本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及補體因子H抑制劑及與之相關的用途，具體涉及一種補體因子H抑制劑以及該抑制劑在治療與補體因子H相關的疾病中的用途。

背景技術：

肺癌是一個重大的公共衛(wèi)生問題。當治療選擇有限且需要系統(tǒng)治療的晚期時大多數(shù)腫瘤仍被檢測出是發(fā)展時期。即使是可切除的早期肺癌患者也幾乎有50％的發(fā)展機會復發(fā)且在某些時候需要輔助治療。在過去幾年新療法已經(jīng)引入了靶向特異性途徑，并且在這些選擇個體中產(chǎn)生初始反應。然而，幾乎所有的患者都發(fā)展為耐藥，這很可能是由于腫瘤異質(zhì)性和克隆進化。

雖然已經(jīng)研究了針對惡性細胞的體液應答的激活，但是體液免疫本身尚未非常好被用于癌癥治療。已經(jīng)有針對超過100種不同腫瘤相關抗原(TAA)的循環(huán)抗體，但很少有與腫瘤階段或結果相關。某些宿主抗體可以具有抗腫瘤活性的潛力，但是由于許多可能的原因(包括抗體的低濃度或低親和力或無效的)，該能力尚未完全實現(xiàn)活化B淋巴細胞。顯然需要更多的和更廣泛的種類有效治療。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種用于治療癌癥的CFH抑制劑，所述CFH抑制劑是CFH特異性抗體?？贵w可以是多克隆或單克隆抗體。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述CFH抑制劑是CFH特異性單克隆抗體。所述CFH抑制劑識別體外還原形式的CFH。所述CFH抑制劑能夠增加腫瘤細胞上的C3b沉積并增加腫瘤細胞的補體依賴性溶解?；诖耍景l(fā)明公開了一種用于癌癥治療的治療方法。

本發(fā)明的CFH抑制劑包括：

(1)SEQ ID NO:2所示的重鏈CDR1、SEQ ID NO:3所示的重鏈CDR2、SEQ ID NO:4所示的重鏈CDR3；和/或

(2)SEQ ID NO:6所示的輕鏈CDR1、SEQ ID NO:7所示的輕鏈CDR2、SEQ ID NO:8所示的輕鏈CDR3。

作為本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的CFH抑制劑包括：

(1)重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；和/或

(2)輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

本發(fā)明的CFH抑制劑的的結合抗原是包括SCR19區(qū)的8個特定氨基酸PIDNGDIT(SEQ ID NO:10)的多肽。本發(fā)明的CFH抑制劑與上述多肽的結合域是PIDNGDIT。

在本發(fā)明的具體實施方案中，本發(fā)明的CFH抑制劑的的結合抗原是SCR19區(qū)氨基酸組成的多肽，序列如SEQ ID NO:9所示。但是本發(fā)明的CFH抑制劑的的結合抗原不限于SCR19區(qū)的多肽，只要包含PIDNGDIT序列的多肽均可以作為本發(fā)明的CFH抑制劑的結合抗原。

為了方便解釋以下抑制劑的功能變體，將上面所述的CHF抑制劑稱之為親代抑制劑。

本發(fā)明的CFH抑制劑可以是完整的免疫球蛋白分子，免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)類(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亞類。

本發(fā)明的CFH抑制劑還可以是抗原結合片段，包括但不限于Fab片段，F(xiàn)ab'片段，F(xiàn)ab'-SH片段，F(xiàn)(ab')²片段，F(xiàn)d片段，F(xiàn)v片段，雙抗體，單鏈Fv(scFv)僅含有一個輕鏈可變區(qū)的單鏈多肽，含有輕鏈可變區(qū)的三個CDR的單鏈多肽，僅含有一個重鏈可變區(qū)的單鏈多肽，含有一個重鏈可變區(qū)的三個CDR的單鏈多肽，重鏈可變區(qū)和VHH。

本發(fā)明的CFH抑制劑還包括前面所述的CFH抑制劑的功能變體，所述的功能變體包括但不限于一級結構序列基本相似、但是含有例如在親代抑制劑中未發(fā)現(xiàn)的體外或體內(nèi)化學和/或生物化學修飾的衍生物。這種修飾包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共價附著、脂質(zhì)或者脂質(zhì)衍生物的共價附著、交聯(lián)、二硫鍵形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。換句話說，親代抑制劑的氨基酸和/或核苷酸序列中的修飾不顯著影響或改變由所述核苷酸序列編碼的或者含有所述氨基酸序列的所述抑制劑的結合特性，即所述抑制劑仍能識別并結合其靶位。

