本發(fā)明涉及生物醫(yī)療領(lǐng)域，具體而言，涉及一種多肽探針、包含該探針的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程，對(duì)多細(xì)胞生物個(gè)體的發(fā)育、正常細(xì)胞更新、組織保持正常結(jié)構(gòu)與功能有著積極而重要的意義，異常細(xì)胞凋亡則會(huì)導(dǎo)致腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等疾病的發(fā)生。細(xì)胞凋亡的實(shí)施是由一系列半胱氨酸蛋白酶所引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的(Cold Spring Harb.Perspect.Biol.,2013,5(4):a008656)，在半胱氨酸蛋白酶家族中，半胱氨酸蛋白酶-3屬于效應(yīng)型凋亡酶，激活的半胱氨酸蛋白酶-3可降解一系列底物，包括凋亡抑制物、細(xì)胞外基質(zhì)與骨架蛋白以及DNA修復(fù)相關(guān)因子，使細(xì)胞生化以及形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡(Oncogene,2008,27(48):6194-6206)。半胱氨酸蛋白酶-3是細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵蛋白酶，因此可以通過測定半胱氨酸蛋白酶-3的活性來測定細(xì)胞凋亡過程。

雙砷染料-四半胱氨酸標(biāo)簽體系是一種具有廣闊應(yīng)用前景的活細(xì)胞蛋白熒光標(biāo)記方法(Science,1998,281(5374):269-272)。在該系統(tǒng)中，四半胱氨酸標(biāo)簽是一個(gè)包含四個(gè)半胱氨酸殘基的六肽或十二肽(Nat.biotechnol.,2005,23(10):1308-1314)，半胱氨酸殘基兩兩結(jié)合在一起，形成半胱氨酸-半胱氨酸二聯(lián)子，這兩個(gè)二聯(lián)子被脯氨酸-甘氨酸二聯(lián)子分隔開來。四半胱氨酸標(biāo)簽對(duì)雙砷染料具有較高的特異性和親和力。雙砷染料在被1,2-乙二硫醇螯合的情況下不發(fā)熒光，但是一旦與四半胱氨酸標(biāo)簽結(jié)合就會(huì)發(fā)出很強(qiáng)的熒光。除了以線性方式存在外，四半胱氨酸標(biāo)簽中的兩個(gè)半胱氨酸-半胱氨酸二聯(lián)子還可以被分離開來，但是它們?cè)诳臻g上必須相臨近(Nat.Chem.Biol.,2007,3(12):779-784)。在該標(biāo)記系統(tǒng)中，四半胱氨酸標(biāo)簽的空間構(gòu)象會(huì)對(duì)所形成雙砷染料-四半胱氨酸標(biāo)簽復(fù)合物的穩(wěn)定性和量子產(chǎn)率產(chǎn)生極大的影響(J.Am.Chem.Soc.,2002,124(21):6063-6076)。

半胱氨酸蛋白酶-3通常以無活性的酶原存在細(xì)胞中，需要被上游的激活型凋亡酶切割而得以活化。激活的半胱氨酸蛋白酶-3可以特異性切割天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸四肽序列，根據(jù)這一特性，一系列基于天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸的探針被開發(fā)出來用于測定半胱氨酸蛋白酶-3的活性，對(duì)應(yīng)的方法有熒光檢測法、電化學(xué)法、比色法、表面等離子體共振法、生物發(fā)光法、電致化學(xué)發(fā)光法。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，一些基于納米材料的多肽探針如量子點(diǎn)復(fù)合多肽探針、納米金復(fù)合多肽探針、石墨烯復(fù)合多肽探針也被開發(fā)出來用于測定半胱氨酸蛋白酶-3的活性(Chem.rev.,2015,115(22):12546-12629)。此外，一些基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)的蛋白探針以及熒光開關(guān)(Nat.Commun.,2013；，4:2157)也被開發(fā)出來用于測定細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶-3的活性。在這些方法中，熒光標(biāo)記會(huì)在一定程度上降低半胱氨酸蛋白酶-3對(duì)底物的切割效率，制備納米傳感器則使得檢測過程變得復(fù)雜和低效。因此迫切需要發(fā)展簡單、靈敏、高效的方法來測定細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶-3活性從而來檢測細(xì)胞凋亡過程。此外，本領(lǐng)域在檢測其它酶的活性時(shí)也或多或少的存在上述問題，且缺乏一種高效的可針對(duì)各種酶的活性進(jìn)行檢測的技術(shù)。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在本發(fā)明中，我們充分利用雙砷染料-四半胱氨酸標(biāo)簽復(fù)合物的穩(wěn)定性和量子產(chǎn)率極度依賴于四半胱氨酸標(biāo)簽空間構(gòu)象這一特性，設(shè)計(jì)了一種新型無標(biāo)記多肽分子探針，進(jìn)而發(fā)展了一種簡單、靈敏測定酶活性的方法。

