本發(fā)明涉及一種通過增加甜菜堿合成能力提高棉花耐鹽抗旱性的方法，屬植物基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

土壤鹽漬化、干旱是農(nóng)業(yè)糧食生產(chǎn)中的主要威脅因素之一。由于植物固著生長在環(huán)境中而不能自主移動，為了應(yīng)對諸如溫度、鹽堿、干旱、重金屬等脅迫，植物存在著多種應(yīng)對機(jī)制來適應(yīng)多樣性的非生物脅迫。在眾多應(yīng)對干旱、高鹽脅迫的機(jī)制中，一個重要的策略就是細(xì)胞合成相容性化合物以幫助植物自身在干旱、高鹽脅迫下生存。合成的這些物質(zhì)由于它們易溶于水、甚至在較高濃度下對植物也不會造成不良的影響而被稱為相容的化合物(Rhodes D&Hanson AD.Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,1993,44:357-384)。甜菜堿是生物相容性物質(zhì)中較為優(yōu)秀的一種(Raza et al.Plant Biotechnol Rep,2013,7:49-57)。甘氨酸甜菜堿(甜菜堿)是一種兩性化合物，它在很寬的生理pH范圍內(nèi)保持電中性，極易溶于水，并具有三個甲基組成的非極性部分。甜菜堿在植物處于非生物逆境脅迫下在滲透調(diào)節(jié)作用、穩(wěn)定和保護(hù)生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能、保護(hù)膜的完整性、對光合系統(tǒng)的保護(hù)作用、誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)等諸多方面對植物保護(hù)發(fā)揮作用(Raza et al.Plant Biotechnol Rep,2013,7:49-57)。

許多植物能夠在細(xì)胞內(nèi)積累高水平甜菜堿來響應(yīng)非生物脅迫，甜菜堿的積累水平通常與植物的脅迫抗性程度一致(Rhodes et al.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol.1993,44:357–384.)。此外，外施甜菜堿也能夠提高多種植物對各種非生物脅迫的耐受性，還能使長勢增強(qiáng)和增加產(chǎn)量(Chen et al.Trends Plant Sci.2008,13(9):499-505；Ahmet et al.Sci Hortic,2012,(148):197-205；Shan et al.Postharvest Biol Tech,2016,114:104-110.)。

自然界中已發(fā)現(xiàn)的甜菜堿合成途徑按底物的不同可分兩大類：一類是以膽堿為底物合成甜菜堿，另一類以甘氨酸為底物連續(xù)甲基化合成甜菜堿(Mohammad,et al.Plant Biotechnology,2009,26,125-134)。以膽堿為底物的甜菜堿合成途徑根據(jù)參與合成途徑的酶系統(tǒng)不同又可分為3種類型：一是在黎科和莧科等高等植物中，甜菜堿由膽堿經(jīng)兩步氧化反應(yīng)合成，先由膽堿單加氧酶(CMO)催化膽堿轉(zhuǎn)化為甜菜堿醛，然后在甜菜堿醛脫氫酶(BADH)催化的作用下將甜菜堿醛轉(zhuǎn)化為甜菜堿(Weretilnyk et al,Planta,2009,178:342-352)；二是在微生物球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)和滋養(yǎng)節(jié)桿菌(A.pascens)中甜菜堿的合成僅需要一種酶即膽堿氧化酶(choline oxidase,COD)催化膽堿轉(zhuǎn)化甜菜堿，同時伴有H₂O₂產(chǎn)生(Ikuta et al.J.Biochem.(Tokyo),1977,82(6):1741-1749.)；三是在在大腸桿菌中，從膽堿到甜菜堿的轉(zhuǎn)變由膽堿脫氫酶(choline dehydrogenase，CDH)和甜菜堿醛脫氫酶(betaine aldehyde dehydrogenase，BADH)催化完成，即由膽堿脫氫酶催化膽堿轉(zhuǎn)化為甜菜堿醛，甜菜堿醛然后在甜菜堿醛脫氫酶催化的作用下生成甜菜堿。膽堿脫氫酶是一種依賴氧的膜結(jié)合黃素蛋白，不但能催化膽堿氧化為甜菜堿醛，而且能以幾乎相同的速率催化甜菜堿醛的氧化。甜菜堿醛脫氫酶是一種依賴于NAD的可溶性蛋白，對甜菜堿醛具有很高的親合性。betA基因編碼CDH，betB基因編碼BADH(Landfald et al,J.Bacteriol.,1986,165(3):849-855)。Quan等將來自于大腸桿菌的betA基因轉(zhuǎn)入了玉米植株，在轉(zhuǎn)基因植株中甜菜堿的積累量相對于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ赵黾恿?.1-2.3倍，并且轉(zhuǎn)基因玉米植株對低溫和干旱脅迫的抗性比對照增強(qiáng)(Quan et al.Plant Sci,2014,166:141-149；Quan et al.Plant Biotechnol J,2014,2:477-486.)。將betA基因轉(zhuǎn)入棉花，也提高了棉花的耐鹽抗旱性(Lv et al.Mol Breed,2007,20(3):233-248.Zhang et al.Euphytica,2011,181:1-16.)。