所述功能變體可以具有保守序列修飾，包括氨基酸取代、添加和缺失。這些修飾可以通過本領域己知的標準技術導入，例如定向誘變和隨機PCR介導的誘變，并且可包含天然以及非天然氨基酸。

保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基由具有相似結構或者化學性質(zhì)的另一氨基酸殘基置換的取代。具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族己經(jīng)在本領域中限定。這些家族包括具有堿性側鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、無電荷極性側鏈氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半膚氨酸、色氨酸)、非極性側鏈氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支側鏈氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香側鏈氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本領域技術人員明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸殘基家族分類方式。另外，變體可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同結構或者化學性質(zhì)的另一氨基酸殘基置換。相似的小變異也可包括氨基酸缺失或者插入，或者這二者。使用本領域熟知的計算機程序可以發(fā)現(xiàn)確定哪些氨基酸殘基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫學活性的指導。

此外，功能變體可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者這兩端的截短體。本發(fā)明的功能變體與親代抑制劑相比可具有相同或不同的、更高或更低的結合親和性，但是仍能結合CFH。此后，當使用術語“抑制劑”時，其也涵蓋所述抑制劑的功能變體。

所述功能變體還包含對高變區(qū)的修飾，高變區(qū)包含來自CDR的氨基酸殘基和來自高變環(huán)的氨基酸殘基。在本發(fā)明范圍內(nèi)的功能變體與本文所述親代抑制劑具有至少大約50％至大約99％、優(yōu)選至少大約60％至大約99％、更優(yōu)選至少大約70％至大約99％、甚至更優(yōu)選至少大約80％至大約99％、最優(yōu)選至少大約90％至大約99％、特別是至少大約95％至大約99％，以及特別是至少大約97％至大約99％的氨基酸序列同源性。

本領域技術人員已知的計算機算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以進行對比以及明確相似或相同的氨基酸殘基。功能變體可以通過使用本領域己知的普通分子生物學方法改變親代抑制劑或其一部分而獲得，所述方法包括但不限于易錯PCR、寡核苷酸指導的誘變、定點誘變以及重鏈和/或輕鏈改組法。

本發(fā)明的CFH抑制劑對CFH的還原形式敏感。意思是CFH抑制劑對CFH的結合親和力根據(jù)CFH是處于還原形式還是未還原形式而改變。如果CFH不是還原形式，CFH抑制劑對CFH具有較低的結合親和力。

本發(fā)明提供了編碼前面所述的CFH抑制劑的核酸分子。所述的核酸分子可以包含在嚴格條件下與編碼包含重鏈或輕鏈序列的抗體的核酸分子雜交的核苷酸序列。

所述核酸分子包含編碼SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

本領域技術人員將意識到這些核酸分子的功能變體也是本發(fā)明的一部分。功能變體是這樣的核酸序列，通過使用標準遺傳密碼可以將其直接翻譯以提供與從親代核酸分子中翻譯的序列相同的氨基酸序列。

一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。

此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。

目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明的抑制劑(或其片段，或其衍生物)的核酸序列。然后可將該核酸序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明的抑制劑的序列中。

本發(fā)明還提供了一種包括前面所述的核酸分子的載體，除了前面所述的核酸分子之外，載體還包括與所述核酸分子序列操作性相連的調(diào)控序列。

這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達核酸分子或者蛋白質(zhì)。

所述載體包括克隆載體或者表達載體?？寺≥d體用于擴增核酸分子，表達載體用于表達核酸分子編碼的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還提供了一種含有前面所述的核酸分子或前面所述的載體的宿主細胞。

宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有:大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞：真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO,COS,293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。

本發(fā)明提供了一種包括治療有效量的前面所述的CFH抑制劑的藥物組合物。

進一步，所述藥物組合物還包括藥學上可接受的載體。

本文所用的術語“藥學上可接受的”是指當分子本體和組合物適當?shù)亟o予動物或人時，它們不會產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不良反應。本文所用的“藥學上可接受的載體”應當與本發(fā)明的抑制劑相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低組合物的效果。

可作為藥學上可接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween；潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等。

本發(fā)明的組合物可根據(jù)需要制成各種劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。給藥方式例如可以采用注射或其它治療方式。

本發(fā)明還提供了一種免疫綴合物，所述免疫綴合物包含本文所述至少一個抑制劑以及進一步包含至少一個標記物可檢測的部分/物質(zhì)?？蓹z測的部分/物質(zhì)包括但不限于酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料，生物發(fā)光材料、放射性材料、正電子發(fā)射金屬以及非放射性順磁性金屬離子。

