本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體是涉及hESCs-TK細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

人類胚胎干細(xì)胞(hESCs)具有無(wú)限的自我更新能力，同時(shí)能夠保持其分化成為所有類型的人類體細(xì)胞的全能性。因此，hESCs在人類疾病治療和模型建立的應(yīng)用上具有廣闊的發(fā)展前景。自從Thomson在1998年成功建立了第一株hESCs，人類干細(xì)胞療法在發(fā)展中實(shí)現(xiàn)了重大的突破。在此背景下，脊髓損傷、黃斑部退化以及I型糖尿病的干細(xì)胞治療已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。目前1/2階段的臨床研究顯示來(lái)源于hESC的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可以有效改善衰老引起的黃斑部退化以及Stargardt黃斑部營(yíng)養(yǎng)不良病人的視力。

在干細(xì)胞療法顯示出廣闊應(yīng)用前景的同時(shí)，幾個(gè)嚴(yán)重的瓶頸阻礙了其臨床應(yīng)用發(fā)展。其中一個(gè)關(guān)鍵的瓶頸是hESC分化的同種異體移植物遭遇機(jī)體的免疫排斥。為了解決這個(gè)問(wèn)題，醫(yī)學(xué)界研發(fā)了多種免疫抑制或者免疫耐受治療策略。通過(guò)應(yīng)用具有人類免疫系統(tǒng)的人源化小鼠動(dòng)物模型，在hESCs及其分化的細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)兩個(gè)免疫抑制蛋白CTLA4-Ig和PD-L1，我們研發(fā)了一種新型的抑制同種異體免疫排斥的方法。隨后的研究顯示，使用抗體阻斷CD28和CD40共激活通路可以實(shí)現(xiàn)hESC分化的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞在另一種人源化小鼠模型的免疫耐受。然而，這些免疫抑制或者耐受的策略會(huì)顯著提高移植后的hESC分化細(xì)胞的癌變風(fēng)險(xiǎn)，即使免疫抑制是可逆轉(zhuǎn)的，這些移植后的細(xì)胞可以逃避機(jī)體免疫監(jiān)視。另外，移植后的細(xì)胞可能會(huì)引起諸如細(xì)胞不受控制的遷移至其他部位等嚴(yán)重問(wèn)題。因此，研發(fā)一種在免疫抑制條件下改善移植后細(xì)胞的安全性的方法非常重要。

單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVTK，以下簡(jiǎn)稱為TK)基因編碼了一種可以把無(wú)毒性的更昔洛韋(GCV)轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸拘缘母袈屙f三磷酸鹽，其可以整合到分裂期細(xì)胞的DNA中抑制DNA的合成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。前期研究表明這個(gè)基因可以有效并安全的應(yīng)用于小鼠模型和腫瘤基因治療法。因此，利用TK的特性開(kāi)發(fā)一種消除移植后的免疫耐受hESC分化細(xì)胞的癌變風(fēng)險(xiǎn)的策略對(duì)胚胎干細(xì)胞療法的安全性具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于上述，本發(fā)明的目的之一為構(gòu)建CPTK-hESCs細(xì)胞系，構(gòu)建得到的胚胎干細(xì)胞表面能夠高水平表達(dá)TK。

實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：

一種CPTK-hESCs的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

A.hESCs的培養(yǎng)；

B.構(gòu)建同源重組修復(fù)模板pBACe3.6RP11-671P4-452CNP-CPTK細(xì)菌人工染色體：細(xì)菌人工染色體pBACe3.6RP11-671P4購(gòu)自Invitrogen。該修復(fù)模板DNA載體5’端至3’端依次包括有約124kb的HPRT1基因上游同源臂、LoxP位點(diǎn)、CAG啟動(dòng)子、抗性篩選基因Puro/IRES/Neo、LoxP位點(diǎn)、CAG啟動(dòng)子、目標(biāo)基因CTLA4-Ig/IRES/PD-L1/IRES/TK、polyA多聚腺苷酸和約71kb的HPRT1基因下游同源臂；

C.將線性化的修復(fù)模板電轉(zhuǎn)染進(jìn)入hESCs細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后加入培養(yǎng)液令細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)，隨后加入含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選分離出單克隆，再加入含有6-硫代鳥(niǎo)嘌呤的培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選，選取陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株，再次轉(zhuǎn)染表達(dá)Cre酶的pCAG/Cre/polyA質(zhì)粒進(jìn)去該細(xì)胞，篩選無(wú)嘌呤霉素抗性的單克隆細(xì)胞，得到CPTK-hESCs細(xì)胞系。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，電轉(zhuǎn)染的具體參數(shù)為：0.4cm電擊杯，320volt，200μF，10x10⁶-40x10⁶，DNA質(zhì)量為20-40μg。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，嘌呤霉素濃度為1.5-2.0μg/ml。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，培養(yǎng)基中的6-硫代鳥(niǎo)嘌呤濃度為0.5-1.5mM。

