本發(fā)明涉及一種靶向融合蛋白，具體涉及一種抗hbv復(fù)制的靶向融合蛋白及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

乙型肝炎病毒(hbv)感染是引起乙型肝炎、肝硬化和肝癌的主要病因。全世界hbv感染者約3.5億，而中國就有約1.3億，其中慢性乙型肝炎患者約3000萬。慢性hbv感染難以根治，原因在于感染細(xì)胞的核內(nèi)hbvccc

dna很難徹底清除，而hbvcccdna是病毒復(fù)制的核心物質(zhì)。因此尋找有效清除cccdna的方法，是當(dāng)今抗hbv研究的重要目標(biāo)。

近年研究發(fā)現(xiàn)，干擾素α(ifnα)不僅能從hbv生命周期的多環(huán)節(jié)抑制病毒復(fù)制，更重要的是能誘發(fā)特異性cccdna降解。但是該藥容易產(chǎn)生耐受性和許多副作用,使治療失敗。ifn-α誘發(fā)特異性cccdna降解的機(jī)制是：ifn-α可誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)載脂蛋白bmrna編輯酶催化多肽apobec3a(a3a)，a3a可使cccdna的dc脫氨基變成du，進(jìn)而尿嘧啶dna糖基化酶2(ung2)識(shí)別dna中du啟動(dòng)堿基切除修復(fù)，最終引起cccdna特異性降解。而在肝細(xì)胞中a3a和ung2均為低表達(dá)，且誘導(dǎo)表達(dá)的a3a主要位于細(xì)胞質(zhì)中，因此要利用a3a和ung2的上述作用機(jī)制，并且增強(qiáng)其誘導(dǎo)cccdna降解作用，就應(yīng)使肝細(xì)胞表達(dá)a3a和ung2，并使他們能定位到核內(nèi)與cccdna特異結(jié)合，這樣才可能提高降解cccdna的作用。為此，我們通過構(gòu)建具有靶向cccdna的融合a3a和ung2蛋白分子，獲得更強(qiáng)的抗hbv復(fù)制效應(yīng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種抗hbv復(fù)制的靶向融合蛋白組合及其構(gòu)建方法，實(shí)現(xiàn)a3a和ung2對(duì)cccdna的靶向性，以獲得更強(qiáng)的抑制病毒復(fù)制的效應(yīng)。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

抗hbv復(fù)制的靶向融合蛋白，其特征在于：

包括a3a-hbc144融合蛋白和hbc144-ung2融合蛋白；

a3a-hbc144中，a3a與hbc144由linker相連；

hbc144-ung2中，hbc144與ung2由linker相連。

a3a-hbc144融合蛋白中的a3a、linker和hbc144氨基酸序列分別為：

a3a氨基酸序列:

measpasgprhlmdphiftsnfnngigrhktylcyeverldngtsvkmdqhrgflhnqaknllcgfygrhaelrfldlvpslqldpaqiyrvtwfiswspcfswgcagevraflqenthvrlrifaariydydplykealqmlrdagaqvsimtydefkhcwdtfvdhqgcpfqpwdgldehsqalsgrlrailqnqgn

linker氨基酸序列:leggggsggggs

hbc144氨基酸序列:

pettvvrrrgrsprrrtpsprrrrsqsprrrrsqsresqc

a3a-hbc144融合蛋白中的a3a、linker和hbc144的核酸序列分別為：

a3a編碼基因的核酸序列：

5’-atggaagccagcccagcatccgggcccagacacttgatggatccacacatattcacttccaactttaacaatggcattggaaggcataagacctacctgtgctacgaagtggagcgcctggacaatggcacctcggtcaagatggaccagcacaggggctttctacacaaccaggctaagaatcttctctgtggcttttacggccgccatgcggagctgcgcttcttggacctggttccttctttgcagttggacccggcccagatctacagggtcacttggttcatctcctggagcccctgcttctcctggggctgtgccggggaagtgcgtgcgttccttcaggagaacacacacgtgagactgcgtatcttcgctgcccgcatctatgattacgaccccctatataaggaggcactgcaaatgctgcgggatgctggggcccaagtctccatcatgacctacgatgaatttaagcactgctgggacacctttgtggaccaccagggatgtcccttccagccctgggatggactagatgagcacagccaagccctgagtgggaggctgcgggccattctccagaatcagggaaac-3’

