本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種活的不可培養(yǎng)狀態(tài)金黃色葡萄球菌的低溫等離子體誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是威脅人類健康的四大食源性病原菌之一，它能夠產(chǎn)生不被高溫破壞的腸毒素，從而引起人體健康危害。在食品中，易被金黃色葡萄球菌污染的食品主要有魚、肉、蛋、乳及其制品，尤其是乳品的安全常受到金黃色葡萄球菌的威脅，金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件每年都會發(fā)生，是一個世界性的衛(wèi)生問題。并且研究發(fā)現(xiàn)，在乳品在實(shí)際的生產(chǎn)與流通過程中，由于技術(shù)上的缺陷、人為的操作不當(dāng)以及外界不利環(huán)境的脅迫等因素，常導(dǎo)致金黃色葡萄球形成活的不可以培養(yǎng)狀態(tài)。但是，常規(guī)的平板培養(yǎng)方法并不能檢測出活的不可培養(yǎng)狀態(tài)菌，但其在產(chǎn)品貯藏、運(yùn)輸?shù)冗^程中仍然具有生命體征和代謝活性，且處于活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的金黃色葡萄菌處于適宜的環(huán)境條件下，能夠恢復(fù)到正常的狀態(tài)，因此被活的不可培養(yǎng)狀態(tài)金黃色葡萄球菌污染的食品一旦進(jìn)入人體便會存在潛在危害，給食品安全保障帶來嚴(yán)重隱患。
開展活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的金黃色葡萄球菌形成機(jī)制、復(fù)蘇機(jī)制、檢測方法等方面的研究，對于食品安全控制技術(shù)和快速簡便檢測方法的開發(fā)具有重要的意義。然而現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，獲得較大比例活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的金黃色葡萄球菌細(xì)菌需要比較長的時間，過程耗能高，容易對環(huán)境造成負(fù)擔(dān)。因此，開發(fā)一種活的不可培養(yǎng)狀態(tài)金黃色葡萄球菌的低溫等離子體誘導(dǎo)方法對于促進(jìn)節(jié)能降耗、推動該狀態(tài)細(xì)菌的研究起到重要的作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供活的不可培養(yǎng)狀態(tài)金黃色葡萄球菌的低溫等離子體誘導(dǎo)方法。本發(fā)明將金黃色葡萄球菌經(jīng)介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體處理，使其在短時間內(nèi)形成活的不可培養(yǎng)狀態(tài)。
一種活的不可培養(yǎng)狀態(tài)金黃色葡萄球菌的誘導(dǎo)方法，包括如下步驟：
將金黃色葡萄球菌制成細(xì)菌懸浮液，經(jīng)介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體處理，形成活的不可培養(yǎng)狀態(tài)，介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體處理的條件為：處理頻率為8～15kHz,，處理氣隙間距為1～3mm，處理功率為25～50W，處理時間為3～5s，處理溫度為室溫。
本發(fā)明提供的方法，是將金黃色葡萄球菌經(jīng)介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體處理，誘導(dǎo)其形成活的不可培養(yǎng)狀態(tài)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，利用介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體技術(shù)處理金黃色葡萄球菌，可促使其在4s快速形成活的不可培養(yǎng)狀態(tài)；本發(fā)明的方法使金黃色葡萄球菌形成活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的誘導(dǎo)時間大大縮短，有利于促進(jìn)節(jié)能降耗，并對進(jìn)一步推動活的不可培養(yǎng)狀態(tài)金黃色葡萄球菌的研究具有重要的意義。
優(yōu)選地，所述細(xì)菌懸浮液中菌體濃度為108CFU/mL。
優(yōu)選地，所述細(xì)菌懸浮液中金黃色葡萄球菌處于對數(shù)期。
優(yōu)選地，所述細(xì)菌懸浮液的制備方法如下：將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25923接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期，采用質(zhì)量百分含量為0.85％的無菌生理鹽水洗滌對數(shù)生長期的菌體兩次，重懸，使菌體濃度約為108CFU/mL即得。