本發(fā)明的另一目的是提供一種CPTK-hESCs細(xì)胞系，其可用于提高胚胎干細(xì)胞療法的安全性。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，LoxP位點(diǎn)的堿基序列為：如SEQ ID NO.1所示的序列，或如SEQ ID NO.1所示，且有一個(gè)或多個(gè)堿基被取代，但活性不改變的序列；和/或所述CAG啟動(dòng)子堿基序列為：如SEQ ID NO.2所示的序列，或如SEQ ID NO.2所示的，且有一個(gè)或多個(gè)堿基被取代，但活性不改變的序列。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，抗性篩選基因Puro/IRES/Neo堿基序列為:如SEQ ID NO.3所示的序列；或如SEQ ID NO.3所示的，且有一個(gè)或多個(gè)堿基被取代，但活性不改變的序列；和/或polyA多聚腺苷酸堿基序列為：如SEQ ID NO.5所示的序列,或如SEQ ID NO.5所示的，且有一個(gè)或多個(gè)堿基被取代，但活性不改變的序列。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述目標(biāo)基因CTLA4-Ig/IRES/PD-L1/IRES/TK堿基序列為：如SEQ ID NO.4所示的序列；或如SEQ ID NO.4所示的，且有一個(gè)或多個(gè)堿基被取代，但活性不改變的序列。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述HPRT1基因上游同源臂的序列為：NCBI的序列編號(hào)為NC_000023.11中從134376991至134500246的堿基序列，或如NCBI的序列編號(hào)為NC_000023.11中從134376991至134500246的，且有一個(gè)或多個(gè)堿基被取代，但活性不改變的序列；和/或

所述HPRT1基因下游同源臂堿基序列組成為：NCBI的序列編號(hào)為:NC_000023.11中從134500874到134571880的序列，或如NC_000023.11中從134500874到134571880的，且有一個(gè)或多個(gè)堿基被取代，但活性不改變的序列。

根據(jù)上述構(gòu)建方法得到的CPTK-hESCs細(xì)胞系。

本發(fā)明的另一目的是提供上述CPTK-hESCs細(xì)胞系的應(yīng)用。

具體技術(shù)方案如下。

上述的CPTK-hESCs細(xì)胞系在制備消除逃逸免疫監(jiān)測(cè)的干細(xì)胞衍生細(xì)胞癌變風(fēng)險(xiǎn)的生物制劑中的應(yīng)用。

通過(guò)本發(fā)明基因敲入的設(shè)計(jì)，本發(fā)明通過(guò)把TK基因敲入至hESCs的管家基因HPRT1位點(diǎn)，PCR鑒定基因是否已經(jīng)敲入至hESCs，結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)及數(shù)細(xì)胞鑒定體外培養(yǎng)的CPTK-hESCs細(xì)胞系是否對(duì)GCV敏感。隨后CPTK-hESCs分別皮下注射至NSG小鼠或者人源化小鼠，畸胎瘤成型后腹腔注射GCV，以確定GCV能否有效去除體內(nèi)的hESCs。CPTK分化為心肌細(xì)胞后肌肉注射至NSG小鼠或者人源化小鼠后腿肌肉，1至2周后進(jìn)行冰凍切片并且染色以鑒定GCV能否消除分化后的hESCs。以CPTK-hESCs為系統(tǒng)，本發(fā)明建立了在hESCs中以TK基因/GCV為基礎(chǔ)的消除技術(shù)，提供所述的CPTK-hESCs細(xì)胞系在制備消除逃逸免疫監(jiān)測(cè)的干細(xì)胞衍生細(xì)胞癌變風(fēng)險(xiǎn)的生物制劑中的應(yīng)用，為胚胎干細(xì)胞的臨床治療應(yīng)用提供了更加安全的保障。

附圖說(shuō)明

圖1為利用細(xì)菌人工染色體技術(shù)，通過(guò)同源重組將pCAG/CTLA4-lg/IRES/PD-L1/IRES/TK/polyA基因表達(dá)框敲入hESCs細(xì)胞HPRT1基因位點(diǎn)，其中：

A.人類HPRT1基因位點(diǎn)的構(gòu)型。黑框代表HPRT1的外顯子編碼區(qū)，白框代表HPRT1的3‘非翻譯區(qū)；黑色三角箭頭代表PCR鑒定的引物位置；

B.同源重組后等位基因的構(gòu)型，其中黑框代表HPRT1的外顯子編碼區(qū)，白框代表HPRT1的3‘非翻譯區(qū)；黑色三角箭頭代表PCR鑒定的引物位置。虛線箭頭標(biāo)識(shí)范圍分別是上下游同源臂，其中上游同源臂為124kb，下游同源臂為71kb；

C.同源重組后的PCR鑒定；圖片上半部分使用的引物為p1、p2和p5，其中如A和B所示，引物p1和p2擴(kuò)增長(zhǎng)度為404bp的野生型片段，引物p1和p5擴(kuò)增長(zhǎng)度為503bp的加Cre重組后沒(méi)有抗性篩選基因的等位基因片段，引物p1和p5擴(kuò)增長(zhǎng)度為311bp的加Cre重組前具有抗性篩選基因的等位基因片段；圖片下半部分使用的引物為p3、p4和p5，其中如A和B所示，引物p3和p4擴(kuò)增長(zhǎng)度為406bp的野生型片段，引物p3和p5擴(kuò)增長(zhǎng)度為277bp的加Cre重組前/后的等位基因片段；

