本發(fā)明涉及RNA干擾技術(shù)領(lǐng)域，尤其是指能夠同時用于有透明帶的卵母細胞或者胚胎、以及無透明帶的卵母細胞或者胚胎的RNA干擾新方法，具體地說是一種專門研制的電激活設(shè)備及采用其的卵母細胞或者胚胎的RNA干擾新方法。

背景技術(shù)：

RNA干擾（RNA interfering, RNAi）是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA（double-stranded RNA, dsRNA）引發(fā)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程。具體的，細胞中核糖核酸酶III家族成員之一的dsRNA特異性核酸酶Dicer，將dsRNA裂解成由21-25個核酸組成的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），隨后siRNA作為介導子引起相同序列的mRNA特異性降解，從而阻斷相應基因表達。目前對于卵母細胞或者胚胎的RNA干擾方法主要是通過顯微注射，把小片段干擾RNA注射入到卵母細胞或者胚胎的胞質(zhì)或核中，從而干擾目的基因表達。這種方法需要一臺昂貴的顯微操作儀，對工作人員的技術(shù)要求比較高。同時在操作時需要對每個卵母細胞或胚胎做單獨注射，耗費時間，勞動量大，并且對被注射的卵或胚胎有一定損傷。另外，顯微操作儀只能對有透明帶的卵母細胞或者胚胎做顯微注射，對于無透明帶的卵母細胞或者胚胎便無法實現(xiàn)RNA干擾。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種電激活設(shè)備及采用其的卵母細胞或者胚胎的RNA干擾新方法，該電激活設(shè)備專門為配合該卵母細胞或者胚胎的RNA干擾新方法而研制，該RNA干擾新方法無論是無透明帶的卵母細胞或者胚胎、還是有透明帶的卵母細胞或者胚胎都能夠進行處理，干擾時每次能夠同時處理10-20個卵母細胞或者胚胎，操作簡單、效率較高且避免了顯微注射針對卵母細胞或者胚胎的傷害。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案解決的：

一種電激活設(shè)備，包括平行電極，其特征在于：所述的平行電極上設(shè)有一突起的彎折部，該彎折部使得該平行電極的前端能夠繞過小容器的邊緣并落入大容器中，且該平行電極的前端分別與正、負電源線電性相連，使落入小容器內(nèi)的平行電極之間的區(qū)域構(gòu)成電激活槽。

所述的彎折部至該平行電極前端的距離為整個平行電極長度的1/4～1/3，且彎折部的豎直高度不低于小容器的邊緣豎直高度。

位于小容器和大容器內(nèi)的平行電極之間的間距固定，同時位于小容器內(nèi)的平行電極的后端整體膠封且位于大容器內(nèi)的平行電極的兩條電極分別膠封。

所述的小容器放置在大容器內(nèi)。

一種采用電激活設(shè)備的卵母細胞或者胚胎的RNA干擾新方法，其特征在于：所述新方法的步驟如下：

a、在小容器內(nèi)的平行電極上添加含有干擾RNA的電激活液F+以覆蓋電激活槽，電激活液F+為0.3mol/L甘露醇、0.1mmol/L硫酸鎂、0.05nmol/L氯化鈣、0.01%g/L聚乙烯醇混合構(gòu)成；

b、將平行電極的前端連接BLS細胞融合儀的正、負電極，在電激活槽中以每組10-20個的數(shù)量放入待激活的卵母細胞或胚胎，點擊BLS細胞融合儀的電源按鈕進行電激活；

c、電激活結(jié)束后將激活的卵母細胞或胚胎放入添加干擾RNA的體外操作液T2：HEPES-TCM199+2%CS中，放置1～2小時；

d、隨后把卵母細胞或胚胎放入裝有化學激活液的化學激活盤中，化學激活液為胚胎體外培養(yǎng)液+10ug/ml放線菌酮+5ug/ml細胞松弛素B，在38.5℃、5%CO₂、20% O₂、100%H₂O的培養(yǎng)箱中繼續(xù)化學激活4～6小時，至此完成該RNA干擾過程。