為了檢測和/或分析和/或診斷目的用于標記抑制劑的標記依賴于使用的特定檢測/分析/診斷技術和/或方法例如免疫組織化學染色(組織)樣品、流式細胞計量術、激光掃描細胞計量術檢測、熒光免疫測定、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、生物測定(例如吞噬作用測定)、蛋白質(zhì)印跡應用等。對于本領域已知的檢測/分析/診斷技術和/或方法合適的標記為本領域技術人員所熟知。

除了通過直接或間接(例如通過接頭)綴合而化學產(chǎn)生免疫綴合物之外，所述免疫綴合物可以作為融合蛋白而產(chǎn)生，所述融合蛋白包含本發(fā)明的抑制劑及合適的標記。融合蛋白可以通過本領域已知方法產(chǎn)生，例如通過構建核酸分子以及隨后表達所述核酸分子而重組產(chǎn)生，所述核酸分子包含符合讀框的編碼抑制劑的核苷酸序列以及編碼合適標記的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了一種測定樣品中CFH的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括前面所述的CFH抑制劑。

進一步，本發(fā)明的上述產(chǎn)品測定的是樣品中的補體因子H(CFH)還原形式。

進一步，所述產(chǎn)品包括但不限于檢測試劑、試劑盒、芯片或試紙。凡是包括前面所述抑制劑的能夠檢測出CFH的檢測產(chǎn)品均包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

本發(fā)明的CFH抑制劑，又可以叫做CFH抗體，可以通過多種技術中的任一種制備。通常，抗體可以通過細胞培養(yǎng)技術產(chǎn)生，包括通過常規(guī)技術產(chǎn)生單克隆抗體，或通過將抗體基因，重鏈和/或輕鏈轉(zhuǎn)染到合適的細菌或哺乳動物細胞宿主中，以允許抗體的產(chǎn)生，其中所述抗體可以是重組的。術語“轉(zhuǎn)染”的各種形式意在包括通常用于將外源DNA引入原核或真核宿主細胞的各種技術，例如電穿孔，磷酸鈣沉淀，DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等。盡管可以在原核或真核宿主細胞中表達本發(fā)明的抗體，但是優(yōu)選在真核細胞中表達抗體，并且最優(yōu)選在哺乳動物宿主細胞中表達，因為這種真核細胞(特別是哺乳動物細胞)更可能比原核細胞組裝和分泌正確折疊和免疫活性的抗體。

用于表達重組抗體的示例性哺乳動物宿主細胞，本發(fā)明包括與DHFR選擇標記一起使用的中國倉鼠卵巢(CHO細胞)，NS0骨髓瘤細胞，COS細胞，HEK 293T細胞和SP2細胞。當將編碼抗體基因的重組表達載體引入哺乳動物宿主細胞時，通過將宿主細胞培養(yǎng)足以允許抗體在宿主細胞中表達的一段時間，或更優(yōu)選地，將抗體分泌至培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基?？梢允褂脴藴实鞍准兓椒◤呐囵B(yǎng)基中回收抗體。

宿主細胞也可用于產(chǎn)生功能性抗體片段，例如Fab片段或scFv分子。應當理解，上述程序的變化在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可能期望用編碼本發(fā)明抗體的輕鏈和/或重鏈的功能片段的DNA轉(zhuǎn)染宿主細胞。重組DNA技術也可用于除去一些或所有編碼輕鏈和重鏈之一或兩者的DNA，其不是結合感興趣的抗原所必需的。從這種截短的DNA分子表達的分子也包括在本發(fā)明的抗體中。此外，可以產(chǎn)生雙功能抗體，其中一條重鏈和一條輕鏈是本發(fā)明的抗體(即，結合人CFH)，并且另一條重鏈和輕鏈對于除人CFH之外的抗原是特異性的。

制備單克隆抗體的方法涉及永生細胞的制備，能夠產(chǎn)生具有所需特異性的抗體的細胞系。這樣的細胞系可以從獲自免疫動物的脾細胞產(chǎn)生?？梢杂妹庖邉游锷a(chǎn)CFH或其片段和/或變體。

可以從生長的雜交瘤的上清液中分離單克隆抗體。此外，可以采用各種技術來提高產(chǎn)量，例如將雜交瘤細胞系注射到合適的脊椎動物宿主(例如小鼠)的腹膜腔中。然后可以從腹水液體或血液收獲單克隆抗體。污染物可以通過常規(guī)技術例如色譜，凝膠過濾，沉淀和提取從抗體中除去。親和層析是可用于純化抗體的方法的實例。