D.藥物毒性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等位基因的同源重組；

E.Western Blotting驗(yàn)證CPTK-hESCs中CTLA4-Ig基因的表達(dá)；

F.流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證CPTK-hESCs細(xì)胞表面高表達(dá)PD-L1基因。

圖2為CPTK-hESCs的ES細(xì)胞特性及TK基因的功能鑒定，其中：

A.流式細(xì)胞術(shù)比較了野生型hESCs和CPTK-hESCs的全能性標(biāo)記物的表達(dá)。驗(yàn)證了CPTK-hESCs的全能性；

B.qPCR比較了野生型hESCs和CPTK-hESCs的全能性基因的表達(dá)。再次驗(yàn)證了CPTK-hESCs的全能性；

C.免疫缺陷的NSG小鼠的畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了CPTK-hESCs能有效形成畸胎瘤的全能性；

D.體外GCV梯度藥物毒性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CPTK-hESCs對(duì)GCV的敏感性；

E.體外GCV時(shí)間藥物毒性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了GCV能在4天能徹底清除CPTK-hESCs。

圖3驗(yàn)證了TK基因并不影響CTLA4-Ig和PD-L1基因的功能，其中：

A.在免疫缺陷的NSG小鼠中野生型hESCs和CPTK-hESCs均能有效形成畸胎瘤，而在具有人類免疫系統(tǒng)的人源化小鼠中野生型hESCs不能形成正?；チ?，表明CPTK-hESCs具有免疫耐受的功能。

B.流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證野生型hESCs中具有大量的人CD3T細(xì)胞的浸潤(rùn)，而CPTK-hESCs中只有少量CD3T細(xì)胞。

C.免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證野生型hESCs中具有大量的人CD3T細(xì)胞的浸潤(rùn)，而CPTK-hESCs中只有少量CD3T細(xì)胞。

D.在NSG小鼠或者人源化小鼠中野生型hESCs和CPTK-hESCs被排斥的統(tǒng)計(jì)。

E.H&E染色驗(yàn)證了人源化小鼠中野生型hESCs不能形成正常的畸胎瘤，而CPTK-hESCs能形成完整的畸胎瘤。

圖4驗(yàn)證了GCV能有效消除小鼠體內(nèi)的CPTK-hESCs，其中，

A.在NSG小鼠和人源化小鼠體內(nèi)，腹腔注射GCV后，CPTK-hESCs形成的畸胎瘤隨著時(shí)間變化而縮小。最后僅殘留極小的一塊組織；

B.免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)表明了殘留的組織不是人類組織，證明了CPTK-hESCs已被GCV完全清除；

C.在NSG小鼠或者人源化小鼠中野生型hESCs和CPTK-hESCs被GCV清除的統(tǒng)計(jì)。

圖5驗(yàn)證了CPTK-hESCs分化為心肌細(xì)胞后仍然可以被GCV在小鼠體內(nèi)清除；其中，

A.qPCR驗(yàn)證了野生型hESCs和CPTK-hESCs分化的心肌細(xì)胞均具有相似表達(dá)量的心肌細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)；

B.流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證野生型hESCs和CPTK-hESCs分化的心肌細(xì)胞表面表達(dá)了相關(guān)的標(biāo)記物；

C.免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)表明了GCV能清除注射在人源化小鼠后腿肌肉上的CPTK-hESCs分化的心肌細(xì)胞。

具體實(shí)施方式

除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。

為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實(shí)施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來(lái)實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容的理解更加透徹全面。

下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人的《分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑均為市售產(chǎn)品。

實(shí)施例1：CPTK-hESCs細(xì)胞株的建立

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

hESCs細(xì)胞(Hues3,NIHhESC-09-0016)培養(yǎng)維持在CF1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基Knockout Dulbecco’s modified Eagle’s medium加入10％的Knockout serum replacement、10％的plasmanate，0.1mM的非必需氨基酸，2mM的Glutamax，100units/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，10ng/ml的basic fibroblast growth factor(bFGF)和55μM的β-Mercaptoethanol。

hESCs用TrypLE來(lái)消化傳代。

1.2BAC載體的構(gòu)建

HPRT1 Bac載體(細(xì)菌人工染色體)RP11-671P4購(gòu)自Invitrogen，靶向Bac載體如現(xiàn)有⁽[1]Song H,Chung SK,Xu Y.Modeling disease in human ESCs using an efficient BAC-based homologous recombination system.Cell stem cell.2010；6:80-89；

[2]Rong Z,Wang M,Hu Z et al.An effective approach to prevent immune rejection of human ESC-derived allografts.Cell stem cell.2014；14:121-130)所述通過(guò)E.coli菌株SW102感受態(tài)細(xì)胞同源重組而成。

pCAG/CTLA4-Ig/IRES/PD-L1/IRES/TK/polyA基因表達(dá)框敲入HPRT1基因終止子下游約600bp處。兩端具有Loxp位點(diǎn)的抗性篩選基因表達(dá)框。

該修復(fù)模板DNA載體5’端至3’端依次包括有約124kb的HPRT1基因上游同源臂、LoxP位點(diǎn)、CAG啟動(dòng)子、抗性篩選基因Puro/IRES/Neo、LoxP位點(diǎn)、CAG啟動(dòng)子、目標(biāo)基因CTLA4-Ig/IRES/PD-L1/IRES/TK、polyA多聚腺苷酸和約69kb的HPRT1基因下游同源臂。

