本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，其涉及水稻氮素吸收利用位點qNUE6及其分子標(biāo)記方法。

背景技術(shù)：

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米為主要糧食。氮是水稻生產(chǎn)中最重要的營養(yǎng)元素之一（Yoshida,1981）。自20世紀(jì)60年代以來，水稻品種的選育一直朝著高氮投入獲得最大的籽粒產(chǎn)量方向發(fā)展（Tong，2006）。然而，過量的施用氮肥導(dǎo)致氮素利用率下降和環(huán)境污染。因此，當(dāng)前水稻氮高效品種的需求變得非常迫切，選育高效吸收利用氮素水稻品種，提高水稻的氮素利用效率是全世界水稻育種中的一個重要目標(biāo)。雖然水稻氮素高效吸收利用種質(zhì)資源評價及氮素高效吸收利用基因研究取得了一些進展，定位了一批氮吸收利用相關(guān)QTL。但由于研究所用的材料原始或遺傳基礎(chǔ)狹窄、傳統(tǒng)作圖群體個體間遺傳背景的干擾以及指標(biāo)不確定等原因，使QTL定位及利用存在一些不足，因而到目前為止還沒有可直接應(yīng)用于育種的氮素吸收利用基因，也還沒有真正用分子標(biāo)記輔助選擇的手段獲得氮效率改良成功的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對以上技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種水稻氮素吸收利用位點qNUE6及其分子標(biāo)記方法，可用分子標(biāo)記NUE2來檢測氮素高效吸收利用品種GH998及其衍生品種（系）中是否含有氮素吸收利用基因位點，可預(yù)測其氮素吸收利用水平，大大提高氮素高效吸收利用水稻的選擇效率。

對此，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

水稻氮素吸收利用位點qNUE6，其位于分子標(biāo)記NUE2和NUE23之間的一個位點，所述分子標(biāo)記NUE2引物：SEQ ID NO.1/ SEQ ID NO.2，存在qNUE6時的擴增條帶為135bp條帶。

分子標(biāo)記NUE2的引物序列為：

上游引物：GTTCCACATGTTGATGGG(如SEQ ID NO.1)

下游引物：GATGAGGACGAGGAGGAG(如SEQ ID NO.2)

本發(fā)明公開了如上所述的水稻氮素吸收利用位點qNUE6的分子標(biāo)記方法，用分子標(biāo)記NUE2引物水稻材料的DNA，如果能夠擴增出135bp擴增片段，則標(biāo)志著氮素吸收利用基因位點qNUE6的存在。其中，所述水稻材料優(yōu)選為氮素吸收利用品種或育種材料。

篩選所述的水稻氮素吸收利用位點qNUE6的分子標(biāo)記的方法，包括以下步驟：

步驟S1：以普通野生稻材料Y11為供體，氮素高效吸收利用品種GH998為受體，通過雜交、回交和自交構(gòu)建一套包含212個株系的水稻染色體片段導(dǎo)入系BC₄F₇；

步驟S2：采用在田間低氮、高氮條件下進行氮素吸收利用率鑒定；其中，所述低氮為田間氮含量為0 kg/hm²，所述高氮為田間氮含量為150 kg/hm²。

步驟3：在導(dǎo)入系中取氮素高效吸收和氮素低效吸收水稻各30株，利用CTAB法提取水稻植株的DNA，構(gòu)建DNA氮素高效利用池、低效利用池，利用基于全基因組測序技術(shù)QTL-seq對水稻氮素吸收利用基因進行主效基因定位；其中，采用CTAB法，可以很好去除多糖，更有利于提取和純化水稻植株的DNA。

步驟4：在水稻第6染色體上，均勻選取40對分子標(biāo)記（Mccouch, 2002）；通過對Y11和GH998進行比對，找出兩者之間≥6 bp的插入或者缺失，進而設(shè)計InDel標(biāo)記；選取在兩親本、兩個池間多態(tài)性好標(biāo)記，用于分析212份BC₄F₇群體；對多態(tài)性標(biāo)記基因型和相應(yīng)家系的氮素吸收利用級別進行連鎖分析，并將Kosambi函數(shù)轉(zhuǎn)換為遺傳距離；利用Windows QTL Cart V2.5軟件復(fù)合區(qū)間作圖法，以2cM為步長在基因組內(nèi)進行掃描，QTL的檢測采用5%總體顯著水平，相應(yīng)LOD統(tǒng)計量的顯著閥值用排列測驗方法進行估計，共重復(fù)分析1000次。

步驟5：獲得氮素吸收利用品種GH998氮素吸收利用位點qNUE6一個，位于標(biāo)記NUE2附近，通過氮素吸收利用主基因的分子標(biāo)記來檢測氮素吸收利用品種GH998及其衍生品種（系）中是否含有該主基因位點，預(yù)測其氮素吸收利用水平。