在描述本發(fā)明的化合物、組合物、蛋白質(zhì)、肽等以及方法之前，應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施方式不限于所描述的特定方法、方案以及試劑，這是因?yàn)樗鼈兛梢宰兓?。還應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的術(shù)語僅用于描述特定實(shí)施方式目的，并且不旨在限制本實(shí)施方式或權(quán)利要求的范圍。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種多肽探針，所述多肽探針選自下列物質(zhì)及其二聚體的組合物：

X¹-Y¹-CC；

其中，X¹為具有二聚化能力的多肽；

Y¹選自待檢測酶的酶切位點(diǎn)序列。

其中，X¹段形成的二聚體可自發(fā)形成，也可在其它輔助蛋白或輔助條件下形成(例如X¹段某些氨基酸殘基被修飾或肽段處于疏水環(huán)境中)，優(yōu)選的，所述二聚體為自發(fā)形成。

該探針包含有至少三個(gè)不同的功能區(qū)域，CC即兩個(gè)半胱氨酸，是與雙砷染料結(jié)合的部位，用來讀取待檢測酶的活性。在沒有被待檢測酶切割的時(shí)候，多肽探針之間的(自發(fā))二聚化會(huì)使得兩個(gè)半胱氨酸-半胱氨酸二聯(lián)子在空間上相互接近，從而能與雙砷染料結(jié)合發(fā)出較強(qiáng)的熒光；相反，待檢測酶的酶解作用會(huì)將半胱氨酸-半胱氨酸二聯(lián)子從多肽中解離下來，雖然被切割的多肽依然能夠二聚，但卻缺少了錨定雙砷染料的部位，雙砷染料因而不能發(fā)光。因此，通過測定切割前后熒光的變化，可以定量測定待檢測酶的活性。

通過更改Y¹段多肽的序列，理論上本發(fā)明提供的探針可對(duì)所有具有切割肽段能力的酶的活性進(jìn)行檢測。

優(yōu)選的，如上所述的多肽探針，所述X¹的全部或部分氨基酸序列選自D構(gòu)型氨基酸。

由于在生物進(jìn)化過程中，氨基酸自然選擇為L型，生物體內(nèi)的酶無法識(shí)別并切割D構(gòu)型氨基酸。此設(shè)計(jì)可防止X¹區(qū)段被其它蛋白酶非特異性切割，也能有效延長本發(fā)明提供的多肽探針的半衰期。

X¹區(qū)段中D構(gòu)型和L構(gòu)型的氨基酸可交叉排列，例如一個(gè)D構(gòu)型一個(gè)L構(gòu)型交替相接，也可以起到上述作用；最優(yōu)選的，X¹的氨基酸序列全部選自D構(gòu)型氨基酸。

優(yōu)選的，如上所述的多肽探針，所述X¹為亮氨酸拉鏈，或包含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的多肽。

亮氨酸拉鏈?zhǔn)且环N作為二聚體化結(jié)構(gòu)域的超二級(jí)結(jié)構(gòu)，且使相互平行的α-螺旋之間產(chǎn)生粘附力。一個(gè)亮氨酸拉鏈包含了多個(gè)亮氨酸殘基，通常每七個(gè)氨基酸殘基就出現(xiàn)一次，這形成了一條兩性的α-螺旋，疏水區(qū)只在其中一側(cè)。這個(gè)疏水區(qū)提供了二聚化的區(qū)域，使得基序可以像“拉鏈”一樣拉起來。

除此之外，根據(jù)本發(fā)明提供的技術(shù)內(nèi)容的啟示，X¹段多肽可根據(jù)生物中常見的蛋白二聚體中負(fù)責(zé)二聚化的蛋白區(qū)段進(jìn)行設(shè)計(jì)，例如受體酪氨酸激酶、某些核受體蛋白、14-3-3蛋白、驅(qū)動(dòng)蛋白、Factor XI、Factor XIII、Toll樣受體、纖維原蛋白、G蛋白的βγ亞基二聚體等等，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是容易的。亮氨酸拉鏈僅作為最優(yōu)選的技術(shù)方案。

優(yōu)選的，X¹段多肽可選自下述氨基酸序列：

QLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVG；

KLEALEGKLEAEGKGKLEAUGICLEALE；

GEIAALKQEIAALKKENAALKWEIAALKQGYY；

ASIARLEEKVKTLKAQNYELASTANMLREQVAQLGAP；

ASAAELEERVKTLKAEIYELQSEANMLREQIAQLGAP；

ASAAELEERVKTLKAEIYELQSEANMLREQGAP；

ASAAELEERVKTLKAEIYELQSEGAP；

ESKVSSLESKVSSLESKVSSLESKVSSLESKVSSLESKVSS。

更優(yōu)選的，上述氨基酸序列均為D構(gòu)型氨基酸。

優(yōu)選的，如上所述的多肽探針，所述多肽探針的N端進(jìn)行了乙酰化修飾；

和/或；

所述多肽探針的C端進(jìn)行了酰胺化修飾。

多肽探針兩端的修飾可起到增加探針的穩(wěn)定性的作用。

優(yōu)選的，如上所述的多肽探針，所述X¹與所述Y¹之間還包括Linker1和/或所述Y¹與所述CC之間還包括Linker2；

優(yōu)選的，所述Linker1的氨基酸數(shù)目為1～30個(gè)，更優(yōu)選為1～5個(gè)；

優(yōu)選的，所述Linker2的氨基酸數(shù)目為1～30個(gè)，更優(yōu)選為1～5個(gè)。

Linker1及Linker2的氨基酸數(shù)量可以是1，2，3，4，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)。

