本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種羥腈裂解酶及其基因、含有該基因的重組表達載體和重組表達轉(zhuǎn)化體，該重組羥腈裂解酶的制備，以及該重組羥腈裂解酶作為催化劑在催化芳香醛不對稱羥氰化以制備光學(xué)純手性α-氰醇中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：光學(xué)純α-氰醇的α-碳是一個手性碳原子，連接一個羥基和一個腈基，這些基團可以在保持手性的情況下轉(zhuǎn)化成其他各種基團，再加上氰醇分子中其他官能基團參與的轉(zhuǎn)化，可以生成多種手性化合物分子，其中許多化合物都具有生物活性。因此，光學(xué)純的α-氰醇在藥物和精細化學(xué)品的不對稱合成中占有重要地位。目前，光學(xué)純α-氰醇的立體選擇性制備已成為有機合成的重要研究領(lǐng)域。生物催化法是制備光學(xué)純氰醇的重要方法，一般使用羥腈裂解酶(Hydroxynitrilelyase,HNL)，催化氫氰酸與醛類或酮類化合物的不對稱加成反應(yīng)，獲得高光學(xué)純度的氰醇。目前，羥腈裂解酶的研究歷史已經(jīng)超過一個世紀(jì)，通過羥腈裂解酶催化，合成了許多具有重大經(jīng)濟價值的手性α-氰醇，不乏工業(yè)規(guī)模制備的案例。例如：來源于巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)的(S)-羥腈裂解酶(HbHNL)能催化3-苯氧基苯甲醛與氫氰酸不對稱加成制備(S)-3-苯氧基扁桃腈，后者是具有巨大市場前景的擬除蟲菊酯類殺蟲劑化合物的前體，目前其產(chǎn)率高達1000gL-1d-1，產(chǎn)物的ee值高于98.5％(Chim.Oggi.1998,16,15-19)。使用分子改造的苦杏仁(Prunusamygdalus)羥腈裂解酶5號同工酶作為催化劑，催化2-氯苯甲醛的不對稱羥氰化反應(yīng)合成抗凝血劑氯吡格雷合成前體(R)-2-氯扁桃腈，6h時轉(zhuǎn)化率達到98％以上，產(chǎn)物的ee值高于98％，反應(yīng)時空產(chǎn)率達到250gL-1d-1(ChemBioChem.2008,9,58–61)。類似的，使用理性設(shè)計改造的苦杏仁(Prunusamygdalus)羥腈裂解酶5號同工酶作為催化劑，催化苯丙醛與氫氰酸進行不對稱加成，合成非巰基血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的前體(R)-2-羥基-4-苯基丁腈，反應(yīng)10h，轉(zhuǎn)化率高于97％，產(chǎn)物的ee值大于99％(Angew.Chem.Int.Ed.2005,44,4700–4704)。然而，盡管在羥腈裂解酶的研究領(lǐng)域已取得突出成果，并有產(chǎn)業(yè)化的實例，該酶催化的反應(yīng)仍然存在一些共性的問題。由于底物醛的活性較高，容易發(fā)生自發(fā)的化學(xué)羥氰化反應(yīng)，而自發(fā)的化學(xué)反應(yīng)是沒有立體選擇性的；同時產(chǎn)物α-氰醇自身不穩(wěn)定，在高溫、高pH環(huán)境中容易發(fā)生自發(fā)消旋，因此酶促羥氰化反應(yīng)通常在低溫(4-10℃)、低pH(<4.5)的條件下進行；或者引入水-有機兩相體系或微水相體系，以避免自發(fā)的化學(xué)反應(yīng)，提高酶促反應(yīng)產(chǎn)物的光學(xué)純度。但是在低pH的環(huán)境中，絕大多數(shù)羥腈裂解酶不穩(wěn)定，反應(yīng)過程中活力迅速下降甚至直接失活。針對苦杏仁羥腈裂解酶催化的2-氯苯甲醛與氫氰酸加成合成(R)-2-氯扁桃腈的反應(yīng)過程中對映選擇性低的問題，將苦杏仁核仁粉碎脫脂后的種仁粉作為催化劑，在異丙醚微水相體系內(nèi)催化反應(yīng)，采用逐步流加底物的方法，可獲得ee值為82-91％的產(chǎn)物(Org.ProcessRes.Dev.,2003,7,828–831)。對純化后的苦杏仁羥腈裂解酶進行交聯(lián)，制備交聯(lián)酶聚集體，在異丙醚微水相體系中催化2-氯苯甲醛的羥氰化反應(yīng)，底物濃度達到0.5M，2h轉(zhuǎn)化率為98％，產(chǎn)物(R)-2-氯扁桃腈的ee值達到95％(Org.Lett.,2005,7,327–329)。(R)-4-甲硫基扁桃腈是廣譜抗生素氟苯尼考和甲砜霉素的合成前體，羥腈裂解酶可以催化4-甲硫基苯甲醛不對稱羥氰化合成(R)-4-甲硫基扁桃腈，但是目前已知的具有較廣底物譜的蘋果、枇杷、苦杏仁等植物種籽的脫脂種仁粉催化劑，對4-甲硫基苯甲醛的活性低，立體選擇性差，僅有巴達木(Prunuscommunis)脫脂種仁粉所含的羥腈裂解酶能催化4-甲硫基苯甲醛轉(zhuǎn)化，在異丙醚的微水相反應(yīng)體系中，12–24h內(nèi)催化0.5M的4-甲硫基苯甲醛完全轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物得率為96％，ee值為90-96％(Tetrahedron,2008,64,7822–7827)。由于巴達木脫脂種仁粉中羥腈裂解酶有效成分低，酶促反應(yīng)體系中催化劑使用量大；種仁中羥腈裂解酶的含量嚴(yán)重受季節(jié)因素以及產(chǎn)地的影響，不同來源的巴達木種籽中的羥腈裂解酶含量存在差異，此外不同批次酶促反應(yīng)的重復(fù)性較差，操作條件以及操作人員的水平嚴(yán)重影響產(chǎn)物光學(xué)純度的穩(wěn)定性。采用微水相反應(yīng)體系操作時，所有溶劑必須現(xiàn)場新鮮重蒸，嚴(yán)格控制體系中的水含量，如果反應(yīng)條件控制不好，產(chǎn)品光學(xué)純度低，需要進行重結(jié)晶后才能達到高于99％的ee值。巴達木所含羥腈裂解酶的分子特性及催化性能，至今尚無報道。而且與苦杏仁類似的是，巴達木羥腈裂解酶是以同工酶的形式存在，不同的同工酶在催化特性上可能具有很大的差異。