病毒液；在所述病毒液中感染間充質(zhì)干細(xì)胞，得到所需的重組間質(zhì)干細(xì)胞。利用上述啟動(dòng)子制備得到重組間質(zhì)干細(xì)胞，該重組間質(zhì)干細(xì)胞在炎癥環(huán)境下會(huì)被炎癥因子tnfα激活，能穩(wěn)定地結(jié)合到炎癥位點(diǎn)，從而增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的抗炎與免疫調(diào)節(jié)能力，因而能用于治療骨關(guān)節(jié)炎且治療效果好。

進(jìn)一步的是，所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建包括：步驟s11：將所述tnfα抗體基因和所述啟動(dòng)子克隆進(jìn)穿梭質(zhì)粒pgfp，獲得穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp；步驟s12：以所述穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp作為載體，加入所述tnfα抗體基因得到tnfα-ab質(zhì)粒載體；步驟s13：轉(zhuǎn)化所述tnfα-ab質(zhì)粒載體并進(jìn)行質(zhì)粒抽提得到所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。通過將tnfα抗體基因和啟動(dòng)子克隆進(jìn)穿梭質(zhì)粒pgfp，并以獲得的穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp為載體，再加入tnfα抗體基因，從而得到穩(wěn)定的含有tnfα抗體基因和啟動(dòng)子的tnfα-ab質(zhì)粒載體；并且能讓所述啟動(dòng)子工作及表達(dá)tnfα抗體基因。

進(jìn)一步的是，所述步驟s12中的tnfα抗體基因通過采用核酸內(nèi)切酶xho1和核酸內(nèi)切酶xba1對(duì)所述穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp進(jìn)行雙酶切得到。利用所述穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp獲得tnfα抗體基因，保證在整個(gè)制備過程中所用的tnfα抗體基因的一致性，從而保證最終所得的重組間質(zhì)干細(xì)胞的性能穩(wěn)定性。并且根據(jù)穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp的基因序列，對(duì)內(nèi)切酶進(jìn)行選擇，即選用核酸內(nèi)切酶xho1和核酸內(nèi)切酶xba1進(jìn)行雙酶切，從而保證得到完整且穩(wěn)定的tnfα抗體基因。

進(jìn)一步的是，所述雙酶切的時(shí)間為3-24h。這樣能保證酶切的效果，即酶切完全。

進(jìn)一步的是，所述步驟s12為利用tnfα抗體基因以及穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得tnfα-ab質(zhì)粒載體；所述連接反應(yīng)的反應(yīng)體系中所述穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp的濃度為2-3ng/μl，所述tnfα抗體基因摩爾數(shù)為所述穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp摩爾數(shù)的2-4倍。通過確定穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp的濃度以及tnfα抗體基因與穿梭質(zhì)粒tnfα-gfp的摩爾數(shù)之間的用量比，所述連接反應(yīng)較為穩(wěn)定，且能有效減少反應(yīng)產(chǎn)物中的雜質(zhì)。

進(jìn)一步的是，所述步驟s12還包括在反應(yīng)體系中加入dna連接酶和連接緩沖液；所述反應(yīng)體系中dna連接酶的體積百分比為2-3％，連接緩沖液的體積百分比為8-12％。通過確定dna連接酶及連接緩沖液的體積百分比，保證反應(yīng)的快速性和穩(wěn)定性。

進(jìn)一步的是，轉(zhuǎn)化所述tnfα-ab質(zhì)粒載體為：將所述tnfα-ab質(zhì)粒載體加入大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，混合均勻后得到混合溶液；將該混合溶液冰浴20-50min，經(jīng)40-45℃熱休克作用30-90s后于零度環(huán)境下冷卻1-4min；然后將混合溶液置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到含有所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的培養(yǎng)液。首先，通過選用大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，既能保證tnfα-ab質(zhì)粒載體的表達(dá)，并且不會(huì)對(duì)tnfα-ab質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化造成負(fù)面影響。其次，通過將混合溶液冰浴20-50min后熱休克，緊接著置于冰上1-4min的操作，保證轉(zhuǎn)化效率。

本發(fā)明還提供一種重組間質(zhì)干細(xì)胞，整合有啟動(dòng)子和tnfα抗體基因；所述啟動(dòng)子的序列如seqidno:2所示，所述tnfα抗體基因的序列如seqidno:1所示。該重組間質(zhì)干細(xì)胞中整合有啟動(dòng)子和tnfα抗體基因，在炎癥環(huán)境下會(huì)被炎癥因子tnfα激活，能穩(wěn)定地結(jié)合到炎癥位點(diǎn)，從而增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的抗炎與免疫調(diào)節(jié)能力，因而能用于治療骨關(guān)節(jié)炎且治療效果好。

本發(fā)明還提供一種重組間質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，將上述重組間質(zhì)干細(xì)胞用于制備治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物。所得到的藥物治療骨關(guān)節(jié)炎的效果好。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則之內(nèi)所作的任何修改，等同替換和改進(jìn)等均應(yīng)包含本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>中基恒潤(rùn)國(guó)際控股有限公司

<120>啟動(dòng)子、重組間質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用

<150>hk16105540.6

<151>2016-05-16

<160>6

<210>1

<211>465

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgctacgctcttcgtcccagaactcatcggataagcctgtcgcgcacgtggtagccaat60

caccaagtggaagagcagctagagtggctctcgcaacgcgccaatgcgctactggctaac120

ggtatggacctgaaggacaatcaactggtagttccggcagacggtctatacctggtatac180

tccaggtgcttttcaagggacaaggttgccctgactatgtgctgctaacgcacactgttt240

cacggttcgctatttcgtaccaggaaaaggttaacctgctatccgcggttaaatccccgt300

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gtggagttttccaacttgaaaaaggcgaccagctttcagccgaagtaaatcttcccaagt420

catcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatg465

<210>2

<211>707

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>啟動(dòng)子

<400>2

tgggatctgagcttcttcgtgaaacacggggcagaggaggcaccagaactctcctctgac60

caactgccccacagcacacatatcctcaaaggatagtcttgaatacgtgatggaagaatt120

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ctaaggtgacttccgagtcagcaagaaatatcggacgttcaacccaggttgagtggagga240

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tgcactaccaaagccacaaggcagccttgcagaaaagagagctccat707

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gctagagtggctctcgca18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cgaaggggcggaacttaa

18

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

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<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

tgctggaaggtggacagtgag20