本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物催化劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

(R)-3-奎寧醇(分子式C₇H₁₃NO，分子量為127.18，CAS號(hào)：25333-42-0)是合成阿地溴銨、索利那新、瑞伐托酯和他沙利定等藥物的關(guān)鍵中間體。目前工業(yè)上主要是利用手性催化劑不對(duì)稱還原3-奎寧酮合成(R)-3-奎寧醇，如：XylSkewphos/PICA-Ruthenium(II)復(fù)合物或BINAP/IPHAN-Ru(II)復(fù)合物等。但該化學(xué)合成方法需篩選手性配體；所使用的過(guò)渡金屬價(jià)格昂貴、毒性較大、難以從產(chǎn)物中去除；而且制備的產(chǎn)物光學(xué)純度較低，需進(jìn)一步純化。另一種方法是外消旋拆分，該方法的缺陷在于其理論產(chǎn)率最大只有50％。

相對(duì)于化學(xué)合成方法，以酶做催化劑的生物合成法具有底物特異性；高度化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性；反應(yīng)條件溫和；催化活性高；原子經(jīng)濟(jì)性好等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。生物方法合成(R)-3-奎寧醇涉及兩個(gè)過(guò)程：一是借助羰基還原酶利用NADH或NADPH將3-奎寧酮還原為(R)-3-奎寧醇；二是借助輔酶再生酶將氧化型NAD⁺或NADP⁺轉(zhuǎn)化為還原型NADH或NADPH，實(shí)現(xiàn)雙酶偶聯(lián)不對(duì)稱還原合成(R)-3-奎寧醇。具體過(guò)程如下：

生物催化不對(duì)稱還原合成(R)-3-奎寧醇過(guò)程。

無(wú)論是用野生型微生物還是重組大腸桿菌作為生物催化劑，由于細(xì)胞本身結(jié)構(gòu)的限制致使底物/產(chǎn)物、輔酶在細(xì)胞內(nèi)外交換受阻，導(dǎo)致生物轉(zhuǎn)化時(shí)間長(zhǎng)、催化效率低。而游離酶作催化劑，酶穩(wěn)定性和由酶純化所致的高成本，都是酶作為生物催化劑必須解決的問(wèn)題。此外，這兩種生物催化劑都難以回收和循環(huán)利用。

實(shí)際應(yīng)用中，為了提高酶的穩(wěn)定性、催化活性和選擇性，可將酶與特定載體結(jié)合形成固定化酶，而固定化酶生物催化劑易于從反應(yīng)混合物中分離、可循環(huán)再利用和實(shí)現(xiàn)連續(xù)反應(yīng)(Robert Dicosimo,Joseph Mcauliffe,Ayrookaran J.Pouloseb and Gregory Bohlmann,Industrial use of immobilized enzymes,Chem.Soc.Rev.,2013,42,6437-6474；Joshua Britton,Colin L.Raston and Gregory A.Weiss,Rapid protein immobilization for thin film continuous flow biocatalysis,Chem.Commun.,2016,52,10159-10162)。常規(guī)酶固定化方法包括物理吸附、化學(xué)結(jié)合、包埋和形成交聯(lián)酶聚集體。物理方法簡(jiǎn)單、快速、不易致酶失活，但酶易泄露，而載體本身也容易遮蔽酶活性位點(diǎn)，妨礙底物結(jié)合?；瘜W(xué)方法有利于增加酶穩(wěn)定性，但易致酶失活(Suwan Myung,Chun You and Y.-H.Percival Zhang,Recyclable cellulose-containing magnetic nanoparticles:immobilization of cellulose-binding module-tagged proteins and a synthetic metabolon featuring substrate channeling,J.Mater.Chem.B,2013,1,4419-4427；Wen Wang,Daniel I.C.Wang and Zhi Li,Facile fabrication of recyclable and active nanobiocatalyst:purification and immobilization of enzyme in one pot with Ni-NTA functionalized magnetic nanoparticle,Chem.Commun.,2011,47,8115–8117；Fuhua Zhao,Hui Li,Yijun Jiang,Xicheng Wang and Xindong Mu,Co-immobilization of multi-enzyme on control-reduced graphene oxide by non-covalent bonds:an artificial biocatalytic system for the one-pot production of gluconic acid from starch,Green Chem.,2014,16,2558-2565)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明的目的在于提供一種生物催化劑，該生物催化劑穩(wěn)定性好，催化活性好，具有長(zhǎng)期操作穩(wěn)定性和可循環(huán)再利用。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種生物催化劑，包含NADH依賴的特異性3-奎寧酮還原酶(QNR)、葡萄糖脫氫酶(GDH)、Ni²⁺功能化瓊脂糖微球，其特征在于：在衍射角度2θ為27.5±0.2°、31.7±0.2°、45.5±0.2°、52.1±0.2°、66.4±0.2°、75.8±0.2°處有衍射峰。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，上述生物催化劑還含有氯化鈉和磷酸二氫鈉。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，上述生物催化劑具有泡沫樣多孔結(jié)構(gòu)，孔徑為10nm-2.5μm。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，上述生物催化劑酶負(fù)載量為5-15％。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明的另一目的在于提供上述生物催化劑的制備方法。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，上述生物催化劑的制備方法，其特征在于，采用如下步驟：