優(yōu)選地，低溫等離子體處理時，所述細(xì)菌懸浮液置于介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體殺菌裝置的兩極之間，以空氣為放電氣體。
介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體處理在介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體殺菌裝置中進(jìn)行，具體步驟為：
將細(xì)菌懸浮液裝入石英培養(yǎng)皿(直徑50mm)中，將培養(yǎng)皿放于兩電極之間，對菌液進(jìn)行低溫等離子體處理，以空氣為放電氣體，得到誘導(dǎo)后菌液。
優(yōu)選地，處理頻率為8～12kHz，處理氣隙間距為1.5～2.5mm，處理功率為25～50W，處理時間為3.5～4.5s，處理溫度為20～30℃。所述氣隙間距是指低溫等離子體放電裝置中兩個電極之間的間距。
優(yōu)選地，處理頻率為10kHz，處理氣隙間距為2mm，處理功率為25～50W，處理時間為4s，處理溫度為25℃。
本發(fā)明的方法中，處理功率、處理時間、處理氣隙間距等因素都會對誘導(dǎo)結(jié)果產(chǎn)生影響，在一定的范圍內(nèi)，隨著處理功率、處理時間的增加，誘導(dǎo)比例逐步增加，但超過一定的比例后開始下降；而在一定范圍內(nèi)，隨著處理氣隙間距的減小，誘導(dǎo)比例逐步增加，但超過一定的比例后開始下降，上述優(yōu)選條件為本發(fā)明的最佳處理?xiàng)l件，在該最佳處理?xiàng)l件下，各影響因素所取條件之間更好的相互協(xié)同，誘導(dǎo)結(jié)果最好，能在最短的時間(4s左右)內(nèi)誘導(dǎo)出較大比例的活的不可培養(yǎng)菌，達(dá)到降低成本的作用。
一般一臺低溫等離子體設(shè)備會有一個固定的最佳頻率，因此處理頻率一般不會改變，相對更重要的參數(shù)是處理功率、處理氣隙間距、處理時間。
超出本發(fā)明所選參數(shù)范圍可能存在拮抗作用，導(dǎo)致誘導(dǎo)結(jié)果下降，本發(fā)明對比了處理時間8s、處理功率50w、氣隙間距2mm：經(jīng)介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體處理后活菌的比例為89.89％；可培養(yǎng)菌的比例為18.23％；形成活的不可培養(yǎng)狀態(tài)金黃色葡萄球菌比例為41.66％。對照組的活菌比例與可培養(yǎng)菌比例仍約為100％，基本認(rèn)為沒有活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的菌。與本發(fā)明實(shí)施例2相比，處理時間增加，誘導(dǎo)比例反而大幅降低，說明處理時間不在本發(fā)明處理時間范圍內(nèi)時無法完成本發(fā)明的目的。
本發(fā)明還對比了處理時間4s、處理功率50w、氣隙間距4mm：經(jīng)介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體處理后活菌的比例為94.67％；可培養(yǎng)菌的比例為57.08％；形成活的不可培養(yǎng)狀態(tài)金黃色葡萄球菌比例為37.59％。對照組的活菌比例與可培養(yǎng)菌比例仍約為100％，基本認(rèn)為沒有活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的菌。與本發(fā)明實(shí)施例2相比，氣隙間距增大，誘導(dǎo)比例大幅降低，氣隙間距超出本發(fā)明要求范圍也無法達(dá)到本發(fā)明的誘導(dǎo)效果。
本發(fā)明的方法在介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體處理后，還包括以下步驟：檢測經(jīng)過介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體誘導(dǎo)后的金黃色葡萄球菌的活菌比例和可培養(yǎng)菌比例；其中，檢測經(jīng)過介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體誘導(dǎo)后的金黃色葡萄球菌活菌比例采用PI/cFDA雙染法，檢測經(jīng)過誘導(dǎo)處理后的金黃色葡萄球菌可培養(yǎng)菌比例采用平板計數(shù)法。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明開發(fā)了一種活的不可培養(yǎng)狀態(tài)金黃色葡萄球菌的低溫等離子體誘導(dǎo)方法，利用介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體技術(shù)處理細(xì)菌，可促使細(xì)菌在4s快速形成活的不可培養(yǎng)狀態(tài)，而常用的低溫寡營養(yǎng)的條件需要一個月以上的誘導(dǎo)時間；本發(fā)明的方法使金黃色葡萄球菌形成活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的誘導(dǎo)時間大大縮短，有利于促進(jìn)節(jié)能降耗，并對進(jìn)一步推動活的不可培養(yǎng)狀態(tài)金黃色葡萄球菌的研究具有重要的意義。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例1活的不可培養(yǎng)狀態(tài)金黃色葡萄球菌的快速誘導(dǎo)
