本發(fā)明涉及一種提高米曲霉曲酸產(chǎn)量的方法，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

曲酸是一種與葡萄糖結(jié)構(gòu)相似的有機(jī)酸，是由好氧微生物利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于酒類、醬油及豆瓣醬等釀造產(chǎn)品中。目前，國內(nèi)外主要利用米曲霉(Aspergillums oryzae)及不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉(Aspergillusflavus)發(fā)酵生產(chǎn)曲酸。由于具有抑菌能力、抗氧化性、抑制酪氨酸酶活性、與金屬離子螯合等性質(zhì)，曲酸常用作防腐劑、殺蟲劑、抗菌劑等，被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品及化妝品等各個(gè)行業(yè)。

曲酸的產(chǎn)量不僅與菌株的遺傳特性有關(guān)，還與其所處的環(huán)境有著密切的關(guān)系。微生物的生長代謝是非常復(fù)雜的生化過程，需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)作為底物或誘導(dǎo)物，同時(shí)也有一些物質(zhì)會對微生物的生長代謝產(chǎn)生抑制，即使是同一種物質(zhì)也有可能隨著濃度的變化而對曲酸發(fā)酵產(chǎn)生不同影響的現(xiàn)象。微生物只有在適宜的營養(yǎng)環(huán)境生長代謝才能將其性能發(fā)揮到最優(yōu)水平，而原始條件往往不能滿足工業(yè)生產(chǎn)需求。培養(yǎng)基組分及其配比不合理會直接降低曲酸的產(chǎn)率和提高生產(chǎn)成本。因此，在利用米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)曲酸這一領(lǐng)域，迫切需要改良其發(fā)酵培養(yǎng)基，以期提高曲酸的發(fā)酵效率，并且進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種發(fā)酵培養(yǎng)基，其成分包括葡萄糖180～240g/L、酵母提取物4～6g/L、豆餅粉2～6g/L、KH₂PO₄ 0.1～5.0g/L、Mg²⁺ 0.1～5.0mmol/L。

在本發(fā)明的一種具體實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖210g/L、酵母提取物5g/L、豆餅粉4g/L、KH₂PO₄ 2g/L、Mg²⁺ 2.0mmol/L。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種提高曲酸產(chǎn)量的方法，所述方法是控制培養(yǎng)基pH為5.0～8.0、培養(yǎng)溫度為27～34℃、接種量按體積比為6～12％。

在本發(fā)明的一種具體實(shí)施方式中，所述方法是控制發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為6.0，培養(yǎng)溫度為30℃，接種量為8％(v/v)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述米曲霉是米曲霉QS，已于2014年9月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC No：M 2014436，并公開于申請?zhí)枮?01410564556.3的發(fā)明專利申請中。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述接種是接種活化后的種子液。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述活化是取一環(huán)保藏的米曲霉孢子懸液接種于斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3～5d獲得成熟孢子，用無菌生理鹽水洗下成熟孢子，經(jīng)玻璃珠打散后過濾制成孢子懸浮液，以1.0～15％接種量轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速200r/min，在30℃下培養(yǎng)30h；

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述種子培養(yǎng)基含有：葡萄糖10～200g/L、玉米淀粉1.0～40g/L、酵母提取物1.0～20g/L、KH₂PO₄ 0.5～10g/L、Mg²⁺ 1.0～20mmol/L，pH為3.0～7.0。

本發(fā)明還提供所述方法在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品及化妝品領(lǐng)域制備含曲酸的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：利用本發(fā)明的培養(yǎng)基及發(fā)酵方法可以使曲酸產(chǎn)量達(dá)37.27g/L，與優(yōu)化前相比提高了142.41％。該方法能顯著提高曲酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為碳源種類對曲酸產(chǎn)量的影響；

圖2為葡萄糖濃度對曲酸產(chǎn)量的影響；

圖3顯示了氮源種類及濃度對曲酸產(chǎn)量的影響；

圖4為酵母提取物濃度對曲酸產(chǎn)量的影響；

圖5為豆餅粉濃度對曲酸產(chǎn)量的影響；

圖6為發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對曲酸產(chǎn)量的影響；

圖7為溫度對曲酸產(chǎn)量的影響；

圖8為接種量對曲酸產(chǎn)量的影響。

具體實(shí)施方式

生孢培養(yǎng)：從-70℃的甘油保藏管中取一環(huán)孢子懸液接種于斜面培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d。

種子培養(yǎng)：將培養(yǎng)5d的成熟孢子用無菌生理鹽水洗下，經(jīng)玻璃珠打散后過濾制成孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將孢子懸浮液轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速200r/min，在30℃下恒溫?fù)u床培養(yǎng)30h。

發(fā)酵培養(yǎng)：按10％(v/v)的接種量，將液體種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為250mL三角瓶中裝入30mL培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速200r/min，30℃下恒溫?fù)u床培養(yǎng)。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖100g/L、玉米淀粉20g/L、酵母提取物10g/L、KH₂PO₄ 5g/L、MgSO₄·7H₂O 2.5g/L，pH為6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖120g/L、酵母提取物3g/L、豆餅粉5g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH為6.0。

曲酸含量測定：將發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液10000r/min離心2～3min，采用三氯化鐵比色法(《三氯化鐵比色法測定曲酸含量方的改進(jìn)》，張理珉等,公開于2000年)測定離心后發(fā)酵上清液的曲酸產(chǎn)量。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。