因此有必要利用分子克隆技術(shù)將巴達木羥腈裂解酶基因克隆到微生物內(nèi)進行重組表達，不僅可以在短時間內(nèi)獲取大量的活性羥腈裂解酶，而且更關(guān)鍵的是獲得的重組羥腈裂解酶催化劑性能穩(wěn)定，使用重組酶催化反應(yīng)，反應(yīng)的可重復(fù)性好，易于操作，有利于獲得高光學(xué)純度的產(chǎn)品。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的問題是針對天然巴達木種籽中活性羥腈裂解酶含量低，進行微水相不對稱羥氰化反應(yīng)時產(chǎn)物的ee值不穩(wěn)定的嚴(yán)重缺陷，提供一種重組羥腈裂解酶及其制備方法，以該重組羥腈裂解酶作為催化劑在兩相反應(yīng)體系中催化潛手性芳香醛與氫氰酸不對稱羥氰化制備光學(xué)純α-氰醇的應(yīng)用。該應(yīng)用可在室溫下進行操作，生產(chǎn)效率高，產(chǎn)物光學(xué)純度高，工藝穩(wěn)定，操作簡便，易于放大。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：本發(fā)明提供的重組羥腈裂解酶PcHNL來源于產(chǎn)自中國新疆省的厚皮巴達木(Prunuscommunis)，在市場上易于獲得；其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示；或者是在保持由該羥腈裂解酶催化活力的前提下，插入、缺失，或替換如序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列中至少一個氨基酸而得到的變異的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及一種羥腈裂解酶基因，所述的核酸是編碼上述重組羥腈裂解酶PcHNL的核酸分子。其堿基序列優(yōu)選如序列表中SEQIDNo.1所示。如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知，本發(fā)明的羥腈裂解酶基因的堿基序列也可以是編碼如序列表SEQIDNo.2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的其他任何堿基序列。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明羥腈裂解酶基因的核苷酸序列的重組表達載體，其可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法將本發(fā)明的羥腈裂解酶基因的核苷酸序列連接于各種載體上構(gòu)建而成。所述的載體可以是本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體，如商業(yè)化的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，優(yōu)選質(zhì)粒pPICZαA。較佳的，可根據(jù)下述方式制得本發(fā)明的重組表達載體：將羥腈裂解酶PcHNL基因通過PCR擴增，所得的DNA產(chǎn)物片段與質(zhì)粒pMD-19T連接，形成的克隆載體pMD-19T-PcHNL與表達載體pPICZαA分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切，形成互補的粘性末端，再經(jīng)T4DNA連接酶連接，形成含有本發(fā)明的羥腈裂解酶基因的重組表達質(zhì)粒pPICZαA-PcHNL。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明所述羥腈裂解酶基因或其重組表達載體的重組表達轉(zhuǎn)化體，其可通過將本發(fā)明的重組表達載體轉(zhuǎn)化至宿主微生物中，獲得本發(fā)明所述的基因工程菌株。所述的宿主微生物可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種宿主微生物，只要能滿足重組表達載體可穩(wěn)定地自行復(fù)制，并且所攜帶的本發(fā)明的重組羥腈裂解酶基因可以有效表達即可。本發(fā)明優(yōu)選的宿主微生物是重組畢赤酵母，更優(yōu)選畢赤酵母X33。本發(fā)明的基因工程菌株可按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法制備而得，將含有本發(fā)明重組羥腈裂解酶的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到原核宿主微生物，比如大腸桿菌中進行擴增，提取擴增的重組表達質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶SacI單酶切消化后轉(zhuǎn)化到目標(biāo)畢赤酵母宿主細胞，即得到本發(fā)明優(yōu)選的基因工程菌株，即重組畢赤酵母菌P.pastorispPICZαA-PcHNL。本發(fā)明還涉及一種重組羥腈裂解酶的制備方法，其包括如下步驟：培養(yǎng)本發(fā)明的重組表達轉(zhuǎn)化體，獲得重組表達的羥腈裂解酶。其中，所述重組表達轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域任何可以使所述重組表達轉(zhuǎn)化體生長并產(chǎn)生本發(fā)明的羥腈裂解酶的培養(yǎng)基，對于重組畢赤酵母菌，優(yōu)選BMGY培養(yǎng)基：甘油10g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，生物素40mg/L，無氨基酸酵母氮源13.4g/L以及終濃度為100mM的磷酸鉀緩沖鹽，pH6.0。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒有特殊的限制，可以根據(jù)宿主類型和培養(yǎng)方法等因素的不同按本領(lǐng)域普通知識進行適當(dāng)?shù)倪x擇，只要使重組表達轉(zhuǎn)化體能夠生長并產(chǎn)生本發(fā)明的羥腈裂解酶即可。其他培養(yǎng)重組表達轉(zhuǎn)化體的具體操作均可按照本領(lǐng)域常規(guī)操作進行。