linker的核酸序列：

5’-ctggagggtggcggtggaagcggtggtggcggaagc-3’

hbc144的核酸序列：

5’-ccggaaactactgttgttagacgacgaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgccgcgtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgttag-3’。

hbc144-ung2融合蛋白中的hbc144、linker和ung2氨基酸序列分別為：

hbc144氨基酸序列:

mpettvvrrrgrsprrrtpsprrrrsqsprrrrsqsresqc

linker氨基酸序列:

leggggsggggs

ung2氨基酸序列:

aipakkapagqeepgtppssplsaeqldriqrnkaaallrlaarnvpvgfgeswkkhlsgefgkpyfiklmgfvaeerkhytvyppphqvftwtqmcdikdvkvvilgqdpyhgpnqahglcfsvqrpvppppsleniykelstdiedfvhpghgdlsgwakqgvlllnavltvrahqanshkergweqftdavvswlnqnsnglvfllwgsyaqkkgsaidrkrhhvlqtahpsplsvyrgffgcrhfsktnellqksgkkpidwkel。

hbc144-ung2融合蛋白中的hbc144、linker和ung2的編碼基因核酸序列分別為：

hbc144的核酸序列：

5’-atgccggaaactactgttgttagacgacgaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgccgcgtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgt-3’

linker的核酸序列：

5’-ctggagggtggcggtggaagcggtggtggcggaagc-3’

ung2的核酸序列：

5’-gccatcccagccaagaaggccccggctgggcaggaggagcctgggacgccgccctcctcgccgctgagtgccgagcagttggaccggatccagaggaacaaggccgcggccctgctcagactcgcggcccgcaacgtgcccgtgggctttggagagagctggaagaagcacctcagcggggagttcgggaaaccgtattttatcaagctaatgggatttgttgcagaagaaagaaagcattacactgtttatccacccccacaccaagtcttcacctggacccagatgtgtgacataaaagatgtgaaggttgtcatcctgggacaggatccatatcatggacctaatcaagctcacgggctctgctttagtgttcaaaggcctgttccgcctccgcccagtttggagaacatttataaagagttgtctacagacatagaggattttgttcatcctggccatggagatttatctgggtgggccaagcaaggtgttctccttctcaacgctgtcctcacggttcgtgcccatcaagccaactctcataaggagcgaggctgggagcagttcactgatgcagttgtgtcctggctaaatcagaactcgaatggccttgttttcttgctctggggctcttatgctcagaagaagggcagtgccattgataggaagcggcaccatgtactacagacggctcatccctcccctttgtcagtgtatagagggttctttggatgtagacacttttcaaagaccaatgagctgctgcagaagtctggcaagaagcccattgactggaaggagctgtga-3’。