進一步的，步驟3中，所述主效基因定位于第6染色體上。

進一步的，步驟4中，在水稻第6染色體上，均勻選取40對分子標(biāo)記（Mccouch, 2002）；通過BWA軟件對Y11和998進行比對，找出兩者之間的插入或者缺失（≥6 bp），進而使用Primer5 設(shè)計InDel標(biāo)記。選取在兩親本、兩個池間多態(tài)性好標(biāo)記，用于分析212份BC₄F₇群體。利用MAPMARKER/EXP3.0軟件對多態(tài)性標(biāo)記基因型和相應(yīng)家系的氮素吸收利用級別進行連鎖分析，并將Kosambi函數(shù)轉(zhuǎn)換為遺傳距離；利用Windows QTL Cart V2.5軟件復(fù)合區(qū)間作圖法，以2cM為步長在基因組內(nèi)進行掃描，QTL的檢測采用5%總體顯著水平，相應(yīng)LOD統(tǒng)計量的顯著閥值用排列測驗方法進行估計，共重復(fù)分析1000次。

本發(fā)明所述的水稻氮素吸收利用位點qNUE6在水稻育種中的應(yīng)用。

進一步的，所述水稻氮素吸收利用位點qNUE6在篩選氮素高效吸收利用品種或者品系中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的氮素吸收利用位點qNUE6的分子標(biāo)記引物在水稻分子育種中的應(yīng)用。

進一步的，所述的氮素吸收利用位點qNUE6的分子標(biāo)記引物在快速篩選氮素高效吸收利用品種或品系中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

采用本發(fā)明的技術(shù)方案，利用普通野生稻材料Y11與氮素高效吸收利用品種—GH998雜交、回交和自交獲得的BC₄F₇進行關(guān)聯(lián)分析和遺傳連鎖分析，獲得一個氮素吸收利用位點qNUE6，通過與qNUE6連鎖的分子標(biāo)記來檢測氮素高效吸收利用品種GH998及其衍生品種（系）中是否含有氮素吸收利用位點，可以預(yù)測其氮素吸收利用率水平，大大提高氮素高效吸收利用水稻的選擇效率。本發(fā)明所提供的氮素吸收利用主效基因位點的分子標(biāo)記方法，具有以下優(yōu)點：

（1）本發(fā)明在國際上首次采用聯(lián)合基于全基因組測序的水稻QTL-seq方法和QTL遺傳連鎖分析定位了氮素吸收利用基因位點。

（2）通過本發(fā)明分子標(biāo)記定位的氮素吸收利用基因位點位置精確，鑒定方便、快捷。通過檢測這些與氮素吸收利用基因位點連鎖的分子標(biāo)記，即可以預(yù)測水稻植株的氮素吸收利用率水平，用于水稻品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有氮素高效吸收利用性，進而快速篩選氮素高效吸收利用品種或品系用于水稻育種，氮素吸收利用基因位點的檢測方便快速，不易受環(huán)境影響。

（3）分子標(biāo)記輔助育種選擇目標(biāo)明確，效率高。以往的傳統(tǒng)育種技術(shù)，在提高氮素吸收利用率育種方法中，通常利用含氮素高效吸收利用基因的供體親本與受體親本進行雜交、多次回交或聚合復(fù)交，而且要對氮素吸收利用的效率進行單株選擇；然而，由于水稻氮素吸收利用率的鑒定過程復(fù)雜，影響因素多，鑒定難度很大，表型鑒定的結(jié)果可靠性低；因此，氮素高效吸收利用育種不僅費時費工，而且難度大、成本高。通過利用本發(fā)明中的分子標(biāo)記檢測氮素吸收利用基因位點，可以在苗期就鑒定出氮素高效吸收利用的單株，淘汰其它植株，不僅節(jié)約成本，而且大大提高了氮素高效吸收利用水稻的選擇效率。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的氮素吸收利用基因緊密連鎖分子標(biāo)記的電泳圖譜，

圖2是本發(fā)明的GH998氮素吸收利用基因在染色體上的位置。

圖1中標(biāo)記包括： 1：Y11擴增帶型；2~4：氮素低效吸收利用率株系擴增帶型；5~10：雜合株系擴增帶型；11~13：氮素高效吸收利用率株系擴增帶型；14：GH998擴增帶型。

具體實施方式

下面對本發(fā)明的較優(yōu)的實施例作進一步的詳細說明。

材料與方法：

步驟1：遺傳分析分離群體的構(gòu)建；

以普通野生稻材料Y11為供體，氮素高效吸收利用品種GH998為受體，通過雜交、回交和自交構(gòu)建了一套包含212個株系的水稻染色體片段導(dǎo)入系BC₄F₇