所述HPRT1基因上游同源臂的序列構(gòu)成為：NCBI的序列編號(hào)為NC_000023.11從134376991至134500246的堿基序列(Homo sapiens chromosome X,GRCh38.p7 Primary Assembly.NCBI Reference Sequence:NC_000023.11from base 134376991 to 134500246)。

LoxP位點(diǎn)的堿基序列組成為:ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT(SEQ ID NO.1)

CAG啟動(dòng)子堿基序列組成為：

TCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATT(SEQ ID NO.2)。

抗性篩選基因Puro/IRES/Neo堿基序列組成為:

ATGGGATCGGCCATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGATGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGGGGATCAATTCAATTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGA(SEQ ID NO.3)

目標(biāo)基因CTLA4-Ig/IRES/PD-L1/IRES/TK堿基序列組成為：

ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTACTGGCCAGCAGCCGAGGCATCGCCAGCTTTGTGTGTGAGTATGCATCTCCAGGCAAAGCCACTGAGGTCCGGGTGACAGTGCTTCGGCAGGCTGACAGCCAGGTGACTGAAGTCTGTGCGGCAACCTACATGATGGGGAATGAGTTGACCTTCCTAGATGATTCCATCTGCACGGGCACCTCCAGTGGAAATCAAGTGAACCTCACTATCCAAGGACTGAGGGCCATGGACACGGGACTCTACATCTGCAAGGTGGAGCTCATGTACCCACCGCCATACTACCTGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTAATTGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGATCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGAATTGAATTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCGGATCTTCCAGAAAGATGAGGATATTTGCTGTCTTTATATTCATGACCTACTGGCATTTGCTGAACGCATTTACTGTCACGGTTCCCAAGGACCTATATGTGGTAGAGTATGGTAGCAATATGACAATTGAATGCAAATTCCCAGTAGAAAAACAATTAGACCTGGCTGCACTAATTGTCTATTGGGAAATGGAGGATAAGAACATTATTCAATTTGTGCATGGAGAGGAAGACCTGAAGGTTCAGCATAGTAGCTACAGACAGAGGGCCCGGCTGTTGAAGGACCAGCTCTCCCTGGGAAATGCTGCACTTCAGATCACAGATGTGAAATTGCAGGATGCAGGGGTGTACCGCTGCATGATCAGCTATGGTGGTGCCGACTACAAGCGAATTACTGTGAAAGTCAATGCCCCATACAACAAAATCAACCAAAGAATTTTGGTTGTGGATCCAGTCACCTCTGAACATGAACTGACATGTCAGGCTGAGGGCTACCCCAAGGCCGAAGTCATCTGGACAAGCAGTGACCATCAAGTCCTGAGTGGTAAGACCACCACCACCAATTCCAAGAGAGAGGAGAAGCTTTTCAATGTGACCAGCACACTGAGAATCAACACAACAACTAATGAGATTTTCTACTGCACTTTTAGGAGATTAGATCCTGAGGAAAACCATACAGCTGAATTGGTCATCCCAGAACTACCTCTGGCACATCCTCCAAATGAAAGGACTCACTTGGTAATTCTGGGAGCCATCTTATTATGCCTTGGTGTAGCACTGACATTCATCTTCCGTTTAAGAAAAGGGAGAATGATGGATGTGAAAAAATGTGGCATCCAAGATACAAACTCAAAGAAGCAAAGTGATACACATTTGGAGGAGACGTAATCCGAATTCCGCTAGCAATTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCAAACTAGTATGGCTTCGTACCCCGGCCATCAACACGCGTCTGCGTTCGACCAGGCTGCGCGTTCTCGCGGCCATAGCAACCGACGTACGGCGTTGCGCCCTCGCCGGCAGCAAGAAGCCACGGAAGTCCGCCCGGAGCAGAAAATGCCCACGCTACTGCGGGTTTATATAGACGGTCCCCACGGGATGGGGAAAACCACCACCACGCAACTGCTGGTGGCCCTGGGTTCGCGCGACGATATCGTCTACGTACCCGAGCCGATGACTTACTGGCGGGTGCTGGGGGCTTCCGAGACAATCGCGAACATCTACACCACACAACACCGCCTCGACCAGGGTGAGATATCGGCCGGGGACGCGGCGGTGGTAATGACAAGCGCCCAGATAACAATGGGCATGCCTTATGCCGTGACCGACGCCGTTCTGGCTCCTCATATCGGGGGGGAGGCTGGGAGCTCACATGCCCCGCCCCCGGCCCTCACCCTCATCTTCGACCGCCATCCCATCGCCGCCCTCCTGTGCTACCCGGCCGCGCGGTACCTTATGGGCAGCATGACCCCCCAGGCCGTGCTGGCGTTCGTGGCCCTCATCCCGCCGACCTTGCCCGGCACCAACATCGTGCTTGGGGCCCTTCCGGAGGACAGACACATCGACCGCCTGGCCAAACGCCAGCGCCCCGGCGAGCGGCTGGACCTGGCTATGCTGGCTGCGATTCGCCGCGTTTACGGGCTACTTGCCAATACGGTGCGGTATCTGCAGTGCGGCGGGTCGTGGCGGGAGGACTGGGGACAGCTTTCGGGGACGGCCGTGCCGCCCCAGGGTGCCGAGCCCCAGAGCAACGCGGGCCCACGACCCCATATCGGGGACACGTTATTTACCCTGTTTCGGGCCCCCGAGTTGCTGGCCCCCAACGGCGACCTGTATAACGTGTTTGCCTGGGCCTTGGACGTCTTGGCCAAACGCCTCCGTTCCATGCACGTCTTTATCCTGGATTACGACCAATCGCCCGCCGGCTGCCGGGACGCCCTGCTGCAACTTACCTCCGGGATGGTCCAGACCCACGTCACCACCCCCGGCTCCATACCGACGATATGCGACCTGGCGCGCACGTTTGCCCGGGAGATGGGGGAGGCTAACTGA(SEQ ID NO.4)