如所述的抗hbv復(fù)制的靶向融合蛋白的構(gòu)建方法，其特征在于：

去除hbc的結(jié)構(gòu)區(qū)，保留hbc的ctd非結(jié)構(gòu)區(qū)作為靶向分子，記為hbc144；

合成a3a-hbc144編碼基因序列和hbc144-ung2的編碼基因序列，并將這兩段序列克隆到真核表達(dá)載體pvitro2-neo-mcs的多克隆位點(diǎn)mcs1和mcs2上，構(gòu)建成重組雙表達(dá)載體pvitro2-a3a-hbc/hbc-ung2。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明設(shè)計(jì)了由hbc144引導(dǎo)的，可靶向cccdna的融合蛋白a3a-hbc144和hbc144-ung2,構(gòu)建了可表達(dá)這兩種融合蛋白的表達(dá)載體，并獲得了更強(qiáng)抑制hbv復(fù)制的效應(yīng)。為了構(gòu)建以hbv核心蛋白(hbc)的c端核酸結(jié)合區(qū)(hbc144)為導(dǎo)向分子的，a3a-hbc和hbc-ung2兩種融合蛋白，根據(jù)hbc144、a3a和ung2的基因序列，分別合成a3a-hbc融合蛋白和hbc-ung2融合蛋白的編碼基因序列，然后將這兩個(gè)融合蛋白的編碼基因分別克隆到真核表達(dá)載體pvitro2-neo-mcs的多克隆位點(diǎn)mcs1(bamhi-salⅰ)和mcs2(bglⅱ-xhoⅰ)位點(diǎn)上，構(gòu)建成重組雙表達(dá)載體pvitro2-a3a-hbc-ung2。該質(zhì)?？稍谡婧思?xì)胞中同時(shí)表達(dá)a3a-hbc和hbc-ung2兩種融合蛋白。hbc144作為引導(dǎo)分子，可以引導(dǎo)a3a和ung2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與cccdna結(jié)合，其中，a3a-hbc發(fā)揮對(duì)cccdna上的胞嘧啶的脫氨基作用,使胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而hbc-ung2發(fā)揮切除尿嘧啶作用,協(xié)同促進(jìn)下游cccdna降解反應(yīng)的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)顯示該重組雙表達(dá)載體比單獨(dú)表達(dá)a3a或a3a-hbc的載體具有更強(qiáng)的抑制hbv病毒復(fù)制的作用。

附圖說明

圖1為pvitro2-a3a-hbc/hbc-ung2的結(jié)構(gòu)。

圖2為a3a-hbc144定位于細(xì)胞核免疫熒光照片。

圖3為hbc-ung2定位于細(xì)胞核免疫熒光照片。

圖4為表達(dá)載體表達(dá)蛋白的wb照片，a3a、融合蛋白a3a-hbc和雙融合蛋白a3a-hbc/hbc-ung2在hepg2.2.15的表達(dá)westernbloting結(jié)果。

圖5為不同組轉(zhuǎn)染組的hep2.2.15細(xì)胞存活率用mtt實(shí)驗(yàn)分析。

圖6為a3a-hbc144融合蛋白結(jié)構(gòu)圖。

圖7為hbc144-ung2融合蛋白結(jié)構(gòu)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。

本發(fā)明為了增強(qiáng)a3a和ung2降解cccdna的作用，將a3a和ung2定位到細(xì)胞核并特異結(jié)合cccdna的特性，將hbv核心蛋白(hbc)作為a3a和ung2的靶向分子，引導(dǎo)a3a和ung2進(jìn)入核內(nèi)與cccdna結(jié)合，發(fā)揮降解cccdna的作用。hbc是組裝病毒核衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白，具有特異結(jié)合hbvcccdna的特性，而決定該特征的區(qū)域是hbc的c端區(qū)域(ctd)，同時(shí)該區(qū)域還具有細(xì)胞核定位功能。

hbc為hbv核心蛋白，是組裝病毒核衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白。hbc長183aa，分為n端區(qū)(1-143aa)和c端區(qū)(ctd)(144-183aa)兩部分。n端區(qū)為組裝核心顆粒的結(jié)構(gòu)區(qū)；ctd為非結(jié)構(gòu)區(qū)，含有4個(gè)精氨酸基序(ard-i，ard-ii，ard-iii和ard-iv)和3個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)(如圖1)。研究發(fā)現(xiàn)全長的hbc，由于其在細(xì)胞質(zhì)中參與形成病毒核衣殼，因而大部分會(huì)滯留于細(xì)胞質(zhì)中。為此，本發(fā)明去除hbc的結(jié)構(gòu)區(qū)，只用hbc的ctd非結(jié)構(gòu)區(qū)(144-183)作為靶向分子，稱之為hbc144。合成a3a-hbc144編碼基因序列和hbc144-ung2的編碼基因序列，并將這兩段序列分別克隆到真核表達(dá)載體pvitro2-neo-mcs的多克隆位點(diǎn)mcs1(bamhi-salⅰ)和mcs2(bglⅱ-xhoⅰ)位點(diǎn)上，構(gòu)建成重組雙表達(dá)載體pvitro2-a3a-hbc/hbc-ung2。該載體可在真核細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)a3a-hbc和hbc-ung2兩種融合蛋白。實(shí)驗(yàn)證明該重組載體比單獨(dú)表達(dá)a3a或a3a-hbc的載體具有更強(qiáng)的抑制病毒復(fù)制的作用。