膽堿作為甜菜堿合成的必要前體物質(zhì)，在高等植物中可通過磷酸乙醇胺甲基轉(zhuǎn)移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)催化磷酸乙醇胺連續(xù)甲基化途徑而合成。磷酸乙醇胺甲基轉(zhuǎn)移酶其功能是催化磷酸乙醇胺三次甲基化生成磷酸膽堿，其后磷酸膽堿在磷酸膽堿磷酸酶的水解作用下可生成膽堿和磷脂酸。膽堿在一些植物葉綠體基質(zhì)中可通過膽堿單加氧酶(CMO)和甜菜堿脫氫酶(BADH)兩步氧化催化最終生成甘氨酸甜菜堿。磷酸乙醇胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶參與的步驟是在膽堿生物合成的關(guān)鍵步驟一個控制點，是催化磷酸乙醇胺三次甲基化生成膽堿的限速酶(Scott et al,PNAS,2001,98:10001-1005)。

將膽堿單加氧酶(CMO)基因轉(zhuǎn)入煙草(Nicotiana tabacum)、擬南芥、油菜(Brassica napus)等植株中以期提高其抗鹽性,但抗逆效果不明顯。但加入外源的膽堿后轉(zhuǎn)基因植株的甜菜堿含量明顯增加,植物的抗性也顯著的增強(qiáng)(Huang et al,Plant Physiol,2000,122(3):747-756)。推測這可能是因為甜菜堿合成的前體物質(zhì)膽堿的含量不足引起的，需要增加內(nèi)源性膽堿供應(yīng)以增強(qiáng)細(xì)胞中甜菜堿的積累(McNeil et al,Plant Physiol,2000,123(1):371-380；Takaba.J Plant Bioch Biot,2012,21(S1):58-62.)。而Mou等研究表明,擬南芥peamt突變體t365的膽堿生物合成量減少約64％,從而導(dǎo)致突變體植株對鹽漬高度敏感，PEAMT基因具有促進(jìn)甜菜堿的合成從而有助于提高植物抗鹽的能力(Plant Cell,2002,14(9):2031～2043)。在轉(zhuǎn)基因煙草中甜菜堿沒有大量積累的原因推測可能是外源基因的表達(dá)水平低，也可能是由于甜菜堿合成所需底物膽堿的供應(yīng)受限所致。但在轉(zhuǎn)基因煙草、擬南芥和油菜中發(fā)現(xiàn)，如果轉(zhuǎn)基因植株能夠獲取外源膽堿，轉(zhuǎn)基因植株中甜菜堿的積累量就會增加(Huang,et al..Plant Physiol.,2000,122(3):747-756；Nuccio,et al.Plant J.1998,16(4):487-496.)，因此這些轉(zhuǎn)基因植物沒有高濃度積累可能是由于甜菜堿合成所需底物膽堿的供應(yīng)受限所致。將控制膽堿合成的關(guān)鍵酶磷酸乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(PEAMT)導(dǎo)入表達(dá)CMO和BADH的轉(zhuǎn)基因煙草后，PEAMT基因的過表達(dá)使轉(zhuǎn)基因煙草的磷酸膽堿和膽堿分別的含量分別增加了5倍和50倍，使甜菜堿的合成增加了約30倍，有效地提高了植株耐鹽性,且不影響轉(zhuǎn)基因株的正常生長。這表明了PEAMT基因可顯著提高轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)膽堿的含量,解除內(nèi)源膽堿含量不足對甜菜堿合成的限制((McNeil SD,et al.PNAS,2001,98(17):10001-10005.)。