對于重組畢赤酵母菌株，優(yōu)選下述方法：將表達本發(fā)明重組羥腈裂解酶的重組酵母菌(優(yōu)選本發(fā)明的畢赤酵母(Pichiapastoris)X33構(gòu)建的重組表達轉(zhuǎn)化體)接種至含氨芐青霉素的BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的光密度OD600達到1.3-2(優(yōu)選1.5)時，將培養(yǎng)基替換為BMMY(甲醇20ml/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，生物素40mg/L，無氨基酸酵母氮源13.4g/L以及終濃度為100mM的磷酸鉀緩沖鹽，pH6.0)，每隔24h添加相當(dāng)于培養(yǎng)液體積1％的純甲醇進行誘導(dǎo)，持續(xù)誘導(dǎo)96h，可高效誘導(dǎo)重組畢赤酵母菌分泌表達本發(fā)明的重組羥腈裂解酶。本發(fā)明還涉及一種利用分光光度計檢測280nm處吸光值的變化計算羥腈裂解酶的活力的方法，其重組羥腈裂解酶活力測定方法如下：在保溫于25℃的1ml反應(yīng)體系(100mM檸檬酸鈉緩沖液，pH5.0)，加入2mM外消旋扁桃腈，加入適量酶液，迅速搖勻，檢測280nm處吸光值的變化。羥腈裂解酶活力的計算公式為：酶活力(U)＝EW×V×103/(1376×l)，式中，EW為1min內(nèi)280nm吸光值的變化；V為反應(yīng)液的體積，單位mL；1376為摩爾消光系數(shù)，單位L/(mol·cm)；l為光程距離，單位cm。重組羥腈裂解酶活力定義為：上述酶活力測定條件下，每分鐘催化裂解1μmol外消旋扁桃腈所需要的酶量。本發(fā)明還涉及一種重組羥腈裂解酶催化劑及其制備方法。本發(fā)明所述的重組羥腈裂解酶以分泌表達的形式存在于發(fā)酵培養(yǎng)液中，可直接使用分離除去菌體細胞的發(fā)酵培養(yǎng)液作為酶促反應(yīng)的催化劑；或者將發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)脫鹽處理，然后對低鹽的培養(yǎng)液進行冷凍干燥，制得重組羥腈裂解酶凍干酶粉。較佳的，對發(fā)酵培養(yǎng)液高速離心，分離去除菌體細胞，離心上清液通過0.22μm孔徑的微濾膜過濾后，于4℃用截留分子量為30kDa的超濾膜超濾濃縮，并用檸檬酸鈉緩沖液(20mM,pH5.5)反復(fù)洗滌，獲得濃度大約為1mg/ml的羥腈裂解酶溶液，最后對酶液進行冷凍干燥，制得重組羥腈裂解酶凍干酶粉。本發(fā)明還涉及一種使用本發(fā)明的羥腈裂解酶作為催化劑催化芳香醛不對稱羥氰化以制備手性α-氰醇的應(yīng)用。較佳的，所述的應(yīng)用按下述方法進行：在pH4-5的緩沖溶液中，在有機溶劑的存在下，以含有重組巴達木羥腈裂解酶的培養(yǎng)清液或凍干酶粉作為催化劑，以潛手性芳香醛和氫氰酸作為底物，進行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。其中，優(yōu)選的緩沖溶液為檸檬酸鈉緩沖液，優(yōu)選的有機溶劑是甲基叔丁基醚。所述潛手性芳香醛為結(jié)構(gòu)如式1-5所示的潛手性芳香醛類化合物：式1中，R為-H；或者R為-Cl，其取代的位置在苯基的鄰位或間位；或者R為-OMe，其取代的位置在苯基的鄰位、間位或?qū)ξ?；或者R為-OPh，其取代的位置在苯基的間位；或者R為-SMe，其取代的位置在苯基的對位；或者R為-Me，其取代的位置在苯基的對位；或者R為-F，其取代的位置在苯基的對位；式2中，取代基在1-位，或者2-位；式4中，n為1或2；式5中，X為O或者S。較佳的，所述的潛手性芳香醛類化合物為結(jié)構(gòu)如式1-17所示的潛手性芳香醛類化合物：所述的潛手性芳香醛類化合物在反應(yīng)液中的濃度為100-500mM，較佳的是400mM。本發(fā)明的重組巴達木羥腈裂解酶的添加量為催化有效量，較佳的為100-630U/mmol醛，氫氰酸的濃度較佳的為1-2M，其中氫氰酸的獲得是通過氰化鈉或氰化鉀與強酸反應(yīng)后，用甲基叔丁基醚萃取的方法獲得含有氫氰酸的甲基叔丁基醚溶液。所述的檸檬酸鹽緩沖液可以是本領(lǐng)域常規(guī)檸檬酸鹽緩沖液，如檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。檸檬酸鹽緩沖液的濃度較佳的為50-100mM，所述的濃度是指緩沖溶液中共軛酸堿的總濃度。所述的不對稱羥氰化反應(yīng)在反應(yīng)液充分攪拌混合的條件下進行，比如在圓底燒瓶中以磁力攪拌的方式進行。所述的不對稱羥氰化反應(yīng)的溫度較佳的為15-25℃。所述的不對稱羥氰化反應(yīng)通過TLC薄層層析的方法監(jiān)控反應(yīng)進程，反應(yīng)時間以目標(biāo)產(chǎn)物量不再增加時為準(zhǔn)，一般為4-12h。不對稱羥氰化反應(yīng)結(jié)束后可按本領(lǐng)域常規(guī)方法從反應(yīng)液中提取反應(yīng)產(chǎn)物(R)-或(S)-型手性α-氰醇。優(yōu)選的，反應(yīng)液用等體積乙酸乙酯萃取三次，分離有機相，然后用飽和FeCl3水溶液洗滌至水溶液不變色，之后依次以水、飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，快速柱層析分離獲得高純度的目標(biāo)手性α-氰醇產(chǎn)物。在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即可獲得本發(fā)明各較佳實例。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極進步效果在于：本發(fā)明的重組羥腈裂解酶可作為催化劑應(yīng)用于不對稱羥氰化前手性芳香醛類化合物以制備多種光學(xué)活性手性α-氰醇，其催化效率高，立體選擇性強，反應(yīng)可以在室溫環(huán)境中進行，能耗低。與天然巴達木脫脂種仁粉相比，本發(fā)明的羥腈裂解酶催化效果更佳，底物適應(yīng)性更廣，具備很高的工業(yè)開發(fā)前景。