所述步驟a和步驟c中的干擾RNA為吉瑪基因股份有限公司提供的FAM熒光標記的LIPIN1干擾RNA，且步驟a和步驟c中的干擾RNA的濃度為200～400nmol/L。

所述步驟b中的待激活的卵母細胞或胚胎包括無透明帶的卵母細胞或胚胎和有透明帶的卵母細胞或者胚胎，其中無透明帶的卵母細胞或胚胎的電激活參數(shù)為：0.86kV/cm、80μs、3次脈沖；有透明帶的卵母細胞或者胚胎的電激活參數(shù)為：1.26kV/cm、80μs、3次脈沖。

所述步驟b中的有透明帶的卵母細胞或者胚胎去除透明帶的過程為：把有透明帶的卵母細胞或者胚胎放入1mg/mL鏈酶蛋白酶中消化2～3min，接著交替在體外操作液T20：HEPES- TCM199+20%CS、體外操作液T2：HEPES- TCM199+2%CS中依次分別洗2～3遍，每遍30s，透明帶被消化后將無透明帶的卵母細胞或胚胎保存在體外操作液T2中備用。

所述步驟a中的添加100～150ul的電激活液F+覆蓋電激活槽后，再在電激活液F+上覆蓋石蠟油以防電激活液F+揮發(fā)。

所述步驟a、步驟b、步驟c的處理過程在18℃-25℃的溫度下進行。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)有如下優(yōu)點：

本發(fā)明的電激活設(shè)備通過在平行電極上設(shè)置一個彎折部，使得連接正、負電源線的平行電極前端與構(gòu)成電激活槽的平行電極得以分離構(gòu)成一種新型結(jié)構(gòu)的電激活設(shè)備，該電激活設(shè)備的電激活槽能夠同時處理10-20個卵母細胞或者胚胎，操作簡單、效率較高。

本發(fā)明提供的卵母細胞或者胚胎的RNA干擾新方法簡單有效，達到了RNA干擾的目的，避免了顯微注射針對卵母細胞或者胚胎的傷害，并解決了無透明帶的卵母細胞或者胚胎的RNA干擾問題，節(jié)約成本和資源。

附圖說明

附圖1為本發(fā)明的電激活設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖；

附圖2為本發(fā)明的電激活設(shè)備應用在RNA干擾新方法中覆蓋電激活液時的狀態(tài)示意圖；

附圖3為本發(fā)明的實施例一-實施例五，分別是在F+和T2培養(yǎng)液中不同的方式添加用FAM標記的干擾RNA后，收集化學激活后24小時的胚胎，4 %多聚甲醛固定半小時，用PBS（磷酸鹽緩沖溶液）壓片，并用激光共聚焦顯微鏡拍照后得到的效果圖；

附圖4為本發(fā)明的實施例六的，針對LIPIN1的mRNA設(shè)計了三個干擾RNA，分別是LIPIN1-pig-85、LIPIN1-pig-242和LIPIN1-pig-586，收集化學激活后24小時樣品，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ,通過熒光定量PCR對RNA干擾后基因表達情況進行統(tǒng)計分析；

附圖5為本發(fā)明的實施例七的為了篩選出最佳的干擾濃度，分別設(shè)置了空白對照（control）,陰性對照（RNAi negative control與哺乳動物基因無同源性，）200nM,400nM,600nM,800nM的濃度，對無透明帶的卵母細胞進行干擾，收集化學激活后24小時的樣品，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ,通過熒光定量PCR對不同濃度RNA干擾后基因表達情況進行統(tǒng)計分析。

其中：1—平行電極；2—彎折部；3—小容器；4—大容器；5—電激活槽。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖與實施例對本發(fā)明作進一步的說明。