polyA多聚腺苷酸堿基序列組成為：

CTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGACTAGAGCTTGCGGAACCCTTC(SEQ ID NO.5)

和HPRT1基因下游同源臂堿基序列組成為：NCBI Reference Sequence:NC_000023.11中的由134500874至134571880的序列(Homo sapiens chromosome X,GRCh38.p7 Primary Assembly.NCBI Reference Sequence:NC_000023.11 from base 134500874 to 134571880)。

在上述各段序列的基礎(chǔ)上，可以有一個(gè)或多個(gè)堿基的被取代，但是活性不變，這樣的每段序列也適合本發(fā)明的hESCs-TK細(xì)胞系構(gòu)建。

參見(jiàn)圖1B.同源重組后等位基因的構(gòu)型，其中黑框代表HPRT1的外顯子編碼區(qū)，白框代表HPRT1的3‘非翻譯區(qū)。黑色三角箭頭代表PCR鑒定的引物位置。虛線箭頭標(biāo)識(shí)范圍分別是上下游同源臂，其中上游同源臂為124kb，下游同源臂為71kb。

pCAG/Neo/IRES/Puro/polyA敲入HPRT1基因的3’非翻譯區(qū)開(kāi)端，該基因表達(dá)框能破壞HPRT1基因的功能，細(xì)胞從而對(duì)硫代鳥(niǎo)嘌呤敏感。因此我們可以使用嘌呤霉素和硫代鳥(niǎo)嘌呤(6-TG)對(duì)正確敲入基因的陽(yáng)性克隆進(jìn)行雙重篩選，在轉(zhuǎn)染pCAG/Cre/polyA后，Cre酶介導(dǎo)的Loxp同源重組能刪除抗性篩選基因表達(dá)框，從而使細(xì)胞恢復(fù)正常的HPRT1功能。

1.3hESCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選

應(yīng)用Ⅱ型基因脈沖細(xì)胞電穿孔儀轉(zhuǎn)染線性化的靶向Bac載體進(jìn)入hESCs細(xì)胞。電轉(zhuǎn)染的具體參數(shù)為：0.4cm電擊杯，320volt，200μF，細(xì)胞數(shù)量為2X10⁷，Bac載體質(zhì)量為30μg，重懸于750μl的PBS中進(jìn)行電轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后加入含有DR4小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層和培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中令細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)48小時(shí)，隨后加入含有嘌呤霉素濃度為0.5μg/ml的培養(yǎng)液培養(yǎng)3天。待細(xì)胞長(zhǎng)至顯微鏡下可見(jiàn)單克隆時(shí)，加入含有1mM硫代鳥(niǎo)嘌呤的培養(yǎng)液進(jìn)行二次篩選三天，然后分離出存活的單克隆，接種至96孔板，得到CPTK-hESCs細(xì)胞。

實(shí)施例2：CPTK-hESCs細(xì)胞的鑒定

2.1PCR檢測(cè)

應(yīng)用PCR技術(shù)鑒定同源重組后的基因敲入細(xì)胞系CPTK-hESCs。如圖1A和C所示，正向引物p1(5’-AATGTCAGTTGCTGCATTCC-3’)和反向引物p2(5’-CTGCTGACAAAGATTCACTGG-3’)、p5(5’-GAAAGTCCCTATTGGCGTTAC-3’)，野生型的等位基因由p1和p2擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為404bp的野生型條帶；Bac同源重組后、Loxp-Cre同源重組前，由p1和p5擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為311bp的條帶；Bac同源重組后、Loxp-Cre同源重組后，由p1和p5擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為503的條帶。正向引物p3和反向引物p4、p5，野生型的等位基因由p3(5’-CTGTTGGTTCCATTTTCCTTG-3’)和p4(5’-GGCTCCTAAGTTTGATAGTTC-3’)擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為406bp的條帶；Bac同源重組后，由p3和p5擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為277bp的條帶。參見(jiàn)圖1C。

2.2藥物敏感實(shí)驗(yàn)

相應(yīng)的hESCs接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24小時(shí)后，把培養(yǎng)液分別替換為：1、正常hESCs細(xì)胞培養(yǎng)液；2、含有100μM hypoxanthine/0.4μM amimopterin/6μM thymidine(HAT)的hESCs培養(yǎng)液；3、含有1mM 6-TG的hESCs培養(yǎng)液。培養(yǎng)3天后根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行了Alkaline phosphatase檢測(cè)。