步驟(1)

用緩沖溶液A平衡Ni²⁺功能化瓊脂糖微球，加入含帶組氨酸標(biāo)簽的3-奎寧酮還原酶(His-QNR)和帶組氨酸標(biāo)簽的葡萄糖脫氫酶(His-GDH)的細(xì)胞裂解混合上清液，用含5-15mM咪唑的緩沖溶液A稀釋成混懸液；

步驟(2)

將步驟(1)制備的混懸液以轉(zhuǎn)速30～100rpm在溫度4～30℃、pH5.0～10.0的條件下連續(xù)攪拌1～3h；然后離心，收集載酶瓊脂糖微球，用步驟(1)的緩沖溶液A洗滌；

步驟(3)

將洗滌后的載酶瓊脂糖微球分散在步驟(1)的緩沖溶液A中，置于2～8℃冰箱孵育1～5天；既得；

所述緩沖溶液A的pH值為7.8-8.2。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，上述緩沖溶液A含50mM磷酸二氫鈉和300mM氯化鈉。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明的再一目的在于提供上述生物催化劑在合成(R)-3-奎寧醇中的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明的再一目的在于提供一種(R)-3-奎寧醇的合成方法，該方法使用上述生物催化劑進(jìn)行酶催化反應(yīng)，合成(R)-3-奎寧醇。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，一種(R)-3-奎寧醇的合成方法，其特征在于：

將生物催化劑分散在緩沖溶液B中，加入3-奎寧酮，葡萄糖、NAD⁺和NADH，在室溫條件下，pH為7.5-8.0，以50～150rpm轉(zhuǎn)速振蕩，生物轉(zhuǎn)化時(shí)間為1-12h；所述緩沖溶液B的pH值為7.2-7.4。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述緩沖溶液B為10mM磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，含NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na₂HPO₄10mM，KH₂PO₄2mM。

具體的，一種(R)-3-奎寧醇的生物催化合成方法，包括如下步驟：

步驟(1)

用緩沖溶液A平衡Ni²⁺功能化瓊脂糖微球，加入含帶組氨酸標(biāo)簽的3-奎寧酮還原酶(His-QNR)和帶組氨酸標(biāo)簽的葡萄糖脫氫酶(His-GDH)的細(xì)胞裂解混合上清液，用含5-15mM咪唑的緩沖溶液A稀釋成混懸液；

步驟(2)

將步驟(1)制備的混懸液以轉(zhuǎn)速30～100rpm在溫度4～30℃、pH5.0～10.0的條件下連續(xù)攪拌1～3h；然后離心，收集載酶瓊脂糖微球，用步驟(1)的緩沖溶液A洗滌；

步驟(3)

將洗滌后的載酶瓊脂糖微球分散在步驟(1)的緩沖溶液A中，置于2～8℃冰箱孵育1～5天；制得生物催化劑；

步驟(4)