膽堿供應(yīng)不足是甜菜堿積累植物中甜菜堿合成的限制因素，一些工程植物的低水平甜菜堿的積累很大程度上也是由于膽堿合成能力不足所致(Takabe.J Plant Bioch Biot,2012,21(S1):58-62.)。已有的工作還表明，甜菜堿前體供應(yīng)對于甜菜堿的積累是重要的，甚至在甜菜堿積累的莧屬植物中也是如此(Bhuiyan et al.J exp bot,2007,58(15-16):4203-4212.)。這些信息提示我們在棉花中有可能通過引入提高膽堿的合成途徑來進(jìn)一步提高棉花細(xì)胞進(jìn)一步合成甘氨酸甜菜堿能力。因此，開展以乙醇胺為原料合成的膽堿合成途徑與以膽堿為底物合成甜菜堿的途徑相結(jié)合的基因工程，可望解決棉花細(xì)胞中因膽堿含量不足而影響甜菜堿合成的難題，并有望在轉(zhuǎn)基因植株中積累更高濃度的甘氨酸甜菜堿，從而賦予轉(zhuǎn)基因植株更高耐鹽抗旱能力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種通過增加甜菜堿合成能力提高棉花耐鹽抗旱性的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：通過轉(zhuǎn)基因聚合甜菜堿合成途徑的相關(guān)基因，在棉花細(xì)胞中引入以乙醇胺為原料合成的膽堿合成途徑和以膽堿為底物合成甜菜堿的途徑并使之相結(jié)合，以解決細(xì)胞中因膽堿含量不足而影響甜菜堿合成的難題，并有望在轉(zhuǎn)基因植株中積累高濃度的甘氨酸甜菜堿，進(jìn)而進(jìn)一步提高棉花的抗逆性，即耐鹽抗旱性。

詳細(xì)的，本發(fā)明所述通過增加甜菜堿合成能力提高棉花耐鹽抗旱性的方法是將來自大腸桿菌的膽堿脫氫酶基因betA和來自植物的磷酸乙醇胺甲基轉(zhuǎn)移酶基因GhPEAMT利用植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP和植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-betA-als重組構(gòu)建重組植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP，并將其轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞中讓其高效表達(dá)，進(jìn)而再生出轉(zhuǎn)基因植株；利用苗期噴灑除草劑草甘膦獲得抗性小苗，結(jié)合常規(guī)分子檢測技術(shù)，從抗性植株及其后代中篩選出轉(zhuǎn)基因純合體；再在鹽堿池或干旱棚中篩選鑒定出耐鹽抗旱性顯著提高的轉(zhuǎn)基因純合體，即獲得通過增加甜菜堿合成能力創(chuàng)建出的棉花耐鹽抗旱育種新種質(zhì)；

其特征在于：

所述構(gòu)建重組植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP的方法是：

(1)BamHI和KpnI雙酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-EPSP，回收載體；BamHI和KpnI雙酶切克隆載體pUC57-GhPEAMT回收GhPEAMT片段；將回收的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-EPSP的載體部分與回收的克隆載體pUC57-GhPEAMT中的目的基因GhPEAMT連接，獲得中間植物表達(dá)載體，命名為pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP；

其中所述植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-EPSP為全人工合成EPSP基因(兩端分別加BamHⅠ、KpnI酶切位點)鏈接到pCAMBIA1300的多克隆位點上獲得的重組質(zhì)粒。EPSP基因的注冊號為AY573186.1。

其中所述克隆載體pUC57-GhPEAMT為全人工合成GhPEAMT基因(兩端分別加BamHⅠ、KpnI酶切位點)鏈接到pUC57的多克隆位點上獲得的重組質(zhì)粒。GhPEAMT基因的注冊號為EF688569。

(2)EcoRI酶切回收植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP的載體部分，通過引物用高保真DNA聚合酶從植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-betA-als中擴(kuò)增得到兩端引入EcoRI酶切位點的片段35S-betA-nos并用EcoRI酶切后回收；將回收的中間植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP的載體部分與回收的35S-betA-nos片段連接，得到重組植物表達(dá)載體，命名為pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP；其中所述引物的核苷酸序列為：