本發(fā)明提供了一種治療患癌受試者的方法。所述方法包括向所述受試者施用所述CFH抑制劑，或者施用包括所述CFH抑制劑的藥物組合物，或者施用包括編碼所述CFH抑制劑的核酸分子以及包括所述核酸分子的載體或者細胞。

所述方法可以進一步包括施用有效量的西妥昔單抗，Perjeta或赫賽汀中的至少一種。

本發(fā)明還提供了一種檢測或測量樣品中的補體因子H(CFH)的方法。該方法包括使樣品與所述CFH抑制劑接觸。

本發(fā)明還提供了一種裂解細胞增加補體依賴性的方法。所述方法包括對所述細胞施用所述CFH抑制劑或包括所述CFH抑制劑的藥物組合物。

本發(fā)明還提供了一種增加C3b沉積細胞表面的方法。所述方法包括對所述細胞施用所述CFH抑制劑或包括所述CFH抑制劑的藥物組合物。

本發(fā)明還提供了一種受試者或細胞中抑制補體因子H(CFH)與C3b結合的方法。所述方法包括對所述細胞施用所述CFH抑制劑或包括所述CFH抑制劑的藥物組合物。

本發(fā)明還提供了一種抑制受試者腫瘤生長的方法。所述方法包括向所述受試者施用所述CFH抑制劑，或者施用包括所述CFH抑制劑的藥物組合物，或者施用包括編碼所述CFH抑制劑的核酸分子以及包括所述核酸分子的載體或者細胞，可以抑制肺腫瘤生長。

本發(fā)明還提供了前面所述的抑制劑在制備測定CFH產(chǎn)品中的應用。

所述產(chǎn)品包括前面所述的CFH抑制劑；所述產(chǎn)品包括但不限于檢測試劑、試劑盒、芯片或試紙。凡是包括前面所述的CFH抑制劑能夠檢測出CFH的產(chǎn)品均包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

本發(fā)明還提供了前面所述的CFH抑制劑在制備補體相關疾病的藥物中的應用。

進一步，所述補體相關疾病包括但不限于下例：腎上腺皮質(zhì)癌，肛門癌，膀胱癌，腦腫瘤，乳腺癌，類癌腫瘤，胃腸道未知原發(fā)癌，子宮頸癌，結腸癌，子宮內(nèi)膜癌，食管癌，肝外膽管癌癥，Ewings家庭腫瘤，顱外生殖細胞腫瘤，眼內(nèi)黑色素瘤眼癌，膽囊癌，胃癌，外生殖細胞腫瘤，妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤，頭頸癌，下咽癌，胰島細胞癌，腎癌，喉癌，口腔癌，肝癌，肺癌，艾滋病相關淋巴瘤，中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤，皮膚T細胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，惡性間皮瘤，黑色素瘤，梅克爾細胞癌，多發(fā)性骨髓瘤、漿細胞瘤，鼻咽癌，成骨細胞瘤，口咽癌，骨肉瘤，卵巢上皮癌，卵巢生殖細胞腫瘤，胰腺癌，外分泌，胰腺癌，鼻旁竇和鼻腔癌，甲狀旁腺癌，陰莖癌，垂體癌，前列腺癌，橫紋肌肉瘤，直腸癌，過渡細胞腎盂和尿道癌，唾液腺癌，Sezary綜合征，皮膚癌，小腸癌，軟組織肉瘤，睪丸癌，惡性胸腺瘤，甲狀腺癌，尿道癌，子宮癌，不尋常的兒童癌癥，陰道癌，Vulvar癌癥和Wilms'瘤。

在本發(fā)明的具體實施方案中，本發(fā)明研究的癌癥是肺癌。

本發(fā)明的抑制劑還可以與其他具有相同或者互補功能的藥物聯(lián)合應用，聯(lián)合應用的效果可以是抑制劑與其他藥物功能之和，還可以遠遠大于抑制劑與其他藥物功能之和，這種情況表明該抑制劑與其他藥物之間產(chǎn)生了協(xié)同作用。

除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本領域普通技術人員通常理解的相同的含義。如有沖突，本文件(包括定義)將予以控制。優(yōu)選的方法和材料如下所述，盡管與本文所述相似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實踐或測試。本文提及的所有出版物，專利申請，專利和其它參考文獻通過引用以其全文并入本文。本文公開的材料，方法和實施例僅是說明性的，而不是限制性的。

本文所用的術語“單克隆抗體”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，除少數(shù)可能存在的天然發(fā)生的突變外，該群體中包含的單個抗體是相同的。修飾語“單克隆”僅表示抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不能解釋成需要用任何特殊方法來生產(chǎn)抗體。