野生型的細(xì)胞HPRT基因的功能正常，Bac同源重組后、由于篩選抗性基因框的插入，導(dǎo)致了HPRT基因失去了功能，而Loxp-Cre同源重組后把篩選抗性基因框刪去，細(xì)胞重新獲得了HPRT的功能。HPRT功能的缺失導(dǎo)致了細(xì)胞對(duì)6-TG的不敏感、而HPRT功能正常的細(xì)胞對(duì)HAT敏感。圖1D驗(yàn)證了細(xì)胞HPRT的功能存在與否。野生型(WT)hESCs細(xì)胞對(duì)6TG敏感、對(duì)HAT不敏感表示HPRT基因功能正常；Loxp-Cre同源重組前(Cre-)細(xì)胞對(duì)6TG不敏感、對(duì)HAT敏感表示HPRT功能缺失；Loxp-Cre同源重組后(Cre+)細(xì)胞對(duì)6TG敏感、對(duì)HAT不敏感表示細(xì)胞重新獲得HPRT功能。

2.3Western Blotting實(shí)驗(yàn)

相應(yīng)的hESCs培養(yǎng)密度長(zhǎng)至90％以上，把培養(yǎng)液替換為基礎(chǔ)的DMEM培養(yǎng)液。24小時(shí)后，各取出兩等份約1ml的培養(yǎng)液，加入1X的上樣緩沖液煮沸，其中一份加β-mercaptoethanol，按照常規(guī)的Western blotting進(jìn)行電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜，用HRP-conjugated goat anti-human immunoglobulin G-Fc抗體進(jìn)行孵育并顯色。結(jié)果如圖1E所示，CPTK-hESCs在蛋白水平上表達(dá)了CLTA4-Ig，同時(shí)野生型hECCs不表達(dá)CLTA4-Ig。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-L1及hESCs表面標(biāo)記物

應(yīng)用BD LSR-II流式細(xì)胞儀對(duì)CPTK-hESCs細(xì)胞進(jìn)行表面人類PD-L、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60和TRA1-81蛋白的表達(dá)分析。數(shù)據(jù)通過(guò)FACS Diva(Becton Dickinson公司)和FlowJo軟件進(jìn)一步分析。1x10⁶細(xì)胞使用PBS洗滌，室溫下，使用DAPI，PE anti-PD-L1、PE anti-SSEA-3、PE anti-SSEA-4、PE anti-TRA1-60、PE anti-TRA1-81染色45分鐘。染色后將細(xì)胞用PBS洗滌兩次，并重新懸浮于FACS緩沖液，然后上機(jī)分析。圖1F和圖2A結(jié)果表明CPTK-hESCs表面高表達(dá)PD-L1蛋白及SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81這些人胚胎干細(xì)胞的表明標(biāo)記物蛋白。

2.5畸胎瘤實(shí)驗(yàn)

CPTK-hESCs培養(yǎng)密度至90％以上，TrypLE消化細(xì)胞，PBS重懸并洗滌一遍，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選取2X10⁶細(xì)胞/注射。在一個(gè)注射中，用100ul PBS重懸細(xì)胞后加入50ul Matrigel(BD公司)，皮下注射至NSG小鼠。等待約4-6周后，畸胎瘤長(zhǎng)至1-2cm直徑時(shí)收取畸胎瘤進(jìn)行常規(guī)的H&E染色分析。圖2C可見(jiàn)畸胎瘤具有三個(gè)胚層的細(xì)胞類型。

2.6qPCR檢測(cè)CPTK-hESCs的全能性

CPTK-hESCs和野生型hESCs培養(yǎng)密度至90％以上，收取細(xì)胞，根據(jù)試劑生產(chǎn)商的說(shuō)明提取RNA并進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行qPCR檢測(cè)相關(guān)人胚胎干細(xì)胞全能性基因表達(dá)量，結(jié)果如圖2B所示。CPTK-hESCs具有全能性基因表達(dá)。

2.7TK表達(dá)檢測(cè)

CPTK-hESCs和野生型hESCs長(zhǎng)至密度約60％時(shí)加入不同濃度的GCV(0nM、10nM、20nM、40nM、80nM和160nM)培養(yǎng)三天，隨后根據(jù)試劑商說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞用4％多聚甲醛PBS溶液進(jìn)行固定，然后用結(jié)晶紫染色，結(jié)果如圖2D所示，CPTK-hESCs對(duì)GCV的敏感性呈濃度梯度依賴性。

CPTK-hESCs和野生型hESCs傳代至24孔板，第3天后開(kāi)始加入終濃度為160nM的GCV培養(yǎng)4天，前7天中每天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，另外第14天和21天再次進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖2E，CPTK-hESCs能被GCV徹底消除。

實(shí)施例3：CPTK-hESCs的體內(nèi)功能檢測(cè)

3.1CPTK-hESCs在人源化小鼠體內(nèi)的免疫耐受實(shí)驗(yàn)