以普通野生稻材料Y11為父本，氮素高效吸收利用品種GH998為母本，配制F₁雜種，再以GH998為母本，998/Y11雜種為父本進行回交直到BC₄F₁，之后進行自交加代繁種獲得BC₄F₇群體。

步驟2：采用田間鑒定進行氮素吸收率鑒定；

2013 年在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所試驗田（22 o51′N，108o14′）開展試驗。試驗田為水稻土，所述水稻田的營養(yǎng)成分為：有機質(zhì)17.05 g/kg，全氮質(zhì)量含量為 0.12%，全磷質(zhì)量含量為 0.11%，全鉀質(zhì)量含量為1.78%，速效氮含量為90.50 mg/kg，速效磷含量為34.00 mg/kg ，速效鉀含量為198.50 mg/kg， pH值為 6.48。

試驗設(shè)不施氮（0 kg/hm²）和施氮（150 kg/hm²）2 個處理，施氮處理分別在插秧后第5天施105 kg/hm²和第25天施45 kg/hm²。鉀肥和磷肥兩個處理相同，鉀肥施用量為100 kg/hm²，分別在插秧第5天施鉀肥70 kg/hm²，在第25天施鉀肥30 kg/hm²，磷100 kg/hm²全部作為基肥。小區(qū)面積為20 m²，行距設(shè)為23.1 cm，株距設(shè)為13.2 cm ，3次重復(fù)。

水稻成熟后，以小區(qū)普查結(jié)果的平均值為依據(jù)，取有代表性的植株10 穴，沿地面割取，莖葉與籽粒分開后，于 105℃烘箱殺青30 min ，75℃烘4天至恒重后稱重，粉碎。使用半微量凱氏定氮法測定植株全氮。按照下式計算氮素吸收利用率：

氮素吸收利用率RE= (TN_F-TN₀)/N×100

其中，TN₀為不施氮植株總含氮量；TN_F為正常施氮植株總含氮量。

步驟3：Y11/GH998 分離群體的氮素吸收利用主基因定位；

（1）在分蘗盛期采取所有單株葉片，放入-80℃的冰箱內(nèi)保存。根據(jù)2013年BC₄F₇群體中所有植株吸收利用率的鑒定結(jié)果，選出吸收利用率極低的30個單株和極高的30個單株，選出這60個單株和2個親本的葉片，利用CTAB法提取植物基因組DNA。用瓊脂糖凝膠電泳分析單個樣品DNA的純度和完整性，將氮素吸收利用率30個極低單株的DNA等量混合組成極低池（L-pool），30個極高的單株DNA等量混合組成極高池（H-pool）。

（2）DNA樣品通過Covaris破碎機隨機打斷成長度為350bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit 進行建庫。DNA片段經(jīng)末端修復(fù)、加ployA尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟完成整個文庫制備。構(gòu)建好的文庫通過illumina HiSeq 2500進行測序，測序深度親本為20×，子代為30×。

（3） QTL-seq分析

測序得到的原始測序序列（Sequenced Reads）或者 raw reads，里面含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads。為了保證信息分析質(zhì)量，必須對raw reads過濾，得到clean reads，后續(xù)分析都基于 clean reads。本次測序共產(chǎn)生Raw data 53.68 Gb，過濾后的Clean data 53.00 Gb。數(shù)據(jù)處理的步驟如下：

①去除帶接頭(adapter)的reads pair；

②當(dāng)單端測序read中含有的N的含量超過該條read長度比例的10%時，需要去除此對paired reads；

③當(dāng)單端測序read中含有的低質(zhì)量（Q ≤ 5）堿基數(shù)超過該條read長度比例的 50% 時，需要去除此對paired reads。

④SNP-index的計算

SNP-index的計算是對子代池中SNP的一種統(tǒng)計方法，其原理是利用測序reads對每個堿基位點的堿基進行統(tǒng)計，以某一親本或參考基因組為參考，統(tǒng)計子代池中和親本或者參考基因組在某一個堿基位點相同或者不相同的reads條數(shù)，計算不相同reads條數(shù)占總條數(shù)的比例，即為該堿基位點的SNP -index。對于有兩個子代池數(shù)據(jù)的項目，我們會過濾掉兩個池中SNP-index均小于0.3的點。對于過濾后的SNP-index利用滑窗口的方式統(tǒng)計某窗口中所有SNP的SNP-index的平均值作為該窗口的SNP-index，一般默認參數(shù)是1Mb的窗口，10kb滑動。按照上述方法分別計算兩個子代池的SNP-index，然后在計算兩個子代池的SNP-index的差值即為△(SNP-index)。