將生物催化劑分散在緩沖溶液B中，加入3-奎寧酮，葡萄糖、NAD⁺和NADH，在室溫條件下，pH為7.5-8.0，以50～150rpm轉(zhuǎn)速振蕩，生物轉(zhuǎn)化時(shí)間為1-12h；

所述緩沖溶液A含50mM磷酸二氫鈉和300mM氯化鈉，pH值為7.8-8.2；

所述緩沖溶液B為10mM磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，含NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na₂HPO₄10mM，KH₂PO₄2mM，pH值為7.2-7.4。

有益效果：

1、本發(fā)明基于Ni²⁺和多聚組氨酸標(biāo)簽間的強(qiáng)親和作用直接從細(xì)胞裂解液中同時(shí)純化和固定化His-QNR和His-GDH，制備的生物催化劑在衍射角度2θ為27.5±0.2°、31.7±0.2°、45.5±0.2°、52.1±0.2°、66.4±0.2°、75.8±0.2處有衍射峰。該生物催化劑具有泡沫樣多孔結(jié)構(gòu)，孔徑為10nm-2.5μm，酶負(fù)載量高達(dá)5-15％，催化活性好。

2、使用本發(fā)明生物催化劑作為固定化酶催化劑，用于(R)-3-奎寧醇的生物催化合成，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)羰基還原和輔酶原位再生，無(wú)需添加昂貴的輔酶NADH。同時(shí)本發(fā)明的生物催化劑可回收和循環(huán)再利用，且具有長(zhǎng)期操作穩(wěn)定性。

3、本發(fā)明酶固定化方法不需要預(yù)純化目標(biāo)蛋白，能同時(shí)完成目標(biāo)蛋白的純化和固定化；同時(shí)能特異性富集目標(biāo)蛋白的活性；制備的固定化酶穩(wěn)定性好，方法操作簡(jiǎn)單，不需要特殊設(shè)備，工藝條件溫和，成本低，適合工業(yè)化。

4、使用本發(fā)明生物催化劑不對(duì)稱合成(R)-3-奎寧醇，收率高達(dá)70-85％，轉(zhuǎn)化率為100％，對(duì)映體值為100％，同時(shí)可循環(huán)使用15次以上，經(jīng)濟(jì)效益大。本發(fā)明生物催化不對(duì)稱合成(R)-3-奎寧醇所用介質(zhì)為水，可以節(jié)約資源，不污染環(huán)境，符合綠色化學(xué)的要求。

附圖說(shuō)明

圖1是生物催化劑的SDS-PAGE分析；

圖2是溫度對(duì)Ni²⁺功能化瓊脂糖微球酶負(fù)載量的影響；

圖3是pH值對(duì)Ni²⁺功能化瓊脂糖微球酶負(fù)載量的影響；

圖4是Ni²⁺功能化瓊脂糖微球和總蛋白質(zhì)量比對(duì)酶特異性活性和活性回收率的影響；

圖5是生物催化劑的掃描電鏡分析；

圖6是生物催化劑的粉末X衍射分析；

圖7是生物催化劑的熱重分析；

圖8是3-奎寧酮和(R)-3-奎寧醇的紅外光譜分析；

圖9是生物催化劑的循環(huán)再利用；

圖10是不同循環(huán)批次的生物催化劑的SDS-PAGE分析。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，在此指出以下實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。本發(fā)明所有原料及試劑均為市售產(chǎn)品。本發(fā)明所用羰基還原酶為NADH依賴的特異性的3-奎寧酮還原酶(QNR,Accession No:AB733448)，輔酶再生酶為葡萄糖脫氫酶(GDH,Accession No:AY930464)。

實(shí)施例1

酶活性測(cè)定

QNR酶活性測(cè)定：

標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合體系：緩沖溶液B(PBS，pH7.2-7.4)，3μmol 3-奎寧酮，0.3μmol NADH，適量的酶QNR，總體積1mL。在λ＝340nm處測(cè)定吸光度值變化。酶活性單位定義：25℃，1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1μmol NADH所需的酶量。