附圖說明圖1為巴達木羥腈裂解酶基因的獲取策略圖；圖2為重組質(zhì)粒pPICZαA-PcHNL的構(gòu)建流程示意圖。具體實施方式下面通過實施例的方式進一步闡述本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。下列實施例中的材料來源為：質(zhì)粒pMD-19T，聚合酶PrimeStarHSpremix，dATP購自大連TaKaRa公司。表達質(zhì)粒pPICZαA購自美國Invitrogen公司。EscherichiacoliTop10和PichiapastorisX33感受態(tài)細胞購自美國Invitrogen公司，聚合酶EasyTaqMasterMix購自江蘇康維生物有限公司，瓊脂糖凝膠試劑盒及DNA純化回收試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司。實施例1巴達木羥腈裂解酶基因的克隆將新鮮巴達木種籽果核在80℃熱水中浸泡0.5h，取出以冰水冷卻，反復(fù)3次，取出后埋在沙土中，表層沙土的厚度約0.5cm，間歇澆水，保持沙土濕潤，待種籽發(fā)芽后以酚氯仿法提取幼嫩葉片的基因組DNA。由于巴達木羥腈裂解酶的基因序列未見文獻報道，根據(jù)已知薔薇科羥腈裂解酶的基因序列(Genbank，AccessionAF412329.1、AF040079.1、U51562.1、AY321296.1、GU126428.1、U78814.1)分析可能存在于整個薔薇科家族HNL中的保守堿基區(qū)段，據(jù)此設(shè)計簡并引物，以巴達木基因組為模板，采取文獻報道類似的方法(JBiosci.Bioeng.,2011,112,321-325)在其染色體上步移獲取基因碎片片段，通過比對后根據(jù)獲取的碎片信息設(shè)計N端上游引物Primer1-F，C末端根據(jù)Genbank上報道序列最為類似的苦杏仁羥腈裂解酶5號同工酶的基因(Genbank，AccessionAF412329)設(shè)計下游引物Primer1-R。巴達木羥腈裂解酶基因的獲取策略如圖1所述。具體的，本發(fā)明羥腈裂解酶基因的克隆包括以下步驟：步驟1，使用EasyTaqMasterMix進行PCR擴增，PCR體系為：2×EasyTaqMasterMix15μl，上游引物Primer1-F和下游引物Primer1-R各1.5μl，巴達木基因組模板1μl(100ng)，DMSO0.5μl，ddH2O補足至30μl。PCR反應(yīng)程序為：(1)95℃，預(yù)變性5min；(2)94℃，變性1min；(3)50℃退火1min；(4)72℃延伸0.5min；程序(2)-(4)重復(fù)共30次；(5)72℃繼續(xù)延伸10min，冷卻至4℃。PCR產(chǎn)物連接到質(zhì)粒pMD-19T上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliDH5α中，并進行藍白斑篩選獲得陽性克隆子，對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，依據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計第二步擴增引物PrimerS-F1和Primer2-R。步驟2，使用EasyTaqMasterMix進行PCR擴增，PCR體系為：2×EasyTaqMasterMix15μl，上游引物PrimerS-F1和下游引物Primer2-R各1.5μl，巴達木基因組模板1μl(100ng)，DMSO0.5μl，ddH2O補足至30μl。PCR反應(yīng)程序為：(1)95℃，預(yù)變性5min；(2)94℃，變性1min；(3)55℃退火1min；(4)72℃延伸1.8min；程序(2)-(4)重復(fù)共30次；(5)72℃繼續(xù)延伸10min，冷卻至4℃。PCR產(chǎn)物連接到質(zhì)粒pMD-19T上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α中，并進行藍白斑篩選獲得陽性克隆子，對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，依據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計第二步擴增引物PrimerHNL-F和PrimerHNL-R。步驟3，使用PrimeStarHSpremix進行PCR擴增，PCR體系為：2×PrimeStarHSpremix15μl，上游引物PrimerHNL-F和下游引物PrimerHNL-R各1.5μl，巴達木基因組模板1μl(100ng)，DMSO0.5μl，ddH2O補足至30μl。PCR反應(yīng)程序為：(1)98℃，預(yù)變性3min；(2)98℃，變性1min；(3)53℃退火1min；(4)72℃延伸2min；程序(2)-(4)重復(fù)共30次；(5)72℃繼續(xù)延伸10min，冷卻至4℃。PCR產(chǎn)物加入EasyTaqpolymerase1μl，dATP3μl，72℃保溫30min，直接連接至質(zhì)粒pMD-19T，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α中，并進行藍白斑篩選獲得陽性克隆子，對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，獲取巴達木羥腈裂解酶完整基因。其中，所涉及的引物的具體序列如表1所示：表1所涉及的引物的具體序列名稱序列Primer1-F5’-ATGGNGAAATCAACAATGTCAG-3’Primer1-R5’-TGCCAATGGACACCCT-3’PrimerS-F15’-GCAAATAGAACAGATGCATGTGCTAAA-3’Primer2-R5’-CTNCCTAACATCAGATA-3’PrimerHNL-F5’-CTTGCCAATACTTCTGCTCATGATTTTAG-3’PrimerHNL-R5’-TCACATGGACTCTTGAATATT-3’實施例2重組質(zhì)粒pPICZαA-PcHNL的制備重組質(zhì)粒pPICZαA-PcHNL的構(gòu)建流程如圖2所示。