⑤氮素利用率QTL定位

計算△(SNP-index)，即兩個子代SNP-index作差：△(SNP-index) =SNP-index（極端性狀B)-SNP-index(極端性狀A(yù))。進行1000次置換檢驗，選取95%置信水平作為篩選的閾值。分析95%置信水平下，大于閾值的窗口作為候選區(qū)間，在該區(qū)域中挑選兩個子代在SNP-index差異顯著的SNP位點，即挑選子代2（極端性狀B）SNP-index大于等于0.7，且子代1（極端性狀A(yù)）SNP-index小于等于0.3的位點，符合這些特點的區(qū)域可能與氮素吸收利用率相關(guān)的QTL位點。

步驟4：連鎖遺傳作圖分析

在水稻第6染色體上，均勻選取40對分子標(biāo)記（Mccouch, 2002）；通過BWA軟件對Y11和998進行比對，找出兩者之間的插入或者缺失，進而使用Primer5 設(shè)計InDel標(biāo)記。選取在兩親本、兩個池間多態(tài)性好標(biāo)記，用于分析212份BC₄F₇群體。

SSR分析程序如下：

①所述12μlPCR反應(yīng)體系包括：DNA(10ng/μl)，2μl；Primer(4pmol/μl)，1.5μl；2×Taq PCR Master Mix(中科瑞泰)，6μl；ddH2O，2.5μl；

②擴增反應(yīng)在東盛龍ETC811擴增儀上進行，所述PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性35s，55℃復(fù)性35s，72℃延伸1min，35個循環(huán)，最后72℃延伸7min。擴增產(chǎn)物用8%的非變性PAGE膠分離，通過銀染顯色。親本間有多態(tài)的引物在BC₄F₇群體進行分析，獲取樣本基因型資料；

③利用MARMAKER/EXP3.0分析軟件進行氮素吸收利用效率與SSR標(biāo)記的分離分析，并將Kosambi函數(shù)轉(zhuǎn)換為遺傳距離(cM)。利用Windows QTL Cartographer V2.5軟件復(fù)合區(qū)間作圖法（Composite interval mapping ,CIM），以2cM為步長在基因組內(nèi)進行掃描。QTL的檢測采用5%總體顯著水平，相應(yīng)LOD統(tǒng)計量的顯著閾值用排列測驗方法進行估計，其重復(fù)分析1000次。

步驟5：結(jié)果與分析

Y11和GH998的氮素吸收利用率經(jīng)田間鑒定，其值分別為7.09%和33.18.%，表明GH998具有較高的氮素吸收利用能力，而Y11的氮素吸收利用能力很低。經(jīng)過對比氮素利用率低池和高池的SNP-index，分析95%置信水平下，大于閾值的窗口作為候選區(qū)間，我們發(fā)現(xiàn)在第6條染色體上的6,099,043-8,940,631 bp之間出現(xiàn)了SNP不平衡的狀況，是控制水稻氮素利用率的QTL位點，我們將其命名為qNUE6。

從40對SSR標(biāo)記中選取在親本間表現(xiàn)多態(tài)的16對SSR標(biāo)記對63個BC₄F₇單株進行了背景檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)他們在水稻第6染色體標(biāo)記RM539和RM136間區(qū)域有差異。我們利用Y11和GH998重測序結(jié)果設(shè)計了30對插入缺失標(biāo)記，其中24對具有多態(tài)性，結(jié)合上述16對SSR標(biāo)記，對212個高世代群體單株進行基因型分析，利用MAPMAKER3.0和WinQTL Cart 3.0軟件將基因NUE6范圍縮小到8，051，882-8，990，567 bp之間。因此，水稻第6染色體區(qū)間8，051，882-8，990，567 bp可能含有控制水稻氮素利用性狀的基因。如圖2所示，結(jié)果在分子標(biāo)記NUE2和NUE23之間檢測到一個所述水稻氮素吸收利用位點qNUE6，LOD值為4.96，貢獻率為16.8%，可解釋表型變異的16.8%。

分子標(biāo)記NUE2引物序列：

上游引物：GTTCCACATGTTGATGGG

下游引物：GATGAGGACGAGGAGGAG

用分子標(biāo)記NUE2引物擴增氮素高效吸收利用品種或育種材料DNA，如圖1所示，用分子標(biāo)記NUE2能夠擴增出135bp的擴增片段，則標(biāo)志著水稻品種氮素吸收利用的位點qNUE6的存在。

通過與上述基因位點連鎖的分子標(biāo)記來檢測氮素高效吸收利用品種GH998及其衍生品種（系）中是否含有氮素吸收利用基因位點，可預(yù)測其氮素吸收利用水平，大大提高氮素高效吸收利用水稻的選擇效率。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。

序列表（SEQUENCE LISTING）

<110> 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所

<120> 水稻氮素吸收利用位點qNUE6及其分子標(biāo)記方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gttccacatg ttgatggg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gatgaggacg aggaggag 18