NOS-B 5'CGAATTCCCGATCTAGTAACATAG 3'；

35S-B 5'GGAATTCGTCCCCAGATTAGCCTTTTC 3'；

其中所述植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-betA-als的構(gòu)建過程見文獻(xiàn)：王先艷，植物雙抗表達(dá)載體的構(gòu)建及其功能鑒定，[學(xué)位論文]，2003，山東大學(xué)。betA基因的GenBank注冊號為AY436553；als基因的GenBank注冊號為X51514.1。

所述棉花細(xì)胞是莖尖分生組織細(xì)胞、離體培養(yǎng)的幼胚細(xì)胞、成熟胚細(xì)胞、胚性愈傷組織細(xì)胞或原生質(zhì)體；

所述利用苗期噴灑除草劑草甘膦獲得抗性小苗，結(jié)合常規(guī)分子檢測技術(shù)，從抗性植株及其后代中篩選出轉(zhuǎn)基因純合體的方法是：通過對3～4葉期轉(zhuǎn)基因棉花小苗噴灑1.6～1.8‰草甘膦檢測轉(zhuǎn)基因植株的抗性，用除草劑篩選獲得抗性植株，然后對抗性植株利用PCR、southern雜交技術(shù)檢測獲得轉(zhuǎn)基因純合植株。

上述通過增加甜菜堿合成能力提高棉花耐鹽抗旱性的方法中：所述棉花的品種是春棉、夏棉、常規(guī)棉或雜交棉。

本發(fā)明所述通過增加甜菜堿合成能力提高棉花耐鹽抗旱性的方法的具體應(yīng)用方式：

1)將2個目的基因和1個選擇標(biāo)記基因通過常規(guī)分子生物學(xué)方法通過多步驟重組插入到植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體中，并導(dǎo)入到大腸桿菌或/和農(nóng)桿菌中。

2)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，以棉花的莖尖分生組織細(xì)胞為受體將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過分子檢測和植株抗逆性測定選出目的基因穩(wěn)定表達(dá)且植株抗性明顯提高的轉(zhuǎn)基因植株。

3)轉(zhuǎn)基因聚合材料的抗逆性鑒定和利用。根據(jù)目的基因表達(dá)產(chǎn)物的生理作用，進(jìn)行相應(yīng)的生理生化指標(biāo)檢測，并通過盆栽試驗和大田抗逆性測定試驗，篩選出耐鹽抗旱性明顯提高的轉(zhuǎn)基因育種材料。獲得的優(yōu)異材料用于棉花育種或生產(chǎn)實踐。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明公開的通過增加甜菜堿合成能力提高棉花耐鹽抗旱性的方法，建立了以磷酸乙醇胺為原料合成膽堿，進(jìn)一步以膽堿為原料合成甘氨酸甜菜堿的技術(shù)路線，克服了棉花細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源膽堿含量不足對甜菜堿合成的限制，在轉(zhuǎn)基因植株中能積累更高濃度的甘氨酸甜菜堿，進(jìn)而賦予轉(zhuǎn)基因植株更高的耐鹽抗旱能力。

本發(fā)明成功構(gòu)建了來自大腸桿菌的膽堿脫氫酶基因(betA基因)和來自陸地棉的磷酸乙醇胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(GhPEAMT基因)的雙子葉植物三價表達(dá)載體pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP，其中GhPEAMT和betA基因受35S啟動子控制。實驗證實將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到棉花中，可以顯著提高轉(zhuǎn)基因棉花的耐鹽抗旱特性。

附圖說明

圖1：植物表達(dá)載體構(gòu)建流程圖。

圖2、質(zhì)粒pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3、為重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP的酶切鑒定電泳圖

其中：泳道1-1到4-1號為EcoRI酶切得到2813bp和11751bp大小條帶，2-1號正確；泳道1-2到4-2號為PstI酶切得到2469bp，4386bp，7709bp大小條帶，2-2號正確。

圖4、轉(zhuǎn)基因植株中部分植株betA基因的PCR鑒定結(jié)果

其中：泳道M：DNA Marker DL2000；P：質(zhì)粒DNA；WT：野生型對照株系；泳道L1、L2、L3：轉(zhuǎn)betA基因株系；泳道H₂O：dH₂O。