構(gòu)建的兩個(gè)融合蛋白的結(jié)構(gòu)、氨基酸序列和核酸序列如下：

1、a3a-hbc144融合蛋白

(1)a3a-hbc144融合蛋白結(jié)構(gòu)圖，如圖6：其中a3a與hbc144由linker相連。

(2)a3a-hbc144融合蛋白中的a3a、linker和hbc144氨基酸序列：

a3a氨基酸序列:199個(gè)氨基酸殘基(199aa)

measpasgprhlmdphiftsnfnngigrhktylcyeverldngtsvkmdqhrgflhnqaknllcgfygrhaelrfldlvpslqldpaqiyrvtwfiswspcfswgcagevraflqenthvrlrifaariydydplykealqmlrdagaqvsimtydefkhcwdtfvdhqgcpfqpwdgldehsqalsgrlrailqnqgn

linker氨基酸序列:12個(gè)氨基酸殘基(12aa)

leggggsggggs

hbc144氨基酸序列:40個(gè)氨基酸殘基(40aa)

pettvvrrrgraprrrtpaprrrrsqaprrrrsqsresqc

(3)a3a-hbc144融合蛋白中a3a、linker和hbc144的核酸序列：

a3a編碼基因的核酸序列：597個(gè)堿基對(duì)(597bp)

5’-atggaagccagcccagcatccgggcccagacacttgatggatccacacatattcacttccaactttaacaatggcattggaaggcataagacctacctgtgctacgaagtggagcgcctggacaatggcacctcggtcaagatggaccagcacaggggctttctacacaaccaggctaagaatcttctctgtggcttttacggccgccatgcggagctgcgcttcttggacctggttccttctttgcagttggacccggcccagatctacagggtcacttggttcatctcctggagcccctgcttctcctggggctgtgccggggaagtgcgtgcgttccttcaggagaacacacacgtgagactgcgtatcttcgctgcccgcatctatgattacgaccccctatataaggaggcactgcaaatgctgcgggatgctggggcccaagtctccatcatgacctacgatgaatttaagcactgctgggacacctttgtggaccaccagggatgtcccttccagccctgggatggactagatgagcacagccaagccctgagtgggaggctgcgggccattctccagaatcagggaaac-3’(下劃線序列為起始密碼子，翻譯為m氨基酸)

linker的核酸序列：36個(gè)堿基對(duì)(36bp)

5’-ctggagggtggcggtggaagcggtggtggcggaagc-3’

hbc144的核酸序列：123個(gè)堿基對(duì)(123bp)

5’-ccggaaactactgttgttagacgacgaggcagggcccctagaagaagaactcccgctcctcgcagacgaaggtctcaagctccgcgtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgttag-3’(下劃線序列為終止密碼子，不翻譯氨基酸)

2、hbc144-ung2融合蛋白

(1)hbc144-ung2融合蛋白結(jié)構(gòu)圖，如圖7：其中hbc144與ung2由linker2相連。

(2)hbc144-ung2融合蛋白中的hbc144、linker和ung2氨基酸序列：

hbc144氨基酸序列:41個(gè)氨基酸殘基(41aa)

mpettvvrrrgraprrrtpaprrrrsqaprrrrsqsresqc

linker氨基酸序列:12個(gè)氨基酸殘基(12aa)

leggggsggggs

ung2氨基酸序列:269個(gè)氨基酸殘基(269aa)

aipakkapagqeepgtppssplsaeqldriqrnkaaallrlaarnvpvgfgeswkkhlsgefgkpyfiklmgfvaeerkhytvyppphqvftwtqmcdikdvkvvilgqdpyhgpnqahglcfsvqrpvppppsleniykelstdiedfvhpghgdlsgwakqgvlllnavltvrahqanshkergweqftdavvswlnqnsnglvfllwgsyaqkkgsaidrkrhhvlqtahpsplsvyrgffgcrhfsktnellqksgkkpidwkel