一細(xì)菌懸浮液制備
將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25923接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期。采用0.85％(質(zhì)量百分含量)無菌生理鹽水洗滌對數(shù)生長期的菌體兩次，重懸，使菌體濃度約為108CFU/mL，作為待誘導(dǎo)菌液(細(xì)菌懸浮液)；
二低溫等離子體處理
實(shí)驗(yàn)組：用介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體殺菌裝置(南京蘇曼等離子體科技有限公司)對金黃色葡萄球菌懸浮液進(jìn)行處理，具體步驟：將3mL細(xì)菌懸浮液裝入石英培養(yǎng)皿(直徑50mm)中，將培養(yǎng)皿放于兩電極之間，對菌液進(jìn)行低溫等離子體處理，處理頻率為10kHz，處理功率為25W,處理氣隙間距為2mm，處理時間為4s，處理溫度為室溫，以空氣為放電氣體，得到誘導(dǎo)后菌液。
對照組：待誘導(dǎo)菌液不進(jìn)行低溫等離子體處理，只在室溫中放置4s。
三檢測
(1)活菌數(shù)測定方法
采用PI/cFDA雙染法：具體步驟：實(shí)驗(yàn)組和對照組的金黃色葡萄球菌與30mmol/L的PI在冰浴中孵育10min，然后與50mmol/L的cFDA在37℃孵育10min，4℃、6000×g離心10min，用無菌生理鹽水洗滌去除過量的染料，孵育完成后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，每個樣品收集20000個細(xì)菌檢測。
(2)可培養(yǎng)菌數(shù)測定方法
采用平板計數(shù)法：具體步驟：參照GB 4789.2-2010方法，將誘導(dǎo)后菌液用0.85％無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，取稀釋樣1mL于滅菌平皿中，倒入約20mL PCA培養(yǎng)基搖勻，待培養(yǎng)基凝固后倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后記錄菌落數(shù)。
(3)活的不可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)菌
采用上述的方法分別測定實(shí)驗(yàn)組和對照組的活菌比例和可培養(yǎng)菌比例，從而計算活的不可培養(yǎng)狀態(tài)金黃色葡萄球菌的比例(活菌比例—可培養(yǎng)菌比例)。
結(jié)果如下：經(jīng)介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體處理后活菌的比例為97.33％；可培養(yǎng)菌的比例為48.89％；形成活的不可培養(yǎng)狀態(tài)金黃色葡萄球菌比例為48.44％。對照組的活菌比例與可培養(yǎng)菌比例約為100％，基本認(rèn)為沒有活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的菌。由此可見，本發(fā)明的方法在25W的條件下誘導(dǎo)4s時獲得了一定比例的活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的金黃色葡萄球菌。
實(shí)施例2快速誘導(dǎo)較大比例金黃色葡萄球菌形成活的不可培養(yǎng)狀態(tài)
一細(xì)菌懸浮液制備
與實(shí)施例1中的步驟一方法相同。
二低溫等離子體誘導(dǎo)
與實(shí)施例1中的步驟二的方法基本相同，僅將處理功率變50W后得到誘導(dǎo)后菌液。
三檢測
與實(shí)施例1中的三的方法相同。
結(jié)果如下：經(jīng)介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體處理后活菌的比例為95.72％；可培養(yǎng)菌的比例為23.17％；形成活的不可培養(yǎng)狀態(tài)金黃色葡萄球菌比例為72.55％。對照組的活菌比例與可培養(yǎng)菌比例仍約為100％，基本認(rèn)為沒有活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的菌。由此可見，本發(fā)明的方法在50W的條件下誘導(dǎo)4s時獲得了較大比例的活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的金黃色葡萄球菌。
本實(shí)施例同實(shí)施例1相比，形成的活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的金黃色葡萄球菌的比例更大。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。