如圖1所示：一種電激活設(shè)備，包括平行電極1、小容器3和大容器4，小容器3放置在大容器4內(nèi)，在平行電極1上設(shè)有一突起的彎折部2，該彎折部2至該平行電極1前端的距離為整個平行電極1長度的1/4～1/3，且彎折部2的豎直高度大于小容器3的邊緣豎直高度，彎折部2使得該平行電極1的前端能夠繞過小容器3的邊緣并落入大容器4中，且該平行電極1的前端分別與正、負電源線電性相連，落入小容器3內(nèi)的平行電極2之間的區(qū)域構(gòu)成電激活槽5；另外位于小容器3和大容器4內(nèi)的平行電極2之間的間距固定，同時位于小容器3內(nèi)的平行電極2的后端整體膠封且位于大容器4內(nèi)的平行電極1的兩條電極分別膠封。該電激活設(shè)備通過在平行電極1上設(shè)置一個彎折部2，使得連接正、負電源線的平行電極1前端與構(gòu)成電激活槽5的平行電極1得以分離構(gòu)成一種新型結(jié)構(gòu)的電激活設(shè)備，該電激活設(shè)備的電激活槽5能夠同時處理10-20個卵母細胞或者胚胎，操作簡單、效率較高。

如圖2所示：一種采用電激活設(shè)備的卵母細胞或者胚胎的RNA干擾新方法，該新方法的步驟如下：a、在小容器內(nèi)的平行電極上添加含有干擾RNA的100～150ul電激活液F+以覆蓋電激活槽，再在電激活液F+上覆蓋石蠟油以防電激活液F+揮發(fā)，電激活液F+為0.3mol/L甘露醇、0.1mmol/L硫酸鎂、0.05nmol/L氯化鈣、0.01%g/L聚乙烯醇混合構(gòu)成；b、將平行電極的前端連接BLS細胞融合儀的正、負電極，在電激活槽中以每組10-20個的數(shù)量放入待激活的卵母細胞或胚胎，點擊BLS細胞融合儀的電源按鈕進行電激活；c、電激活結(jié)束后將激活的卵母細胞或胚胎放入添加干擾RNA的體外操作液T2：HEPES-TCM199+2%CS中，放置1～2小時；d、隨后把卵母細胞或胚胎放入裝有化學激活液的化學激活盤中，化學激活液為胚胎體外培養(yǎng)液+10ug/ml放線菌酮+5ug/ml細胞松弛素B，在38.5℃、5%CO₂、20% O₂、100%H₂O的培養(yǎng)箱中繼續(xù)化學激活4～6小時，至此完成該RNA干擾過程，需要說明的是：步驟a、步驟b、步驟c的處理過程在18℃-25℃的溫度下進行。在上述步驟中，步驟a和步驟c中的干擾RNA的濃度為200～400nmol/L；步驟a和步驟c中的干擾RNA為吉瑪基因股份有限公司提供的FAM熒光標記的LIPIN1干擾RNA，同時針對LIPIN1的三個片段設(shè)計了三個干擾RNA，分別是LIPIN1-pig-85、LIPIN1-pig-242和LIPIN1-pig-586，經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)LIPIN1-pig-586的干擾效果最佳，故選擇LIPIN1-pig-586為證明本發(fā)明有效性的干擾RNA。步驟b中的待激活的卵母細胞或胚胎包括無透明帶的卵母細胞或胚胎和有透明帶的卵母細胞或者胚胎，其中無透明帶的卵母細胞或胚胎的電激活參數(shù)為：0.86kV/cm、80μs、3次脈沖；有透明帶的卵母細胞或者胚胎的電激活參數(shù)為：1.26kV/cm、80μs、3次脈沖。當步驟b中的卵母細胞或者胚胎為有透明帶的卵母細胞或者胚胎時，則去除透明帶的過程為：把有透明帶的卵母細胞或者胚胎放入1mg/mL鏈酶蛋白酶中消化2～3min，接著交替在體外操作液T20：HEPES- TCM199+20%CS、體外操作液T2：HEPES- TCM199+2%CS中依次分別洗2～3遍，每遍30s，透明帶被消化后將無透明帶的卵母細胞或胚胎保存在體外操作液T2中備用。