(3)hbc144-ung2融合蛋白中hbc144、linker和ung2的編碼基因核酸序列：

hbc144的核酸序列：123個(gè)堿基對(duì)(123bp)

5’-atgccggaaactactgttgttagacgacgaggcagggcccctagaagaagaactcccgctcctcgcagacgaaggtctcaagctccgcgtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgt-3’(下劃線序列為起始密碼子,翻譯為m氨基酸)

linker的核酸序列：36個(gè)堿基對(duì)(36bp)

5’-ctggagggtggcggtggaagcggtggtggcggaagc-3’

ung2的核酸序列：810個(gè)堿基對(duì)(810bp)

5’-gccatcccagccaagaaggccccggctgggcaggaggagcctgggacgccgccctcctcgccgctgagtgccgagcagttggaccggatccagaggaacaaggccgcggccctgctcagactcgcggcccgcaacgtgcccgtgggctttggagagagctggaagaagcacctcagcggggagttcgggaaaccgtattttatcaagctaatgggatttgttgcagaagaaagaaagcattacactgtttatccacccccacaccaagtcttcacctggacccagatgtgtgacataaaagatgtgaaggttgtcatcctgggacaggatccatatcatggacctaatcaagctcacgggctctgctttagtgttcaaaggcctgttccgcctccgcccagtttggagaacatttataaagagttgtctacagacatagaggattttgttcatcctggccatggagatttatctgggtgggccaagcaaggtgttctccttctcaacgctgtcctcacggttcgtgcccatcaagccaactctcataaggagcgaggctgggagcagttcactgatgcagttgtgtcctggctaaatcagaactcgaatggccttgttttcttgctctggggctcttatgctcagaagaagggcagtgccattgataggaagcggcaccatgtactacagacggctcatccctcccctttgtcagtgtatagagggttctttggatgtagacacttttcaaagaccaatgagctgctgcagaagtctggcaagaagcccattgactggaaggagctgtga-3’(下劃線序列為終止密碼子，不翻譯氨基酸)。

以乙肝病毒感染的細(xì)胞系hepg2.2.15為細(xì)胞模型，以細(xì)胞培養(yǎng)上清hbvdna、hbsag和hbeag的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)價(jià)a3a、單融合蛋白a3a-hbc14和雙融合蛋白a3a-hbc/hbc-ung2的表達(dá)對(duì)hbv復(fù)制的抑制作用。

1、以5×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔的量將hepg2.2.15細(xì)胞接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入dmem培養(yǎng)基置于37℃、5％co2培養(yǎng)過夜，匯合度達(dá)到60-70％進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2、取質(zhì)粒1.25pmol用150ul無血清培養(yǎng)基稀釋，然后將15μl轉(zhuǎn)染試劑(x-tremegenehpdna)加至含稀釋dna的培養(yǎng)基中配成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，室溫孵育20分鐘后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后，每3天換一次培養(yǎng)液(fbs濃度度改為2％)，收集上清培養(yǎng)液(為分析上清培養(yǎng)液中的hbv指標(biāo)變化)或收集細(xì)胞(為分析細(xì)胞內(nèi)hbvdna)。

3、收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

轉(zhuǎn)染第3天、第6天時(shí)，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液1.5ml，用高速臺(tái)式離心機(jī)(tg16-ws)10000r/min，離心5min，吸取上清培養(yǎng)液-70℃保存。實(shí)驗(yàn)設(shè)立三組重復(fù)。