實(shí)施例1不同碳源及碳源濃度對米曲霉產(chǎn)曲酸的影響

向含酵母提取物3g/L、豆餅粉5g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L的培養(yǎng)基中的依次加入120g/L葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖和可溶性淀粉。將米曲霉進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)液體種子接種到含上述培養(yǎng)基的三角瓶中，裝液量為30mL/250mL，轉(zhuǎn)速200r/min，30℃下恒溫?fù)u床培養(yǎng)米曲霉，結(jié)果如圖1所示，碳源種類對曲酸產(chǎn)量影響較大，當(dāng)碳源為葡萄糖時(shí)，曲酸產(chǎn)量比蔗糖、麥芽糖和可溶性淀粉時(shí)高，達(dá)15g/L以上(圖1)。

實(shí)施例2

改變發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度(90～240g/L)，其他組分不變，對米曲霉進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)，測定發(fā)酵后的曲酸含量，結(jié)果顯示，葡萄糖濃度為180～240g/L時(shí)曲酸產(chǎn)量較高，其中濃度為210g/L和240g/L時(shí)，曲酸產(chǎn)量分別達(dá)到23.48g/L和23.73g/L(圖2)。

實(shí)施例3

在含葡萄糖120g/L，酵母提取物3g/L、豆餅粉5g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母提取物依次用蛋白胨、牛肉膏、氯化銨、硫酸銨和硝酸鈉替換，對米曲霉進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)，測定發(fā)酵后的曲酸含量，研究不同氮源對發(fā)酵產(chǎn)酸的影響。結(jié)果如圖3所示，酵母提取物作為氮源時(shí)曲酸產(chǎn)量最高，達(dá)24g/L以上。

實(shí)施例4

改變發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母提取物的濃度(1～6g/L)，其他組分不改變，對米曲霉進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)，測定發(fā)酵后的曲酸含量，結(jié)果顯示(圖4)，酵母提取物濃度為4～6g/L時(shí)曲酸產(chǎn)量較高，其中濃度為5g/L時(shí)曲酸產(chǎn)量最高達(dá)到29.89g/L。

實(shí)施例5

在培養(yǎng)基中葡萄糖120g/L，酵母提取物3g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L的濃度下，改變發(fā)酵培養(yǎng)基中豆餅粉的濃度(0～10g/L)，對米曲霉進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)，測定發(fā)酵后的曲酸含量，結(jié)果顯示，豆餅粉濃度為2～6g/L時(shí)曲酸產(chǎn)量較高，其中濃度為4g/L時(shí)曲酸產(chǎn)量最高達(dá)到32.88g/L(圖5)。

實(shí)施例6

配制發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖210g/L、酵母提取物5g/L、豆餅粉2g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH為6.0。對米曲霉進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)，測定發(fā)酵7d后的曲酸含量，結(jié)果顯示，曲酸產(chǎn)量為36.22±0.67g/L。

實(shí)施例7

配制發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖210g/L、酵母提取物6g/L、豆餅粉4g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH為6.0。對米曲霉進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)，測定發(fā)酵7d后的曲酸含量，結(jié)果顯示，曲酸產(chǎn)量為31.89±1.8g/L。

實(shí)施例8

配制發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖240g/L、酵母提取物5g/L、豆餅粉6g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH為6.0。對米曲霉進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)，測定發(fā)酵7d后的曲酸含量，結(jié)果顯示，曲酸產(chǎn)量為34.65±0.48g/L。

實(shí)施例9

配制發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖240g/L、酵母提取物4g/L、豆餅粉4g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH為6.0。對米曲霉進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)，測定發(fā)酵7d后的曲酸含量，結(jié)果顯示，曲酸產(chǎn)量為30.29±1.29g/L。

實(shí)施例10

配制發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖240g/L、酵母提取物5g/L、豆餅粉4g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH為6.0。以葡萄糖120g/L、酵母提取物3g/L、豆餅粉1g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，pH為6.0的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照，在相同條件下接種米曲霉，進(jìn)行種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)。測定發(fā)酵結(jié)束(7d)的曲酸含量。結(jié)果顯示，曲酸產(chǎn)量為36.72g/L，與對照相比提高了46.88％。

實(shí)施例11

以實(shí)施例10的培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，研究不同培養(yǎng)基pH對米曲霉產(chǎn)酸的影響，結(jié)果顯示(圖6)，初始pH在5.0～8.0時(shí)，曲酸產(chǎn)量在33g/L以上。其中，米曲霉在培養(yǎng)基pH為6.0時(shí)曲酸產(chǎn)量達(dá)到36.59g/L。

實(shí)施例12

分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度為27℃、30℃、34℃和37℃，初始pH為6.0，其它實(shí)施方式同實(shí)施例11，對米曲霉進(jìn)行培養(yǎng)、發(fā)酵，測定發(fā)酵7d曲酸產(chǎn)量。結(jié)果顯示(圖7)，發(fā)酵溫度為27～30℃可使曲酸產(chǎn)量達(dá)到33g/L以上，在30℃時(shí)曲酸產(chǎn)量達(dá)35g/L以上。

實(shí)施例13

將種子液分別以2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％(v/v)的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基，控制發(fā)酵溫度為30℃，其它實(shí)施方式同實(shí)施例12，結(jié)果顯示(圖8)，在接種量為6％～12％范圍內(nèi)，曲酸產(chǎn)量達(dá)33g/L以上，接種量為8％時(shí)曲酸產(chǎn)量為37.27g/L。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。