本文所用的術語“施用”是指接觸和/或遞送CFH抑制劑以獲得期望的效果。CFH抑制劑可以以多種方式施用于受試者，包括但不限于口服，眼部，鼻部，靜脈內(nèi)，局部，氣溶膠，栓劑等，并且可以組合使用。

本文所用的術語“自身抗體”是指由個體產(chǎn)生的針對個體自身蛋白，碳水化合物或核酸的免疫球蛋白，抗原特異性B細胞表面受體(表面免疫球蛋白)或抗原特異性T細胞受體。

本文使用的術語“有效量”是指在所需時間內(nèi)有效的藥物劑量，以實現(xiàn)所需的劑量治療結果。有效劑量可以由本領域技術人員確定，并且可以根據(jù)個體的疾病狀態(tài)，年齡，性別和體重等因素而變化藥物在個體中引起所需反應的能力。本文使用的該術語還指在動物，哺乳動物，哺乳動物，或人類，例如減少和/或抑制雌激素受體的功能。治療有效量可以一次或多次施用(例如，藥劑可作為預防性治療或在疾病進展的任何階段治療性地，在癥狀之前或之后等)，應用或劑量給予，并且不是預期的限于特定的制劑，組合或施用途徑。給藥次數(shù)和劑量取決于幾個因素，例如治療的目標，受試者等，并且可以由本領域技術人員容易地確定。

本文可互換使用的“癌癥”或“腫瘤”是指不受控制的不規(guī)則的生長的異常細胞在體內(nèi)。癌癥可能侵入身體的附近部分，并且還可能通過淋巴系統(tǒng)或血流傳播到身體的更遠的部分。本文可互換使用的“癌細胞”或“腫瘤細胞”是指以不受控制的生長分裂和再生異常的細胞。癌細胞可以分裂并行進到身體的其他部分并建立另一個位點，稱為轉(zhuǎn)移。癌細胞或癌細胞也稱為惡性細胞。癌細胞或癌細胞系可起源于癌癥。例如，癌細胞系可以是A549細胞系(“A549”)，其是人肺腺癌上皮細胞系。

本文所用的“補體因子H蛋白”，“CFH蛋白”或“CFH”可以互換使用，是指大約150kDa的蛋白質(zhì)，其是補體激活家族的調(diào)節(jié)物的成員并且是補體對照蛋白質(zhì)。CFH是大的可溶性糖蛋白，其在人血漿中循環(huán)并用于調(diào)節(jié)補體系統(tǒng)的旁路途徑，確保補體系統(tǒng)針對病原體或其它危險物質(zhì)并且不損害宿主組織。CFH是通過因子I失活C3b的輔因子，并且起作用以增加替代補體途徑中C3bBb復合物(C3轉(zhuǎn)化酶)和(C3b)NBB復合物(C5轉(zhuǎn)化酶)的解離速率，CFH與糖胺聚糖結合，通常存在于宿主細胞上，但通常不存在于病原體表面上。CFH由20個短的共有重復序列(SCR)組成，其中一些重復序列起細胞附著的作用，而其他重復序列的功能是從細胞表面消除C3b。20個SCRs包含CFH各自約60個氨基酸長，以頭尾相連排列，含有4個半胱氨酸殘基，每個模塊形成2個二硫鍵。C3b結合結構域可以指結合C3b的CFH部分。SCR 19和20參與C3b的結合。

“表位”是指被識別并可以結合特異性配偶體的任何分子上的位點。分子和特異性配偶體是特異性結合對的一部分。例如，表位可以在多肽，蛋白質(zhì)，半抗原，碳水化合物抗原(例如但不限于糖脂，糖蛋白或脂多糖)或多糖上。其特異性配偶體可以是但不限于抗體。在本文中，表位指的是抗原上的表位，特異性配偶體是抗體。

如本文所用的“肺癌”是指起源于肺的癌癥。例如，肺癌可以是小細胞肺癌，非小細胞肺癌(“NSCLC”)，腺體腫瘤，類癌瘤和未分化的癌。

本發(fā)明的“樣品”可以是血液，組織，尿液，血清，血漿，羊水，腦脊液，胎盤細胞或組織，內(nèi)皮細胞，白細胞或單核細胞的樣品。樣品可以直接從患者獲得或可以預處理，例如通過過濾，蒸餾，提取，濃縮，離心，干擾組分的滅活，添加試劑等，以修飾樣品。