4、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乙肝病毒抗原檢測

hbsag和hbeag檢測采用雅培i2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑。

5、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中hbvdna提取及定量

hepg2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的hbvdna的提取，用病毒基因組dna/rna提取試劑盒(dp315，天根)提取hbvdna。采用熒光定量pcr進(jìn)行hbvdna定量檢測，試劑采用乙型肝炎病毒(hbv)核酸定量檢測試劑盒(pcr-熒光探針法)(達(dá)安基因股份有限公司，廣州)。試劑盒檢測范圍為3.0—8.0logcopies/ml。

6、統(tǒng)計(jì)分析

各組至少設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，結(jié)果數(shù)據(jù)為平均值。采用方差分析或秩和檢驗(yàn)確定數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)意義。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的檢驗(yàn)水準(zhǔn)為p<0.05。

(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)

不同組轉(zhuǎn)染組的hep2.2.15細(xì)胞存活率用mtt實(shí)驗(yàn)分析。分別檢測轉(zhuǎn)染后1天、3天、6天、9天的細(xì)胞。結(jié)果顯示：以第3天空白對(duì)照組細(xì)胞的od值為100％，從第3天、第6天到第9天，a3a表達(dá)組、單融合表達(dá)a3a-hbc組、雙融合表達(dá)a3a-hbc/hbc-ung2組和空白對(duì)照組hep2.2.15細(xì)胞存活率有下降的趨勢，其中第9天各組細(xì)胞存活數(shù)量較各組第3天和第6天時(shí)的存活細(xì)胞數(shù)下降顯著(p<0.05)；在各時(shí)間點(diǎn)上，空白對(duì)照組、a3a表達(dá)組、單融合表達(dá)a3a-hbc和雙融合表達(dá)a3a-hbc/hbc-ung2組的hep2.2.15細(xì)胞存活數(shù)之間沒有顯著差異。說明在觀察的時(shí)間內(nèi)，所采用的轉(zhuǎn)染和表達(dá)條件對(duì)細(xì)胞沒有顯著毒性。鑒于第9天活細(xì)胞數(shù)較之前時(shí)間點(diǎn)降低顯著，因此抗病毒作用實(shí)驗(yàn)將第3天和第6天納入觀察時(shí)間點(diǎn)。見圖5。

2、重組表達(dá)載體的表達(dá)對(duì)細(xì)胞上清液中病毒蛋白標(biāo)志物的影響

實(shí)驗(yàn)分四組，分別為：空白照組(group1)：轉(zhuǎn)染pvitro2空載體；a3a表達(dá)組(group2)：轉(zhuǎn)染pvitro2-a3a重組質(zhì)粒；單融合表達(dá)組(group3)：轉(zhuǎn)染pvitro2-a3a-hbc重組質(zhì)粒；雙融合表達(dá)組(group4)：轉(zhuǎn)染pvitro2-a3a-hbc/hbc-ung2重組質(zhì)粒。每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

取各質(zhì)粒1.25pmol轉(zhuǎn)染hepg2.2.15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后第3天、第6天分別吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清，用化學(xué)發(fā)光法檢測上清中hbsag和hbeag含量。

在第3天，a3a表達(dá)組(group2)、單融合表達(dá)組(group3)和雙融合表達(dá)組(group4)與空白組(group1)相比，hbsag和hbeag含量無顯著改變，僅是單融合表達(dá)組(group3)和雙融合表達(dá)組(group4)的hbsag含量與空白對(duì)照相比分別降低5.47％和7.29％(p>0.05)，而在hbeag含量指標(biāo)方面，只有雙融合表達(dá)組(group4)與空白對(duì)照相比hbeag含量降低6.55％(p>0.05)。