CPTK-hESCs和野生型hESCs培養(yǎng)密度至90％以上，TrypLE消化細(xì)胞，PBS重懸并洗滌一遍，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選取一定數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行皮下注射，其中NSG小鼠每個(gè)注射的細(xì)胞數(shù)為2X10⁶，人源化小鼠每個(gè)注射的細(xì)胞數(shù)為4X10⁶。在一個(gè)注射中，用100ul PBS重懸細(xì)胞后加入50ul Matrigel(BD公司)，隨后進(jìn)行皮下注射。等待約4-6周后，畸胎瘤長(zhǎng)至1-2cm直徑時(shí)收取畸胎瘤進(jìn)行拍照、流式細(xì)胞術(shù)分析、免疫熒光染色分析、H&E染色分析及統(tǒng)計(jì)畸胎瘤被排斥的比例。結(jié)果如圖3(包括圖3A、B、C、D、E)所示?？梢钥闯鲈跓o(wú)免疫力的NSG小鼠中CPTK-hESCs和野生型hESCs均能形成無(wú)差別的畸胎瘤，而在具有人類免疫系統(tǒng)的人源化小鼠中，野生型hESCs畸胎瘤被明顯排斥，可見(jiàn)大量CD3陽(yáng)性細(xì)胞的存在，具有T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的特征；CPTK-hESCs畸胎瘤沒(méi)有被排斥的跡象。H&E染色也進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)論。

3.2GCV體內(nèi)消除CPTK-hESCs畸胎瘤的功能驗(yàn)證

CPTK-hESCs和野生型hESCs培養(yǎng)密度至90％以上，TrypLE消化細(xì)胞，PBS重懸并洗滌一遍，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選取一定數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行皮下注射，其中NSG小鼠每個(gè)注射的細(xì)胞數(shù)為2X10⁶，人源化小鼠每個(gè)注射的細(xì)胞數(shù)為4X10⁶。在一個(gè)注射中，用100ul PBS重懸細(xì)胞后加入50ul Matrigel(BD公司)，隨后進(jìn)行皮下注射。3周后，半數(shù)的小鼠進(jìn)行每天1次的劑量為30mg/kg的GCV腹腔注射，注射持續(xù)3周，每天進(jìn)行拍照記錄畸胎瘤大小。隨后，收取畸胎瘤進(jìn)行免疫熒光染色分析。圖4A與野生型畸胎瘤相比較，可見(jiàn)CPTK畸胎瘤隨時(shí)間變化而縮小，最后解剖時(shí)CPTK-hESCs畸胎瘤體積極小，為了驗(yàn)證殘留部位是否來(lái)源于CPTK-hESCs，我們進(jìn)行了免疫熒光染色分析，使用人類特異性抗體anti-human nuclei antibody進(jìn)行染色，參見(jiàn)圖4B,結(jié)果顯示殘留的組織不來(lái)源于CPTK-hESCs，分析可能是畸胎瘤生成過(guò)程中小鼠體內(nèi)成纖維細(xì)胞的遷移形成的。圖4C對(duì)重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。

3.3GCV體內(nèi)消除CPTK-hESCs分化的心肌細(xì)胞的功能驗(yàn)證

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[Lian X,Hsiao C,Wilson G et al.Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America.2012；109:E1848-1857]方法進(jìn)行心肌細(xì)胞的分化.CPTK-hESCs和野生型hESCs培養(yǎng)于覆蓋了Matrigel的6孔板之中至密度約100％，此后開(kāi)始分化，第1天加入含有12μMCHIR99021的RPMI1640/B27(不含胰島素)培養(yǎng)24小時(shí)，然后撤去CHIR99021。第3天加入含有5μM IWP4的RPMI1640/B27(不含胰島素)培養(yǎng)48小時(shí)，然后撤去IWP4。第7天把培養(yǎng)液換為RPMI1640/B27(含胰島素)。培養(yǎng)直至細(xì)胞開(kāi)始跳動(dòng)，隔天換液。

對(duì)分化的心肌細(xì)胞進(jìn)行qPCR檢測(cè)其心肌細(xì)胞基因表達(dá)量、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表明心肌細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。結(jié)果如圖5A、B所示，分化的細(xì)胞具有心肌細(xì)胞的特征。隨后收取細(xì)胞，取6X10⁶細(xì)胞進(jìn)行肌肉注射，用50μl的PBS重懸細(xì)胞，加入50μl的Matrigel混勻，注射入小鼠后腿肌肉。次日開(kāi)始半數(shù)的小鼠進(jìn)行每天1次的劑量為30mg/kg的GCV腹腔注射，注射持續(xù)2周，然后收取肌肉組織進(jìn)行免疫熒光染色分析。結(jié)果如圖5C所示，GCV能有效消除CPTK-hESCs分化而成的心肌細(xì)胞，同時(shí)CPTK-hESCs分化而成的心肌細(xì)胞能在人源化小鼠體內(nèi)耐受免疫系統(tǒng)的攻擊。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說(shuō)明書(shū)記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東圣賽生物科技有限公司

南方醫(yī)科大學(xué)