GDH酶活性測(cè)定：

標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合體系：緩沖溶液B(PBS，pH7.2-7.4)，10μmol葡萄糖，1μmol NAD⁺，適量的酶GDH，總體積1mL。在λ＝340nm處測(cè)定吸光度值變化。酶活性單位定義：25℃，1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1μmol NAD⁺所需的酶量。

實(shí)施例2

共固定His-QNR和His-GDH

取50mg Ni²⁺功能化瓊脂糖微球，用緩沖溶液A(含50mM磷酸二氫鈉和300mM氯化鈉，pH值為7.8-8.2)平衡；然后加入2mL含奎寧酮還原酶(His-QNR)和葡萄糖脫氫酶(His-GDH)的細(xì)胞裂解混合上清液，用含10mM咪唑的緩沖溶液A稀釋至5mL。在溫度25℃，pH8.0，轉(zhuǎn)速50rpm，連續(xù)攪拌上述混懸液2h。將上述混懸液離心，收集載酶瓊脂糖微球，用緩沖溶液A洗滌兩次。將洗滌后的載酶瓊脂糖微球重新分散在緩沖溶液A中，置于4℃冰箱孵育4天。

對(duì)實(shí)施例2制備的生物催化劑進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

SDS-PAGE分析結(jié)果見(jiàn)附圖1。圖中M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量；L₁為表達(dá)His-QNR的重組大腸桿菌和表達(dá)His-GDH的重組大腸桿菌；L₂為兩種重組大腸桿菌的細(xì)胞裂解混合上清液；L₃、L₄、L₅和L₆為用10mM、250mM、500mM和1M洗脫生物催化劑的收集液。在分子量35-25kDa之間，出現(xiàn)兩個(gè)明顯的蛋白質(zhì)條帶，分別對(duì)應(yīng)QNR(25.74kDa)和GDH(28.25kDa)，目標(biāo)蛋白純度均在90％以上，證實(shí)本發(fā)明提供的親和固定化方法能直接從細(xì)胞裂解液中同時(shí)純化和固定化His-QNR和His-GDH。

參照實(shí)施例2的制備方法，考察溫度、pH值對(duì)Ni²⁺功能化瓊脂糖微球酶負(fù)載量和酶負(fù)載效率的影響；考察Ni²⁺功能化瓊脂糖微球和總蛋白質(zhì)量比對(duì)酶特異性活性和活性回收率的影響。

溫度對(duì)Ni²⁺功能化瓊脂糖微球酶負(fù)載量和負(fù)載效率的影響結(jié)果見(jiàn)附圖2。當(dāng)溫度從4℃上升到25℃時(shí)，酶負(fù)載量從27.5增加到59.6mg/g(Ni²⁺功能化瓊脂糖微球)，負(fù)載效率從51.6％增加到89.7％。當(dāng)溫度超過(guò)30℃時(shí)，酶負(fù)載量和負(fù)載效率并沒(méi)有增加，表明固定化的最佳溫度為25℃。

pH對(duì)Ni²⁺功能化瓊脂糖微球酶負(fù)載量和負(fù)載效率的影響結(jié)果見(jiàn)附圖3。溫度25℃，當(dāng)pH值為8.0時(shí)，酶負(fù)載量達(dá)到最大值為60.8mg/g(Ni²⁺功能化瓊脂糖微球)，而酶負(fù)載效率達(dá)到最大值為92.3％。因此，固定化的最佳pH值為8.0.

Ni²⁺功能化瓊脂糖微球和總蛋白質(zhì)量比對(duì)酶特異性活性和活性回收率的影響見(jiàn)附圖4。Ni²⁺功能化瓊脂糖微球和總蛋白質(zhì)量比從4/1增加到8/1時(shí)，QNR和GDH的特異性活性分別為從5.3U/mg增加到8.4U/mg和5.6U/mg增加到11.5U/mg，活性回收率分別從61.2％增加到94.6％和64.2％增加到98.6％。但質(zhì)量比從8/1增加到10/1時(shí)，特異性活性和活性回收率變化不大。酶固定化時(shí)，Ni²⁺功能化瓊脂糖微球和總蛋白質(zhì)量比以8/1為宜。