下面通過具體實施例和作為對比例的實施例來進一步說明本發(fā)明提供的卵母細胞或者胚胎的RNA干擾新方法。

實施例一：該組使用未改良的激活槽，在激活前便將去透明帶的豬卵母細胞或胚胎放入用T2稀釋的干擾RNA液滴中2小時，之后再放入無RNA添加的激活液中激活，結(jié)束后直接放入化學激活液化學激活4小時，收集化學激活后24小時的胚胎，4 %多聚甲醛固定半小時，用PBS（磷酸鹽緩沖溶液）壓片，并用激光共聚焦顯微鏡拍照后得到的效果圖。

實施例二：該組使用改良后的激活槽，同時在激活液F+中添加干擾RNA，之后放入有干擾RNA添加的T2中室溫放置2小時，結(jié)束后放入化學激活液中化學激活4小時，收集化學激活后24小時的胚胎，4 %多聚甲醛固定半小時，用PBS（磷酸鹽緩沖溶液）壓片，并用激光共聚焦顯微鏡拍照后得到的效果圖，點狀物為進入卵母細胞（球狀物）的FAM標記的干擾RNA。

實施例三：該組使用改良后的激活槽，同時在激活液F+中添加干擾RNA，之后放入無干擾RNA添加的T2中室溫放置2小時，結(jié)束后放入化學激活液中化學激活4小時，收集化學激活后24小時的胚胎，4 %多聚甲醛固定半小時，用PBS（磷酸鹽緩沖溶液）壓片，并用激光共聚焦顯微鏡拍照后得到的效果圖。

實施例四：該組使用未改良的激活槽，激活液中無干擾RNA添加，激活后放入含有干擾RNA添加的T2中室溫放置2小時，結(jié)束后直接放入化學激活液化學激活4小時，收集化學激活后24小時的胚胎，4 %多聚甲醛固定半小時，用PBS（磷酸鹽緩沖溶液）壓片，并用激光共聚焦顯微鏡拍照后得到的效果圖。

實施例五：該組為使用未改良的激活槽，為對照組，同時在激活液和體外操作液T2中不添加干擾RNA，在激活結(jié)束后在T2中室溫放置2小時，結(jié)束后直接放入化學激活液化學激活4小時，收集化學激活后24小時的胚胎，4 %多聚甲醛固定半小時，用PBS（磷酸鹽緩沖溶液）壓片，并用激光共聚焦顯微鏡拍照后得到的效果圖。

實施例一-五中均采用FAM標記的陰性對照干擾RNA，點狀物表明進入卵母細胞（球狀物）的干擾RNA，證明干擾RNA可以通過本發(fā)明所提供的方法進入到卵母細胞或胚胎內(nèi)。

為了證明RNA干擾的實際效果，下面以LIPIN1基因的干擾為例：

實施例六：針對LIPIN1的mRNA設(shè)計了三個干擾RNA，分別是LIPIN1-pig-85、LIPIN1-pig-242和LIPIN1-pig-586，收集化學激活后24小時樣品，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ,通過熒光定量PCR，對RNA干擾后基因表達情況進行統(tǒng)計分析。

實施例七：分別設(shè)置了空白對照（control）,陰性對照（RNAi negative control與哺乳動物基因無同源性，）200nM,400nM,600nM,800nM的濃度，對無透明帶的卵母細胞進行干擾，收集化學激活后24小時的樣品，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ,通過熒光定量PCR，對不同濃度RNA干擾后基因表達情況進行統(tǒng)計分析。

本發(fā)明提供的卵母細胞或者胚胎的RNA干擾新方法簡單有效，達到了RNA干擾的目的，避免了顯微注射針對卵母細胞或者胚胎的傷害，并解決了無透明帶的卵母細胞或者胚胎的RNA干擾問題，節(jié)約成本和資源。

以上實施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍，凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想，在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動，均落入本發(fā)明保護范圍之內(nèi)；本發(fā)明未涉及的技術(shù)均可通過現(xiàn)有技術(shù)加以實現(xiàn)。