圖5、轉(zhuǎn)基因植株中部分植株GhPEAMT基因的PCR鑒定結(jié)果

其中：泳道M：DNA Marker DL2000；P：質(zhì)粒DNA；WT：野生型對照株系；泳道L1、L2、L3：轉(zhuǎn)GhPEAMT基因株系；泳道H₂O：dH₂O。

圖6、轉(zhuǎn)GhPEAMT-betA基因植株中在200mMNaCl澆灌下的出苗的表型(播種7d)

其中：WT：野生型對照株系；L1、L2、L3為轉(zhuǎn)GhPEAMT基因株系。

圖7、轉(zhuǎn)GhPEAMT-betA基因二葉期小苗干旱脅迫四周的植株生物量(g/DW·3plant)。

具體實施方式

以下敘述本發(fā)明的實施例。需說明的是，本發(fā)明的實施例只對本發(fā)明起說明作用而沒有限制作用。

實施例1：創(chuàng)制耐鹽抗旱的優(yōu)異棉花育種材料

1、植物表達(dá)載體的構(gòu)建

目標(biāo)基因和轉(zhuǎn)基因植物選擇標(biāo)記基因采用常規(guī)分子生物學(xué)方法通過多步驟重組插入到植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體中，其中所述植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP的構(gòu)建過程流程圖參見圖1。

本實施例中目的基因betA基因為來自大腸桿菌的膽堿脫氫酶基因。GhPEAMT基因為來自棉花的磷酸乙醇胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因。選擇標(biāo)記基因為除草劑抗性基因EPSP(EPSP：烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶)

具體的，上述植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP重組步驟是：

BamHI和KpnI雙酶切載體pCAMBIA1300-EPSP，回收載體(其中：植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-EPSP中的pCAMBIA1300載體為CAMBIA公司產(chǎn)品，GenBank注冊號AF134296；EPSP基因注冊號為AY573186.1)；

BamHI和KpnI雙酶切克隆載體pUC57-GhPEAMT回收GhPEAMT片段(其中：pUC57克隆載體Thermo Scientific公司有售，產(chǎn)品貨號為SD0171，說明書中有詳細(xì)堿基序列；GhPEAMT基因注冊號為EF688569)；

將植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-EPSP的載體部分與克隆載體pUC57-GhPEAMT中的目的基因GhPEAMT連接，獲得中間植物表達(dá)載體，體命名為pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP。

EcoRI酶切回收中間植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP的載體部分，通過引物用高保真DNA聚合酶從植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-betA-als中擴(kuò)增得到兩端引入EcoRI酶切位點的片段35S-betA-nos(betA基因的GenBank注冊號AY436553；als基因的GenBank注冊號X51514.1)并用EcoRI酶切后回收；將回收的中間植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP的載體部分與回收的35S-betA-nos片段連接，得到重組植物表達(dá)載體，命名為pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP(結(jié)構(gòu)見圖2)；其中所述引物的核苷酸序列為：

NOS-B 5'CGAATTCCCGATCTAGTAACATAG 3'；

35S-B 5'GGAATTCGTCCCCAGATTAGCCTTTTC 3'

上述重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP可用于遺傳轉(zhuǎn)化。

其中植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-betA-als的構(gòu)建過程見文獻(xiàn)：王先艷，植物雙抗表達(dá)載體的構(gòu)建及其功能鑒定，[學(xué)位論文]，2003，山東大學(xué)。

其中植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-EPSP為全人工合成EPSP基因(兩端分別加BamHⅠ、KpnI酶切位點)鏈接到pCAMBIA1300的多克隆位點上獲得。

其中克隆載體pUC57-GhPEAMT為全人工合成GhPEAMT基因(兩端分別加BamHⅠ、KpnI酶切位點)鏈接到pUC57的多克隆位點上獲得。

重組子的鑒定：

依據(jù)質(zhì)粒T-DNA區(qū)的酶切位點特點選擇限制性內(nèi)切酶EcoRI、Pst I分別進(jìn)行單酶切鑒定。

提取陽性克隆質(zhì)粒，對質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI單酶切。酶切體系為100μl，具體是質(zhì)粒(載體、目的片段)25μl；10×M buffer 10μl；EcoRI 1μl；H₂O 64μl；37℃水浴，酶切過夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳后，2-1泳道檢測到已切開的合適大小的目的條帶(2813bp和11751bp兩條帶)，證明2號載體構(gòu)建正確(圖3)