在第6天，a3a表達(dá)組(group2)、單融合表達(dá)組(group3)和雙融合表達(dá)組(group4)與空白組(group1)相比，hbsag和hbeag含量均有顯著降低。在hbsag含量指標(biāo)方面，a3a表達(dá)組、單融合表達(dá)組(group3)和雙融合表達(dá)組(group4)的hbsag含量與空白對(duì)照相比分別降低19.32％、23.50％、40.64％(p<0.05)，而且雙融合表達(dá)組(group4)的hbsag含量降低程度顯著大于a3a表達(dá)組(group2)和單融合表達(dá)組(group3)，而后兩者之間的hbsag含量降低程度物顯著差異，提示pvitro2-a3a-hbc/hbc-ung2雙融合蛋白表達(dá)對(duì)hbsag含量有更強(qiáng)抑制作用；而在hbeag含量指標(biāo)方面，a3a表達(dá)組、單融合表達(dá)組(group3)和雙融合表達(dá)組(group4)的hbeag含量與空白對(duì)照相比分別降低23.72％、26.57％和49.86％，且降低程度均具有顯著性(p<0.05)。同樣，其中雙融合表達(dá)組(group4)的hbeag含量降低程度(49.86％)顯著大于a3a表達(dá)組(23.72％)和單融合表達(dá)組(26.57％)，而后兩者之間的hbeag含量降低程度物顯著差異，提示pvitro2-a3a-hbc/hbc-ung2雙融合蛋白表達(dá)對(duì)hbeag含量有更強(qiáng)抑制作用?？傊鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果提示pvitro2-a3a-hbc/hbc-ung2對(duì)hbv感染細(xì)胞分泌hbsag和hbeag具有更強(qiáng)的抑制作用。

3、重組表達(dá)載體的表達(dá)對(duì)細(xì)胞上清液中hbvdna含量的影響

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hepg2.2.15細(xì)胞后第3天、第6天分別吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清并提取hbvdna，用定量pcr檢測上清中hbvdna含量。第3天時(shí)，與空白對(duì)照相比，a3a表達(dá)組、單融合表達(dá)a3a-hbc組、雙融合表達(dá)a3a-hbc/hbc-ung2組中的hbvdna含量降低無顯著性(如表)，只是單融合表達(dá)組和雙融合表達(dá)組的hbvdna含量分別降低了7.32％、12.22％，但是該差異無顯著性(p>0.05)：第6天時(shí)，與空白對(duì)照相比，a3a表達(dá)組、單融合表達(dá)組、雙融合表達(dá)組的hbvdna含量降低均具有顯著性(p<0.05)(表)，分別降低51.82％、58.34％、79.10％。而且雙融合表達(dá)組的hbvdna含量降低(79.10％)程度顯著大于a3a表達(dá)組(51.82％)和單融合表達(dá)組(58.34％)，而后兩者之間的hbvdna含量降低程度無顯著性差異(p>0.05)。上述結(jié)果說明a3a、融合蛋白a3a-hbc和雙融合蛋白a3a-hbc/hbc-ung2的表達(dá)能夠抑制hbv病毒復(fù)制，而且雙融合蛋白a3a-hbc/hbc-ung2的表達(dá)具有較a3a和a3a-hbc的表達(dá)具有更強(qiáng)的抑制hbv復(fù)制的作用。

表1.各a3a融合蛋白對(duì)hbv抗原和hbvdna含量的影響

各組數(shù)據(jù)為各自五個(gè)平行重復(fù)孔的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，*代表與空白對(duì)照組group1相比差異具有顯著性，#代表與group2和group3相比差異具有顯著性，p＜0.05

三、結(jié)論：

通過比較各組內(nèi)在轉(zhuǎn)染后第3天、第6天點(diǎn)的hbv相關(guān)抗原和hbvdna含量降低的百分比，說明雙融合蛋白a3a-hbc/hbc-ung2表達(dá)，比a3a和單融合蛋白a3a-hbc表達(dá)，具有更強(qiáng)的抑制hbv復(fù)制的作用。

本發(fā)明的內(nèi)容不限于實(shí)施例所列舉，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過閱讀本發(fā)明說明書而對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案采取的任何等效的變換，均為本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。

sequencelisting

<110>中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)

<120>抗hbv復(fù)制的靶向融合蛋白及其構(gòu)建方法

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