可以使用任何細胞類型，組織或體液來獲得樣品。這樣的細胞類型，組織和流體可以包括組織切片，例如活組織檢查和尸檢樣本，為組織學目的取得的冷凍切片，血液(例如全血)，血漿，血清，痰，糞便，眼淚，粘液，唾液，支氣管肺泡灌洗液BAL)流體，毛發(fā)，皮膚，紅細胞，血小板，間質(zhì)液，眼晶狀體液，腦脊髓液，汗液，鼻液，滑液，月經(jīng)，羊水，精液等。細胞類型和組織也可包括淋巴流體，胃腸液，婦科液，尿，腹膜液，腦脊液，通過陰道沖洗收集的液體或通過陰道沖洗收集的液體。組織或細胞類型可以通過從動物中除去細胞樣品來提供，但也可以通過使用先前分離的細胞(例如，由另一個人分離，在另一時間和/或為了另一個目的)來實現(xiàn)。也可以使用存檔組織，例如具有治療或結果歷史的那些。蛋白質(zhì)或核苷酸分離和/或純化可能不是必需的。

本文可互換使用的“短共有重復”或“SCR”基于β-夾心排列的結構，其中一個表面由三個β鏈構成，氫鍵結合以在其中心形成三鏈區(qū)域，而另一個表面由兩個單獨的β鏈形成。SCR也稱為補體控制蛋白(CCP)模塊和壽司結構域。SCR存在于多種補體和粘附蛋白中。如本文所用，“SCR19”是指短共有重復域19，“SCR19-20”是指短共有重復域19和20，如母體分子CFH中彼此共價連接。

本文所用的“受試者”和“患者”可互換地指任何脊椎動物，包括但不限于哺乳動物(例如牛，豬，駱駝，駱駝，馬，山羊，兔，綿羊，倉鼠，豚鼠，貓，狗，大鼠和小鼠，非人靈長類動物，猴，例如食蟹猴或恒河猴，黑猩猩等)和人)。在一些實施方案中，受試者可以是人或非人。受試者或患者可以經(jīng)歷其他形式的治療。

本文所用的“治療”描述逆轉(zhuǎn)，減輕或抑制該術語適用的疾病或該疾病的一種或多種癥狀的進展。根據(jù)受試者的狀況，該術語還指預防疾病，并且包括預防疾病的發(fā)作或預防與疾病相關的癥狀。治療可以以急性或慢性方式進行。該術語還指在患有疾病之前降低與該疾病相關的疾病或癥狀的嚴重性。在疾病之前這種疾病的預防或減輕的嚴重程度是指將本發(fā)明的抗體或藥物組合物施用給不是在施用疾病的施用時間的受試者?！邦A防”還指防止疾病或與該疾病相關的一種或多種癥狀的復發(fā)。

附圖說明

圖1顯示利用SDS-PAGE鑒定表達純化后TRN1006抗體的圖；

圖2顯示利用ELLSA檢測抗體TRN1006結合位點的結果圖；

圖3顯示利用BiaCore檢測TRN1006抗體的親和活性的圖。

具體實施方式

下面通過實施例進一步說明本發(fā)明。應該理解的是，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

實施例1 PBMC分離和單個記憶性B細胞分選

通過免疫印跡法尋找到11個表達CFH自身抗體的病人，合并其外周血單個核細胞(PBMC)。用親和素標記CFH 15-mer多肽(SEQ ID NO:9)作為釣餌，利用流式分選儀從合并的PBMC中分選到了單個記憶B細胞：依次選取P1(淋巴細胞門)→P2(IgG+)→P3(CD3-/CD14-/CD16-/CD20+/CD27ALL)。選擇P1&P2&P3門(IgG+/CD3-/CD14-/CD16-/CD20+/CD27ALL)，細胞計數(shù)(5000個細胞/孔)，分選多孔。流式細胞儀分選出CD3-/CD14-/CD16-/CD20+/CD27ALL細胞群。為了使假陽性最小化，用Alexa標記鏈霉抗生物素蛋白Fluor647和Brilliant Violet 421。每個熒光團用鏈霉親和素進行標記在單獨的等分試樣上，然后將其混合在一起然后與生物素化的抗原肽相互作用。顯示升高熒光的兩種熒光團細胞分選到單一96孔板的孔中。

實施例2 單B細胞RT-PCR分離抗體可變區(qū)基因

合成cDNA第一條鏈：將含有單個B細胞的96孔板加入0.5μM的各亞型重鏈與輕鏈的恒定區(qū)引物與Superscript III反轉(zhuǎn)錄酶，37℃孵育1小時；按以下條件進行PCR擴增：95℃15min；95℃1min，55℃1min，72℃1min，30cycles；72℃10min；4℃5min。產(chǎn)物cDNA在-20℃保存。