實施例1中克隆獲得的巴達木羥腈裂解酶完整基因中含有內(nèi)含子，通過與Genbank中已報道的薔薇科羥腈裂解酶特有的保守內(nèi)含子進行比對，識別出巴達木羥腈裂解酶中包含的3個內(nèi)含子。隨后，以實施例1制備獲得的質(zhì)粒pMD-19T-HNL為模板，采用引物連接重疊延伸PCR技術(shù)刪除原基因序列中包含的3個內(nèi)含子。具體操作步驟如下：步驟1，使用PrimeStarHSpremix進行PCR擴增，采用三組引物，分別擴增獲得羥腈裂解酶PcHNL的三段外顯子。PCR體系為：2×PrimeStarHSpremix15μl，上下游引物各1.5μl，pMD-19T-HNL模板1μl(100ng)，DMSO0.5μl，ddH2O補足至30μl。PCR程序為：(1)98℃，預(yù)變性3min；(2)98℃，變性1min；(3)54℃退火1min；(4)72℃延伸0.5–1.0min；程序(2)-(4)重復(fù)共30次；(5)72℃繼續(xù)延伸10min，冷卻至4℃。PCR擴增產(chǎn)物利用1％瓊脂糖凝膠電泳，回收相應(yīng)大小的電泳條帶，作為下一個步驟的模板。所用的各組引物名稱、序列以及電泳條帶大小見表2：表2所用的各組引物名稱、序列以及電泳條帶大小步驟2，使用PrimeStarHSpremix進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為：2×PrimeStarHSpremix15μl，上游引物PrimerF1-F和下游引物PrimerF2-R各1.5μl，步驟1獲取的條帶1和條帶2模板各50ng，DMSO0.5μl，ddH2O補足至30μl。PCR程序為：(1)98℃，預(yù)變性3min；(2)98℃，變性1min；(3)57℃退火1min；(4)72℃延伸1min；程序(2)-(4)重復(fù)共30次；(5)72℃繼續(xù)延伸10min，冷卻至4℃。PCR擴增產(chǎn)物利用1％瓊脂糖凝膠電泳，回收1000-1500bp處的條帶4；步驟3，使用PrimeStarHSpremix進行PCR擴增，PCR體系為：2×PrimeStarHSpremix15μl，上游引物PrimerEcoRIF和下游引物PrimerNotIR各1.5μl，步驟1、2獲取的條帶3和條帶4各50ng，DMSO0.5μl，ddH2O補足至30μl。PCR程序為：(1)98℃，預(yù)變性3min；(2)98℃，變性1min；(3)57℃退火1min；(4)72℃延伸1min；程序(2)-(4)重復(fù)共30次；(5)72℃繼續(xù)延伸10min，冷卻至4℃。PCR擴增產(chǎn)物利用1％瓊脂糖凝膠電泳，回收1500-2000bp處的條帶，獲得目標(biāo)羥腈裂解酶的成熟基因。其中，引物PrimerEcoRIF和PrimerNotIR的序列如表3所示：表3引物PrimerEcoRIF和PrimerNotIR的序列名稱序列PrimerEcoRIF5’-GGAATTCCATCACCATCACCATCACCTTGCCAATACTTCTGCTCATG-3’PrimerNotIR5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCACATGGACTCTTGAATATT-3’步驟4，將步驟3獲得的PCR產(chǎn)物在37℃經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切4h，經(jīng)PCR純化回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物與同樣經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切消化的質(zhì)粒pPICZαA，在16℃連接過夜得到重組質(zhì)粒pPICZαA-PcHNL。實施例3重組畢赤酵母P.pastoris/pPICZαA-PcHNL的制備將實施例2中獲得的重組質(zhì)粒pPICZαA-PcHNL在37℃經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacI雙酶切4h，電泳驗證重組質(zhì)粒完全線性化后，利用PCR純化回收試劑盒回收目標(biāo)DNA片段(濃度>100ng/μl)。將80μl畢赤酵母X33的感受態(tài)細胞和1μg線性化質(zhì)粒DNA樣品混勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯(電極間距0.2cm)中，冰浴5min；然后在2kV、5ms的條件下脈沖電擊一次；之后向電轉(zhuǎn)杯中迅速加入0.5ml冰上預(yù)冷的山梨醇溶液(1M)，并將電轉(zhuǎn)杯中的菌液轉(zhuǎn)移到裝有0.5mlYPD液體培養(yǎng)基(蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，葡萄糖：20g/L，pH6.0)的1.5mlEppendorf管中，于30℃、200rpm培養(yǎng)2-3h；用移液槍吸取200μl電轉(zhuǎn)復(fù)蘇后的菌液，涂布于YPDZ固體培養(yǎng)基平板(瓊脂粉：20g/L，蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，葡萄糖：20g/L，博萊霉素100-2000μg/mL，pH6.0)，倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天左右，至有肉眼可見的轉(zhuǎn)化子長出，獲得重組畢赤酵母P.pastorisX33/pPICZαA-PcHNL。挑取單個轉(zhuǎn)化子菌落，抽提基因組，使用AOX通用引物擴增整合至基因組上的目的羥腈裂解酶基因片段，經(jīng)DNA測序，基因全長1599bp，堿基序列如序列表中SEDIDNo.2所示。