<120> hESCs-TK細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 34

<210> 2

<211> 1722

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 60

cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 120

caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 180

gactttccat tgacgtcaat gggtggacta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 240

tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 300

ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 360

attagtcatc gctattacca tgggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 420

tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 480

cgatgggggc gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg 540

ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt 600

ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg 660

ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg ccgcccgccc 720

cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg 780

ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc 840

cttaaagggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt 900

gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc 960

gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1020

gtgccccgcg gtgcgggggg gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg gtgtgtgcgt 1080

gggggggtga gcagggggtg tgggcgcggc ggtcgggctg taaccccccc ctgcaccccc 1140

ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtgcg gggcgtggcg 1200

cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1260

cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg ccccggagcg ccggcggctg 1320

tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa tcgtgcgaga gggcgcaggg 1380

acttcctttg tcccaaatct ggcggagccg aaatctggga ggcgccgccg caccccctct 1440

agcgggcgcg ggcgaagcgg tgcggcgccg gcaggaagga aatgggcggg gagggccttc 1500

gtgcgtcgcc gcgccgccgt ccccttctcc atctccagcc tcggggctgc cgcaggggga 1560

cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg 1620

ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa 1680

cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa tt 1722

<210> 3

<211> 2009

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgggatcgg ccattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag 60

aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc 120

cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg 180

aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc 240

gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg 300

ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct 360

gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg 420

aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat 480

ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc 540

atgcccgacg gcgatgatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg 600

gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc 660

tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct 720

gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat 780

cgccttcttg acgagttctt ctgaggggat caattcaatt ccgcccctct ccctcccccc 840

cccctaacgt tactggccga agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt 900

tattttccac catattgccg tcttttggca atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct 960

tcttgacgag cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga 1020

atgtcgtgaa ggaagcagtt cctctggaag cttcttgaag acaaacaacg tctgtagcga 1080

ccctttgcag gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac 1140

gtgtataaga tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg agttggatag 1200

ttgtggaaag agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc 1260

agaaggtacc ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg 1320

tttagtcgag gttaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg 1380

aaaaacacga tgataatatg gccacaacca tgaccgagta caagcccacg gtgcgcctcg 1440

ccacccgcga cgacgtcccc agggccgtac gcaccctcgc cgccgcgttc gccgactacc 1500

ccgccacgcg ccacaccgtc gatccggacc gccacatcga gcgggtcacc gagctgcaag 1560

aactcttcct cacgcgcgtc gggctcgaca tcggcaaggt gtgggtcgcg gacgacggcg 1620

ccgcggtggc ggtctggacc acgccggaga gcgtcgaagc gggggcggtg ttcgccgaga 1680

tcggcccgcg catggccgag ttgagcggtt cccggctggc cgcgcagcaa cagatggaag 1740

gcctcctggc gccgcaccgg cccaaggagc ccgcgtggtt cctggccacc gtcggcgtct 1800

cgcccgacca ccagggcaag ggtctgggca gcgccgtcgt gctccccgga gtggaggcgg 1860

ccgagcgcgc cggggtgccc gccttcctgg agacctccgc gccccgcaac ctccccttct 1920

acgagcggct cggcttcacc gtcaccgccg acgtcgaggt gcccgaagga ccgcgcacct 1980

ggtgcatgac ccgcaagccc ggtgcctga 2009

<210> 4

<211> 4387

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgggggtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60

agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120

ggcatcgcca gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 180

acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240

gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300

gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360

gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420

attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480

acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540

ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600

gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660

cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720

gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780

aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840

gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900

ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960

gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020

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tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140

ccgggtaaat gagaattgaa ttccgcccct ctccctcccc cccccctaac gttactggcc 1200

gaagccgctt ggaataaggc cggtgtgcgt ttgtctatat gttattttcc accatattgc 1260

cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg agcattccta 1320

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ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc gaccctttgc aggcagcgga 1440

accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc acgtgtataa gatacacctg 1500

caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa agagtcaaat 1560

ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc ccagaaggta ccccattgta 1620

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atggtagcaa tatgacaatt gaatgcaaat tcccagtaga aaaacaatta gacctggctg 1920

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accgctgcat gatcagctat ggtggtgccg actacaagcg aattactgtg aaagtcaatg 2160

ccccatacaa caaaatcaac caaagaattt tggttgtgga tccagtcacc tctgaacatg 2220

aactgacatg tcaggctgag ggctacccca aggccgaagt catctggaca agcagtgacc 2280

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atgtgaccag cacactgaga atcaacacaa caactaatga gattttctac tgcactttta 2400

ggagattaga tcctgaggaa aaccatacag ctgaattggt catcccagaa ctacctctgg 2460

cacatcctcc aaatgaaagg actcacttgg taattctggg agccatctta ttatgccttg 2520

gtgtagcact gacattcatc ttccgtttaa gaaaagggag aatgatggat gtgaaaaaat 2580

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gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaacg 3180

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gcgggaggac tggggacagc tttcggggac ggccgtgccg ccccagggtg ccgagcccca 4080

gagcaacgcg ggcccacgac cccatatcgg ggacacgtta tttaccctgt ttcgggcccc 4140

cgagttgctg gcccccaacg gcgacctgta taacgtgttt gcctgggcct tggacgtctt 4200

ggccaaacgc ctccgttcca tgcacgtctt tatcctggat tacgaccaat cgcccgccgg 4260

ctgccgggac gccctgctgc aacttacctc cgggatggtc cagacccacg tcaccacccc 4320

cggctccata ccgacgatat gcgacctggc gcgcacgttt gcccgggaga tgggggaggc 4380

taactga 4387

<210> 5

<211> 303

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc 60

cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa 120

atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg 180

ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg 240

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ttc 303