Nest-PCR分離抗體基因：每個單細胞分別擴增重鏈、輕鏈序列。50μL體系中含有5μL的RT反應產(chǎn)物，HotStarTaq酶，dNTPs，及0.5μM的各亞型重鏈與輕鏈抗體的特異性引物，反應條件：預變性95℃5min，然后進行35個PCR循環(huán)：95℃×30s，55℃×60s，72℃×90s，最后用72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

實施例3 PCR產(chǎn)物克隆鑒定和抗體表達

PCR產(chǎn)物純化克隆鑒定：取2μL擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段約400bp。將凝膠電泳鑒定為陽性，且重鏈與輕鏈可匹配成對的抗體可變區(qū)基因PCR產(chǎn)物利用TA克隆的方法連接到pcDNA3.3載體上(已經(jīng)改造并含有抗體leader與恒定區(qū))，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌中，在含有氨芐青霉素的平板上37℃培養(yǎng)過夜，隨即挑取10個單菌落用特異性引物進行PCR，反應條件：94℃預變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min40s，28個循環(huán)，最后72℃再延伸5min；取5μL PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，在陽性轉(zhuǎn)化子中鑒定出了含有抗體重鏈或輕鏈基因的轉(zhuǎn)化子。

抗體表達：將表達陽性抗體重鏈和輕鏈基因的質(zhì)粒在大腸桿菌DH5α中大量擴增，進行重組質(zhì)?？焖偬崛?。用轉(zhuǎn)染試劑PolyFect共轉(zhuǎn)染293細胞，具體操作參見說明書。轉(zhuǎn)染后6-8小時換新鮮培養(yǎng)基，并在37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，收集細胞上清進行檢測。

實施例4 表達抗體的篩選檢測

(1)純化SCR19(CFH 15-mer多肽)

巴斯德畢赤酵母表達載體中編碼人CFH短共有重復結構域19(稱為SCR19)進行克隆。通過使用具有50,000和5,000MW截留值(Sartorius，Goettingen，Germany)的Vivacell 70離心單元，然后HiTrap SP FF陽離子交換色譜(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ)，通過順序差異過濾，從巴斯德畢赤酵母培養(yǎng)基中純化蛋白質(zhì)。

(2)以CFH 15-mer多肽為抗原，并用鏈霉親和素板將biotin標記的多肽抗原10倍稀釋后包被96孔ELISA板，每孔100μl 4℃過夜包被，用封閉液常溫封閉2個小時。將100μl的瞬時轉(zhuǎn)染上清作為一抗常溫孵育2個小時，用抗-IgGγ鏈-HRP(Millipore)為二抗(1:2000)作為二抗常溫孵育1個小時，加入底物顯色液100μl/孔，常溫避光放置5min后，用2M硫酸鈉中止反應，用450nm/630nm波長進行比色。篩選獲得具有活性并特異性結合CFH 15-mer多肽的抗體命名為TRN1006，進行大量表達和功能性實驗驗證。

實施例5 抗體大量表達與純化

抗體大量表達與純化：將TRN1006抗體重鏈與輕鏈的表達載體用PolyFect(Qiagen)轉(zhuǎn)染試劑盒共轉(zhuǎn)染293細胞，轉(zhuǎn)染后6-8小時換新鮮培養(yǎng)基，并在37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時。收集轉(zhuǎn)染上清，4000rpm離心1小時，采用Amersham公司的Protein-A親和層析柱直接純化表達上清。

SDS-PAGE檢驗：利用SDS-PAGE檢驗抗體TRN1006的表達及純化情況，結果如圖1所示，證實得到較純蛋白，可清晰觀察到解鏈后的抗體輕、重鏈。

實施例6 結合位點驗證試驗

標有生物素的CFH 15-mer多肽抗原(SEQ ID NO:9)，對每個氨基酸分別進行突變，形成了15個突變肽，再加上野生型多肽作為陽性對照以及序列打亂的多肽作為陰性對照，用Elisa檢測TRN1006抗體在不同濃度下分別與上述18個多肽的結合情況，繪制曲線并且計算出Area Under Curve(AUC)，分析抗體與多肽的關鍵結合位點。結果如圖2顯示，TRN1006抗體與CFH抗原多肽關鍵結合位點是多肽序列GPPPPIDNGDITSFP中第5位、第6位、第7位、第8位、第11位、第12位，第14位，證明能與抗原多肽特異性結合。其中，圖2中陽性對照1的序列如SEQ ID NO:9所示，陽性對照2的如SEQ ID NO:11所示，1-15分別代表上述15個突變肽。