實施例4重組畢赤酵母菌的培養(yǎng)以及重組羥腈裂解酶催化劑的制備將實施例3中的重組畢赤酵母PichiapastorisX33/pPICZαA-PcHNL接種至YPDZ液體培養(yǎng)基(蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，葡萄糖：20g/L，博萊霉素100μg/mL，pH6.0)中，于30℃，250rpm震蕩培養(yǎng)24h，按1％的接種量接種至100ml含有100μg/mL氨芐青霉素的BMGY液體培養(yǎng)基(蛋白胨：20g/L，酵母提取物：10g/L，甘油：10g/L，無氨基酸酵母氮源：13.6g/L，生物素：0.4mg/L，終濃度為100mM的磷酸鉀緩沖鹽，pH6.0)中，置于30℃，250rpm搖床中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的光密度OD600達到1.5時，停止培養(yǎng)，靜置2-3h使酵母細胞沉降，小心傾倒出BMGY培養(yǎng)基上清，然后將收集的菌體用100ml的BMMY培養(yǎng)基(甲醇10ml/L，蛋白胨：20g/L，酵母提取物10g/L，生物素0.4mg/L，無氨基酸酵母氮源13.6g/L，終濃度為100mM的磷酸鉀緩沖鹽，pH6.0)重新懸浮，置于30℃，250rpm搖床中繼續(xù)培養(yǎng)，每24h添加2ml的純甲醇進行誘導(dǎo)，持續(xù)培養(yǎng)、誘導(dǎo)96h，培養(yǎng)過程中定期吸取培養(yǎng)液，離心后取上清，進行羥腈腈裂解活力測定，監(jiān)控重組羥腈裂解酶的表達。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液于4℃、8000×g離心后去除菌體，上清以0.22μm孔徑的微濾膜微濾，于4℃以截留分子量為30KDa的超濾膜超濾濃縮，并用檸檬酸鈉緩沖液(20mM,pH5.5)反復(fù)洗滌，最終濃縮至重組羥腈腈裂解的濃度大約為100U/ml。對濃縮的酶液冷凍干燥后制得含有重組羥腈裂解酶的凍干粗酶粉，比活力為12U/mg。實施例5氫氰酸-甲基叔丁基醚溶液的制備稱取9.8gNaCN，加入250ml的圓底燒瓶中，冰浴冷卻，加入20ml蒸餾水與25ml甲基叔丁基醚，翻口塞密封后于冰浴上磁力攪拌15min，然后在攪拌條件下以注射器緩慢滴加25ml濃度為4M的硫酸溶液，滴加結(jié)束后繼續(xù)攪拌4min，以分液漏斗快速分液，分離有機相，剩余的水相中加入25ml甲基叔丁基醚再萃取一次，合并有機相置于氮氣保護的棕色瓶內(nèi)，加入10ml檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(100mM，pH5.0)作為穩(wěn)定劑，保存于-80℃?zhèn)溆谩嵤├?重組羥腈裂解酶液催化4-甲硫基苯甲醛不對稱羥氰化反應(yīng)取2.5ml實施例4制備的濃縮后的羥腈裂解酶液，加入2.5ml如實施例5制備的氫氰酸-甲基叔丁基醚溶液，加入終濃度200mM的4-甲硫基苯甲醛，于15℃，磁力攪拌反應(yīng)，間歇取樣50μl，以1ml乙酸乙酯萃取，通過液相色譜分析測定反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和α-氰醇的ee值，反應(yīng)24h，轉(zhuǎn)化率97％，產(chǎn)物ee值高于99％。液相色譜分析，使用的色譜柱為OD-H柱(250mm×4.6mm,5μm，大賽璐公司，日本)，流動相為正己烷/異丙醇，流動相比例為正己烷/異丙醇：85/15，檢測柱溫25℃，流動相流速0.7ml/min，檢測波長為254nm。其中α-氰醇的ee值測定需要預(yù)先對α-氰醇進行乙?；幚?，乙?；磻?yīng)的條件為：乙酸乙酯的萃取樣品加入80μl乙酸酐，40μl吡啶，1mg對二甲氨基吡啶，室溫攪拌反應(yīng)2h，反應(yīng)產(chǎn)物以1ml飽和硫酸銅水溶液洗滌至水相不變色，1ml水洗兩次，1ml飽和食鹽水洗滌一次，加入無水硫酸鈉干燥，蒸發(fā)去除溶劑，以300μl異丙醇復(fù)溶后進行液相色譜分析。實施例7重組羥腈裂解酶催化4-甲硫基苯甲醛不對稱羥氰化反應(yīng)條件考察按表4條件配置反應(yīng)體系，稱取5-125mg如實施例4獲得的重組羥腈裂解酶凍干粗酶粉，溶解于2.37ml檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(100mM，pH4-6)中，加入2.5ml如實施例5制備的氫氰酸-甲基叔丁基醚溶液，加入終濃度100-500mM的4-甲硫基苯甲醛，于4-25℃，磁力攪拌反應(yīng)，間歇取樣，薄層層析檢測反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。當(dāng)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率停止增長時，反應(yīng)液用2倍反應(yīng)體積乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并有機相，用飽和FeCl3洗滌至水相溶液不變色，再分別以等體積水，飽和食鹽水洗滌一次，加入無水硫酸鈉干燥，真空減壓蒸發(fā)除去溶劑，200-300目硅膠填裝層析柱，快速柱層析分離獲得目標(biāo)產(chǎn)物。柱層析條件為石油醚/乙酸乙酯：15/1分離出未轉(zhuǎn)化的4-甲硫基苯甲醛，石油醚/乙酸乙酯：4/1分離得(R)-4-甲硫基扁桃腈。反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和α-氰醇的ee值通過液相色譜分析測定，使用的色譜柱為OD-H柱(250mm×4.6mm,5μm，大賽璐公司，日本)，流動相為正己烷/異丙醇，流動相比例為正己烷/異丙醇：85/15，檢測柱溫25℃，流動相流速0.7ml/min，檢測波長為254nm。其中α-氰醇的ee值測定需要預(yù)先對α-氰醇進行乙?；幚?，乙酰化反應(yīng)的條件為：1mmol氰醇溶解于2ml二氯甲烷，加入400μl乙酸酐，200μl吡啶，5mg對二甲氨基吡啶，室溫攪拌反應(yīng)2h，反應(yīng)產(chǎn)物以2倍體積飽和硫酸銅水溶液洗滌至水相不變色，等體積水洗兩次，飽和食鹽水洗滌一次，加入無水硫酸鈉干燥，真空減壓蒸發(fā)去除溶劑，取少量以異丙醇復(fù)溶后進行液相色譜分析，分析結(jié)果見表4。表4.