提取陽性克隆質(zhì)粒，對質(zhì)粒進(jìn)行Pst I單酶切。酶切體系為100μl，具體是質(zhì)粒(載體、目的片段)25μl；10×M buffer 10μl；Pst I1μl；H₂O 64μl；37℃水浴，酶切過夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳后，2-2泳道檢測到已切開的合適大小的目的條帶(2469bp、4386bp、7709bp)，證明2號載體構(gòu)建正確(圖3)。

因此2號為重組正確的質(zhì)粒，即pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP。經(jīng)華大和鉑尚兩家生物技術(shù)公司測序，測序結(jié)果表明序列正確，將正確菌液放于-76℃低溫冰箱及-40℃低溫冰箱保存。

2、棉花轉(zhuǎn)基因植株的獲得

棉花種子經(jīng)硫酸脫絨后，用70％乙醇浸泡1min、0.1％的升汞浸泡15min，然后用無菌水洗滌5遍。消毒后種子放入鋪有三層濾紙的無菌瓶中，加入適量無菌水，于30℃溫箱中萌發(fā)。2～3天后下胚軸長到1～2cm，將萌發(fā)種子插到M1固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，取株高7～10cm小苗用于莖尖頂端生長錐用于轉(zhuǎn)化。

將帶有表達(dá)載體(質(zhì)粒pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP帶有除草劑抗性基因EPSP和目的基因(GhPEAMT、betA)的根瘤農(nóng)桿菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培養(yǎng)基中28℃下分別震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為110r/min，使細(xì)菌處于對數(shù)生長期。然后在3000r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2改良MS液體培養(yǎng)基洗滌，離心收集。再將菌體用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2MS改良液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5～20倍用于轉(zhuǎn)化。在浸染前向此細(xì)菌懸液加入100mg/L的乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)。在轉(zhuǎn)化試驗中，加入1％的表面活性劑Silwet L-77(Lehle Seeds,USA)或Tween80。

當(dāng)種皮脫落或快脫落時，去掉種皮和一片子葉，裸露出小苗莖尖。若苗端已有小葉出現(xiàn)，則用鑷子剝?nèi)?。輕輕劃傷頂端分生組織后，將蘸有農(nóng)桿菌菌液的棉球(由滅菌脫脂棉制備)放到小苗頂端，持續(xù)24h后取下棉團(tuán)，用無菌濾紙吸去感染部位的殘留菌液。小苗浸染時置于真空干燥器中，輔以0.5×10⁵Pa的負(fù)壓處理。

浸染過的幼苗于21℃左右暗培養(yǎng)3天，然后在光下培養(yǎng)2～3天后移栽入花盆。花盆下部為壤土，上部為6～8cm厚的蛭石，隔天澆灌1/2MS無機(jī)鹽溶液。

待轉(zhuǎn)化植株長出3片真葉后，噴灑1.6～1.8‰除草劑草甘膦(轉(zhuǎn)基因選擇標(biāo)記基因為EPSP)水溶液，以未轉(zhuǎn)化植株為對照。噴灑量以植株掉液滴為宜。未轉(zhuǎn)化植株在噴灑后3天停止生長，7～10天左右開始死亡。轉(zhuǎn)化處理后的植株，一些個體的變化與對照植株相似，另一些個體則持續(xù)生長，無明顯變化。植株長到4～5葉期，將其定植到田間。

抗除草劑轉(zhuǎn)化植株生長到7～8葉時，取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測外源基因，對PCR陽性植株進(jìn)行Southern檢測。結(jié)果：約25％的抗除草劑植株為轉(zhuǎn)基因個體。

3、棉花轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定

利用CTAB法提取棉花葉片DNA。

betA基因的PCR鑒定相關(guān)參數(shù):

所用的引物：

引物1：5’-CGCTACAGGGTAAACGCTACAAC-3’

引物2:5’-CCTCACGGCTGCGAATAAATCC-3’