對(duì)實(shí)施例2制備的生物催化劑進(jìn)行掃描電鏡分析

將樣品溶液滴加于潔凈的蓋玻片上，40℃真空干燥，噴金覆蓋樣品，用掃描電鏡(SEM,S-3000N型)和場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM，F(xiàn)EI NOVA NanoSEM 400)成像，分析結(jié)果見(jiàn)附圖5。附圖5a為Ni²⁺功能化瓊脂糖微球，表面光滑。附圖5b為固定酶以后的Ni²⁺功能化瓊脂糖微球，即生物催化劑，其表面形態(tài)與附圖5a所示完全不同，出現(xiàn)尺度和形態(tài)不規(guī)則且相互緊密連接的小球。將生物催化劑進(jìn)一步用FE-SEM分析發(fā)現(xiàn)，生物催化劑表面為泡沫樣多孔結(jié)構(gòu)，孔徑在10nm-2.5μm之間(附圖5c，d)，這種多孔結(jié)構(gòu)有利于局部富集高濃度底物/輔酶和物質(zhì)快速交換，既能提高反應(yīng)速度又能提高催化效率。

對(duì)實(shí)施例2制備的生物催化劑進(jìn)行粉末X衍射(XRD)分析

使用普析XD-2X-ray衍射儀測(cè)定樣品晶體衍射峰，測(cè)試條件：Cu靶電壓30kV，電流15mA，掃描速度2°/min，步長(zhǎng)0.02°，掃描范圍5°to 50°，分析結(jié)果見(jiàn)附圖6。從圖中可見(jiàn)：生物催化劑的XRD譜中，2θ在27.5±0.2°、31.7±0.2°、45.5±0.2°、52.1±0.2°、66.4±0.2°和75.8±0.2°處出現(xiàn)特征峰，強(qiáng)度分布為845、1450、1005、850、800和830。而蛋白質(zhì)和Ni²⁺功能化瓊脂糖微球的XRD譜圖中，并沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)的特征峰。

對(duì)實(shí)施例2制備的生物催化劑進(jìn)行熱重分析(TGA)

使用Mettler 1100SF系統(tǒng)測(cè)定生物催化劑的酶負(fù)載量。將約2mg樣品置于鋁鍋中，按20mL/min通入氮?dú)?，加熱速度?5℃/min，掃描范圍為30-600℃。TGA分析結(jié)果見(jiàn)附圖7。根據(jù)失重計(jì)算，生物催化劑酶負(fù)載量為5.94％。

實(shí)施例3

生物催化劑催化不對(duì)稱合成(R)-3-奎寧醇：

反應(yīng)體系：50mg生物催化劑，5mM 3-奎寧酮，9mM葡萄糖,0.05mM NAD⁺和0.05mM NADH，緩沖溶液B(10mM磷酸緩沖鹽溶液,PBS)，含NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na₂HPO₄10mM，KH₂PO₄2mM，pH值為7.2-7.4)，總體積10mL。反應(yīng)溫度25℃，以100rpm連續(xù)攪拌，反應(yīng)過(guò)程中pH控制在7.5-8.0.用TLC監(jiān)控反應(yīng)，流動(dòng)相為V_二氯甲烷/V_甲醇＝9/1。生物轉(zhuǎn)化完成后，將反應(yīng)混合物離心分離生物催化劑。上清液用高濃度NaOH調(diào)節(jié)至pH值大于12，然后在80℃減壓濃縮至總體積的1/4。加入等體積的正丁醇抽提3次，收集有機(jī)相，減壓濃縮蒸干。在90℃，用甲苯溶解固體，難溶物趁熱過(guò)濾，濾液冷卻，有白色針狀晶體出現(xiàn)，過(guò)濾，得白色固體(¹H-NMR(400MHz，DMSO)：δ4.946(s，1H)，δ3.879(q，1H)，δ2.531-3.164(m，6H)，δ1.392-2.014(m，5H)，產(chǎn)物的理論分子量為：127.18，質(zhì)譜測(cè)定為：127)。