不同條件重組羥腈裂解酶催化4-甲硫基苯甲醛不對稱羥氰化反應(yīng)結(jié)果實施例8-23重組羥腈裂解酶催化潛手性芳香醛的不對稱羥氰化反應(yīng)稱取50mg如實施例4獲得的重組羥腈裂解酶凍干粗酶粉，溶解于2.5ml檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(100mM，pH5.0)中，加入2.5ml如實施例5制備的氫氰酸-甲基叔丁基醚溶液，分別加入終濃度400mM的前手性芳香醛(實施例8-23)，于25℃，磁力攪拌反應(yīng)，間歇取樣TLC檢測反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。當(dāng)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率停止增長時，反應(yīng)液用2倍體積乙酸乙酯萃取，共萃取3次，合并有機相，用飽和FeCl3洗滌至水相溶液不變色，再分別以等體積水和飽和食鹽水洗滌一次，加入無水硫酸鈉干燥，真空減壓蒸發(fā)除去溶劑，200-300目硅膠填裝層析柱，快速柱層析分離，使用的流動相為石油醚/乙酸乙酯，首先分離除去未反應(yīng)醛，隨后適當(dāng)調(diào)整流動相比例，洗脫獲得目標(biāo)產(chǎn)物。柱層析的流動相比例列于表5中。反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和α-氰醇的ee值通過液相色譜分析測定，使用的色譜柱為OD-H柱(250mm×4.6mm,5μm，大賽璐公司，日本)，流動相為正己烷/異丙醇，流動相比例列于表5中。檢測柱溫25℃，流動相流速0.7ml/min，檢測波長為254nm。其中實施例9-12、14-16、19-20的反應(yīng)產(chǎn)物進行乙酰化處理后進行ee值分析。乙酰化反應(yīng)的條件為：1mmol氰醇溶解于2ml二氯甲烷，加入400μl乙酸酐，200μl吡啶，5mg對二甲氨基吡啶，室溫攪拌反應(yīng)2h，反應(yīng)產(chǎn)物以2倍體積飽和硫酸銅水溶液洗滌至水相不變色，等體積水洗兩次，飽和食鹽水洗滌一次，加入無水硫酸鈉干燥，真空減壓蒸發(fā)去除溶劑，取少量以異丙醇復(fù)溶后進行液相色譜分析，分析結(jié)果見表6。表5液相色譜分析以及產(chǎn)品柱層析分離的流動相比例表6.重組巴達木羥腈裂解酶催化潛手性芳香醛不對稱羥氰化反應(yīng)上述的對實施例的描述是為便于該
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于上述實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。<110>華東理工大學(xué)<120>重組羥腈裂解酶及其用于制備光學(xué)純手性氰醇的應(yīng)用<160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>2058<212>DNA<213>Prunuscommunis<400>1cttgccaatacttctgctcatggtaaatttccatcttcagtattcatttaacaaaaaagt60gtagatttataattaagaaaactgaaacaagtagtgcaagaaacaagctaatttagatgc120atgttgaaaaaaatctttcatctcttcacatatattttgcagattttagctacttgaagt180ttgtgtacaacgccactgatacaagcttggaaggatcatatgactacattgtaatcggtg240gaggaacatcagggtgtccattggcagcaactttatcagaaaaatacaaggtgcttcttc300tagaaagaggcactattgctacagaatacccgaacacgttgactgcagatgggtttgcat360ataatctgcagcaacaagatgatggaaagacgccagttgaaaggttcgtgtccgaagatg420gcattgataatgtgcgagccaggatcctcggtggcacgaccataatcaatgcaggcgtct480acgccagagctaacatttcattctatagtcaaacaggaattgaatgggacctggatttgg540tcaataagacatatgagtgggttgaagacgccattgtggtcaagccaaataatcaatctt600ggcaatctgttataggagagggattcttggaggcgggtattcttccagacaatggattta660gtttggatcacgaagcaggaactagactcaccggctcaacttttgacaataatggaacgc720gacatgcggctgatgaactgcttaataaaggagaccctaataacttgctagttgcagttc780aggcctcagtagagaagatcctcttctcttccaatacatcaagtatgttgcatcagtgat840atttaatggtagctcctagtttgtcatgctgcactcgaaaattattattttatcatttta900aaatactaacagaatagtgtgaagtctcatatttcccttccatatttcccaaatttccat960aaacaaaacttcccaattctccttcgtttagtttgacaataattataagctattctctaa1020tgcagatttgtcagctattggagtcatatatacggattctgatggaaactctcatcaggc1080atttgtacgcggtaacggagaagttattgttagtgcagggacaatcggaacgcctcagct1140tctactacttagtggcgttggaccagagtcttacctatcttctctcaacatcacagttgt1200tcagccgaatccttatgttgggcagtttgtgtatgacaatccttgtaatttcattaatat1260tttgcccccaaatccaattgaagcctctgttgtaactgttttaggcattagaagtgatta1320ttatcaagtttctctgtcaagcttgccattttccactccaccctttagtctttttcctac1380aacatcttaccccctcccaaattcgacttttgctcatattgttagccaagttccaggacc1440attgtctcatggttctgtcacgctaaattcatcctctgacgtgagaatcgctccaaatat1500taaattcaattactattcaaattccacagaccttgctaattgtgttagcggcatgaagaa1560gcttggtgacttattaaggacaaaggcattagaaccatataaagctcgagatgtgctggg1620aattgacggtttcaattatttgggagtacctttgccagagaaccaaacagatgatgcatc1680cttcgagacattttgtctagataatgtagcttcatactggcattaccacggtggaagcct1740tgttgggaaagtgcttgatgatagtttccgtgttatggggatcaaagcattacgcgttgt1800tgatgcctccactttcccttacgaaccaaacagccatcctcagggcttctatctgatgtt1860aggaaggtatgtgatgcacacttccaaccactagagattctcaatattttgttgttgttg1920taatgaactctgtgccgcattgctcttttttattaatccttaaaattttgtgttttgcgc1980aggtatgtgggccttcaaatcctgcaagaaaggtcaatccggttggaggctattcataat2040attcaagagtccatgtga2058<210>2<211>532<212>DNA<213>Prunuscommunis<400>2LeuAlaAsnThrSerAlaHisAspPheSerTyrLeuLysPheVal51015TyrAsnAlaThrAspThrSerLeuGluGlySerTyrAspTyrIle202530ValIleGlyGlyGlyThrSerGlyCysProLeuAlaAlaThrLeu354045SerGluLysTyrLysValLeuLeuLeuGluArgGlyThrIleAla505560ThrGluTyrProAsnThrLeuThrAlaAspGlyPheAlaTyrAsn657075LeuGlnGlnGlnAspAspGlyLysThrProValGluArgPheVal808590SerGluAspGlyIleAspAsnValArgAlaArgIleLeuGlyGly95100105ThrThrIleIleAsnAlaGlyValTyrAlaArgAlaAsnIleSer110115120PheTyrSerGlnThrGlyIleGluTrpAspLeuAspLeuValAsn125130135LysThrTyrGluTrpValGluAspAlaIleValValLysProAsn140145150AsnGlnSerTrpGlnSerValIleGlyGluGlyPheLeuGluAla155160165GlyIleLeuProAspAsnGlyPheSerLeuAspHisGluAlaGly170175180ThrArgLeuThrGlySerThrPheAspAsnAsnGlyThrArgHis185190195AlaAlaAspGluLeuLeuAsnLysGlyAspProAsnAsnLeuLeu200205210ValAlaValGlnAlaSerValGluLysIleLeuPheSerSerAsn215220225ThrSerAsnLeuSerAlaIleGlyValIleTyrThrAspSerAsp230235240GlyAsnSerHisGlnAlaPheValArgGlyAsnGlyGluValIle245250255ValSerAlaGlyThrIleGlyThrProGlnLeuLeuLeuLeuSer260265270GlyValGlyProGluSerTyrLeuSerSerLeuAsnIleThrVal275280285ValGlnProAsnProTyrValGlyGlnPheValTyrAspAsnPro290295300ArgAsnPheIleAsnIleLeuProProAsnProIleGluAlaSer305310315ValValThrValLeuGlyIleArgSerAspTyrTyrGlnValSer320325330LeuSerSerLeuProPheSerThrProProPheSerLeuPhePro335340345ThrThrSerTyrProLeuProAsnSerThrPheAlaHisIleVal350355360SerGlnValProGlyProLeuSerHisGlySerValThrLeuAsn365370375SerSerSerAspValArgIleAlaProAsnIleLysPheAsnTyr380385390TyrSerAsnSerThrAspLeuAlaAsnCysValSerGlyMETLys395400405LysLeuGlyAspLeuLeuArgThrLysAlaLeuGluProTyrLys410415420AlaArgAspValLeuGlyIleAspGlyPheAsnTyrLeuGlyVal425430435ProLeuProGluAsnGlnThrAspAspAlaSerPheGluThrPhe440445450CysLeuAspAsnValAlaSerTyrTrpHisTyrHisGlyGlySer455460465LeuValGlyLysValLeuAspAspSerPheArgValMETGlyIle470475480LysAlaLeuArgValValAspAlaSerThrPheProTyrGluPro485490495AsnSerHisProGlnGlyPheTyrLeuMETLeuGlyArgTyrVal500505510GlyLeuGlnIleLeuGlnGluArgSerIleArgLeuGluAlaIle515520525HisAsnIleGlnGluSerMET530當(dāng)前第1頁1 2 3