實施例7 TRN1006抗體親和力測定

先進行SA芯片偶聯(lián)捕獲分子，再活化芯片的葡聚糖表面，以進樣時間確定偶聯(lián)量。最后利用SA芯片捕獲分子捕獲配體：將制備的全人源CFH抗體TRN1006作為配體，以計算得到的信號值確定單抗的進樣濃度及接觸時間。單抗與CFH 15-mer多肽(抗原)結合的親和力和動力學分析：CFH 15-mer多肽用HBS-EP緩沖液稀釋作為分析物，分析物以逐漸增高的濃度依次流過芯片，分別得到信號曲線。每個濃度作為1個循環(huán)，完成1次循環(huán)后用10mmol/L的甘氨酸－鹽酸再生芯片以回復到原始未結合抗原的狀態(tài)。用BiaCore X-100System軟件進行分析。

結果如圖3所示，TRN1006抗體與抗原的親和力高，為1.40×10^-8KD，具體見表1：

表1抗體親和力測定表

實施例8 TRN1006抗體的抗原表位測定

丙氨酸掃描定點突變：為了明確重組CFH單抗的氨基酸印記，我們分析了TRN1006抗體和丙氨酸替代多肽(包括PIDNGDIT序列)的結合情況。異亮氨酸1120突變?yōu)楸彼岷蟾?個單抗都完全不結合。天冬酰胺1117突變后有0％-35％的野生型結合。蘇氨酸1121突變后有1％-66％的野生型結合。多肽的上游四個殘基或下游三個殘基的改變對于單抗沒影響。

實施例9 TRN1006抗體作用于癌細胞系的CDC效應

由于CFH表位定位影響反應機制，所以本發(fā)明用A549肺癌細胞系測試了TRN1006的CDC效應。使用肺癌細胞系是因為之前發(fā)現(xiàn)CFH自身抗體是在肺癌病人體內(nèi)。在CDC測試中，細胞和單抗還有正常人血清(NHS)作為補體來源，共同在37℃孵育，測試乳酸脫氫酶(LDH)的釋放來測量細胞溶解。TRN1006加入到A549細胞中后，比人單抗的陰性對照增強了101％的CDD效應。

為了確定補體激活，本發(fā)明分析了CDC反應的副產(chǎn)物：C3a,C5a,和C5b-9。過敏毒素C3a和C5a在補體激活的過程中產(chǎn)生，并作為免疫細胞的細胞因子連接先天和后天免疫系統(tǒng)。C5b-9構成了終端膜攻擊復合物(MAC)，溶解細胞裝配的最小數(shù)量。另外，TRN1006加入A549細胞系在正常人血漿存在的條件下，會導致C3a釋放增加，C5a釋放增加，C5b-9沉積增加。

雖然以上僅描述了本發(fā)明的具體實施方式范例，但是本領域的技術人員應當理解，這些僅是舉例說明，本發(fā)明的保護范圍是由所附權利要求書限定的。本領域的技術人員在不背離本發(fā)明的原理和實質(zhì)的前提下，可以對這些實施方式做出多種變更或修改，但這些變更或修改均落入本發(fā)明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣州泰諾迪生物科技有限公司；珠海泰諾麥博生物技術有限公司；暨南大學

<120> 補體因子H抑制劑及與之相關的用途

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> 人源

<400> 1

Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys Ser Leu Arg Leu Ser Cys

1 5 10 15

Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Tyr Gly Met His Trp Val Arg

20 25 30

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Leu Ala Val Ile Ser Tyr Asp

35 40 45

Glu Lys Thr Lys His Tyr Gly Ala Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile

50 55 60

Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu

65 70 75 80

Arg Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Lys Gly Ser Ala Glu

85 90 95

Ala Ala Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Gly Phe Thr Phe Ser Leu Tyr Gly

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人源

<400> 3

Ile Ser Tyr Asp Glu Lys Thr Lys

1 5

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人源

<400> 4

Ala Lys Gly Ser Ala Glu Ala Ala Thr Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 105

<212> PRT

<213> 人源

<400> 5

Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Arg Ala Thr Val Asn Cys Arg

1 5 10 15

Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg Ser Asn Lys Lys Asn Tyr Leu Ala

20 25 30

Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Trp

35 40 45

Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Pro Glu Asp

65 70 75 80

Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ala Thr Pro Leu Thr Phe

85 90 95

Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg

100 105

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人源

<400> 6

Gln Ser Leu Leu Tyr Arg Ser Asn Lys Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> 人源

<400> 7

Trp Ala Ser

1

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人源

<400> 8

Gln Gln Tyr Tyr Ala Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人源

<400> 9

Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe Pro

1 5 10 15

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人源

<400> 10

Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr

1 5

<210> 11

<211> 18

<212> PRT

<213> 人源

<400> 11

Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe Pro Gly

1 5 10 15

Gly Gly