對(duì)實(shí)施例3制備的白色固體進(jìn)行紅外光譜分析以及構(gòu)型分析

紅外光譜分析：采用KBr壓片法制備樣品，范掃波長(zhǎng)描圍4000～400cm^-1，底物和產(chǎn)品的紅外光譜圖見(jiàn)附圖8。結(jié)果顯示3-奎寧酮在1747cm^-1左右的羰基特征峰消失，而在3103cm^-1出現(xiàn)羥基特征峰，表明3-奎寧酮被還原成3-奎寧醇。

構(gòu)型分析

用Clarus580GC系統(tǒng)(Perkin Elmer,USA)測(cè)定對(duì)映體值，手性柱為(HYDRODEX-β-6-TBDM,25m×0.25mm×0.25μm,Macherey-Nagel)，使用火焰離子檢測(cè)器。從60℃程序升溫至180℃，升溫速度為5℃/min，保持3min.進(jìn)樣器和檢查器的溫度分別為220℃和250℃。以標(biāo)準(zhǔn)品(R)和(S)-奎寧醇做對(duì)照，測(cè)得產(chǎn)品的對(duì)映體值為100％，其構(gòu)型R型。

參照實(shí)施例3，考察底物和催化劑的用量對(duì)轉(zhuǎn)化時(shí)間、轉(zhuǎn)化率和對(duì)映體值的影響，具體見(jiàn)下表1。

當(dāng)生物催化劑用量為底物的6.12％時(shí)，隨底物量增大，生物轉(zhuǎn)化時(shí)間從1.0h增加到4.5h，轉(zhuǎn)化率和對(duì)映體值均為100％。當(dāng)?shù)孜锪繛?04g/L，催化劑減半時(shí)，轉(zhuǎn)化時(shí)間為9.5h，催化活性明顯降低，轉(zhuǎn)化率小于100％，對(duì)映體值仍為100％。表明底物用量影響生物催化劑的活性，轉(zhuǎn)化時(shí)間延長(zhǎng)，但不影響其立體選擇性。

實(shí)施例4

生物催化劑的回收和循環(huán)再利用。

反應(yīng)體系：100mg生物催化劑，10mM奎寧酮，18mM葡萄糖,0.05mM NAD⁺和0.05mM NADH，緩沖溶液B(PBS,pH7.2-7.4)，總體積10mL。反應(yīng)溫度25℃，以100rpm.連續(xù)攪拌，反應(yīng)過(guò)程中控制pH在7.5-8.0.TLC監(jiān)控反應(yīng)完成后，離心收集催化劑，直接用于下一次轉(zhuǎn)化。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供的生物催化劑可循環(huán)15次，單次循環(huán)的轉(zhuǎn)化率和對(duì)映體值均為100％，結(jié)果見(jiàn)附圖9。循環(huán)15次以后，催化效率明顯降低。在生物催化劑循環(huán)再利用過(guò)程中，分別在第2次、4次、6次....20次轉(zhuǎn)化完成后，取少量催化劑進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見(jiàn)附圖10。發(fā)現(xiàn)生物催化劑在循環(huán)使用過(guò)程中，固定化的酶量沒(méi)有明顯減少，表明本發(fā)明提供的生物催化劑具有長(zhǎng)期操作穩(wěn)定性。

實(shí)施例5(對(duì)比實(shí)施例)

在不經(jīng)過(guò)本發(fā)明生物催化劑處理，直接用表達(dá)His-QNR和表達(dá)His-GDH的重組大腸桿菌處理實(shí)驗(yàn)，以作對(duì)比。反應(yīng)體系：0.1g混合濕細(xì)胞作生物催化劑，5mM 3-奎寧酮，9mM葡萄糖,0.05mM NAD⁺和0.05mM NADH，緩沖溶液B(PBS，pH7.2-7.4)，總體積10mL。反應(yīng)溫度25℃，以100rpm連續(xù)攪拌，反應(yīng)過(guò)程中控制pH在7.5-8.0.用TLC監(jiān)控反應(yīng)，流動(dòng)相為V_二氯甲烷/V_甲醇＝9/1。轉(zhuǎn)化時(shí)間明顯延長(zhǎng)(5.5h)，轉(zhuǎn)化率為95％，對(duì)映體值100％，不能回收和循環(huán)利用。