目標(biāo)片段約為900bp

PCR擴(kuò)增程序：Step1預(yù)變性：94℃，5min；Step2變性：94℃，1min；Step3退火：57.6℃，40s；Step4延伸：72℃，1min；Step2-4循環(huán)34次；Step5過度延伸：72℃，7min；Step6 4℃保存。

反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳。

轉(zhuǎn)GhPEAMT-betA基因棉花的betA基因PCR鑒定結(jié)果見圖4。其中M為DNA ladder；CK為水；P為pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP質(zhì)粒(陽性對照)；WT為魯棉研19號；L1、L2、L3為鑒定陽性的植株。

GhPEAMT基因的PCR鑒定相關(guān)參數(shù):

所用的引物：

CaMV-Gh-F2 5’-GGAAGGTGGCTCCTACAAAT-3’

CaMV-Gh-R2 5’-CCAAAGACACGCTCATAACG-3’

目標(biāo)片段約：1058bp

PCR擴(kuò)增程序：

Step1預(yù)變性：94℃，5min；Step2變性：94℃，1min；Step3退火：52.5℃，40s；Step4延伸：72℃，1min 04sec；Step2-4循環(huán)34次；Step5過度延伸：72℃，7min；Step6保存:4℃。

反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳。

轉(zhuǎn)GhPEAMT-betA基因棉花的GhPEAMT基因PCR鑒定結(jié)果見圖5。其中M為DNAladder；CK為水；P為pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP質(zhì)粒(陽性對照)；WT為魯棉研19號；L1、L2、L3為鑒定陽性的植株。

PCR結(jié)果表明L1、L2、L3為轉(zhuǎn)GhPEAMT-betA轉(zhuǎn)基因棉花株系。

4、轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性檢測

除草劑篩選后存活的植株生長到4～5葉期時移栽到田間，按照常規(guī)管理方法進(jìn)行管理。單株收獲種子供遺傳穩(wěn)定性分析和耐鹽性鑒定。

具體的，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性測定

轉(zhuǎn)基因植株開花后自交或姊妹交結(jié)實。種子播種在大田或溫室，植株長到4～6葉期時取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測是否帶有外源基因。取轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行抗逆性測定。

棉花對鹽害的敏感期為苗期，在花蕾期耐鹽性較強(qiáng)，因此利用沙培方法測定轉(zhuǎn)基因棉花的耐鹽性。將棉花種子播種于洗凈的黃沙中與室溫下萌發(fā)。播種后澆灌含有0、200mMNaCl的Hogland營養(yǎng)液。每株系每盆萌發(fā)30粒種子，5次重復(fù)。播種7日后統(tǒng)計計算出苗率。

7d后各株系的出苗率表型見圖6。從種子出苗率可以發(fā)現(xiàn)，野生型對照的出苗率為33.76±5.25％；轉(zhuǎn)betA-GhPEAMT的株系L1、L2、L3的種子出苗率分別為80.26±6.35％、77.52±5.68％、65.56±4.28％，轉(zhuǎn)betA-GhPEAMT基因棉花的種子萌發(fā)率顯著高于野生型對照，轉(zhuǎn)betA-GhPEAMT基因的棉花耐鹽性苗期得以提高。

5、轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性檢測

除草劑篩選后存活的植株生長到4～5葉期時移栽到田間，按照常規(guī)管理方法進(jìn)行管理。單株收獲種子供耐旱性鑒定。

將轉(zhuǎn)基因株系L1、L2、L3和野生型對照魯棉研19(WT)種子播種于盛有土壤的花盆中，每盆播種3-5粒種子，隔天澆灌Hogland營養(yǎng)液。待小苗生長至2葉期，每株系挑選出9株長勢一致、生長良好的PCR陽性植株為試驗材料，每盆一株，為一個重復(fù)。每天控制澆水量，使土壤含水量保持在12％左右，進(jìn)行持續(xù)干旱脅迫4周后收獲期測定植株生物量(圖7)。

結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因株系植株生物量顯著高于野生型對照，株系L1、L2、L3的干物質(zhì)積累量比野生型對照分別高47.41％、35.42％和18.63％，提示在棉花中過表達(dá)betA-GhPEAMT基因能顯著提高棉花的耐旱性。