Linker1及Linker2的序列也可以選自(GGGGS)n、(GGGS)n、(GGS)n或Gn，其中n可以是1，2，3，4，5或6。

優(yōu)選的，如上所述的多肽探針，所述Y¹的序列為DEVD。

DEVD為半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase3)及半胱氨酸蛋白酶-7(Caspase7)的酶切位點(diǎn)。

優(yōu)選的，如上所述的多肽探針，所述X¹的氨基酸序列為D構(gòu)型的asaaeleervktlkaeiyelrskanmlreqiaqlgap。

此序列為D構(gòu)型的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選的，如上所述的多肽探針，所述Linker2的氨基酸序列為G。

一種多肽探針，用于檢測Caspase3或Caspase7的酶活性，其序列為asaaeleervktlkaeiyelrskanmlreqiaqlgapDEVDGCC；其中asaaeleervktlkaeiyelrskanmlreqiaqlgap為D構(gòu)型的氨基酸。

優(yōu)選的，asaaeleervktlkaeiyelrskanmlreqiaqlgapDEVDGCC的N端和C端分別進(jìn)行了乙?；王０坊揎棥?/p>

一種診斷試劑盒，其包括如上所述的多肽探針、雙砷染料、待檢測酶切割所述多肽探針得到酶切產(chǎn)物時(shí)所用的緩沖液1以及所述雙砷染料對(duì)所述酶切產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記時(shí)所用的緩沖液2；

優(yōu)選的，所述緩沖液1為含有用于避免二硫鍵出現(xiàn)的還原劑，更優(yōu)選的，所述還原劑選自二硫蘇糖醇和/或三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽；

優(yōu)選的，所述緩沖液2為含有用于避免單個(gè)所述CC片段與所述雙砷染料的結(jié)合的洗脫劑，更優(yōu)選的，所述洗脫劑選自2,3-二巰基-1-丙醇和/或1,2-乙二硫醇。

優(yōu)選的，如上所述的診斷試劑盒，所述雙砷染料選自ReAsH-EDT₂、FlAsH-EDT₂、F2FlAsH或F4FlAsH中的一種或多種。

優(yōu)選的，如上所述的診斷試劑盒，當(dāng)所述還原劑選自二硫蘇糖醇時(shí)，所述還原劑的濃度為0.5～2mM。

優(yōu)選的，如上所述的診斷試劑盒，當(dāng)所述洗脫劑選自2,3-二巰基-1-丙醇時(shí)，所述洗脫劑的濃度為0.03～0.10mM。

如上所述的多肽探針或如上所述的診斷試劑盒在檢測Y¹所對(duì)應(yīng)的酶的活性中的應(yīng)用；

優(yōu)選的，所述檢測在細(xì)胞裂解液中或在體細(xì)胞中進(jìn)行；

更優(yōu)選的，所述細(xì)胞選自HeLa細(xì)胞、NIH/3T3細(xì)胞、C6細(xì)胞、MCF7細(xì)胞、人HCE細(xì)胞、Jurkat T細(xì)胞、Huh-7細(xì)胞、DU145細(xì)胞、U-937細(xì)胞以及HepG2細(xì)胞中的任一種。

如上所述的多肽探針或如上所述診斷試劑盒在檢測單個(gè)細(xì)胞中特定酶的活性中的應(yīng)用。

如上所述的多肽探針或如上所述診斷試劑盒在檢測半胱氨酸蛋白酶-3和/或半胱氨酸蛋白酶-7活性中的應(yīng)用。

如上所述的多肽探針或如上所述診斷試劑盒在檢測細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述細(xì)胞凋亡可為自然發(fā)生的細(xì)胞程序性死亡、疾病造成的細(xì)胞凋亡或環(huán)境造成的細(xì)胞凋亡，例如紫外照射、雙氧水、地塞米松、腫瘤壞死因子等所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的測定。

如上所述的多肽探針或如上所述診斷試劑盒在制備和/或評(píng)價(jià)用于治療細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用；

優(yōu)選的，如上所述的應(yīng)用，所述細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病為腫瘤、自體免疫性疾病或神經(jīng)退行性疾病；

更優(yōu)選的，如上所述的應(yīng)用，所述腫瘤包括：白血病、淋巴瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、食道癌、肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、腎細(xì)胞癌和黑色素瘤；

更優(yōu)選的，如上所述的應(yīng)用，所述自體免疫性疾病包括：系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺炎；

更優(yōu)選的，如上所述的應(yīng)用，所述神經(jīng)退行性疾病包括：阿茲海默氏癥、亨丁頓舞蹈癥、帕金森病、中風(fēng)和肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥。

一種診斷細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的方法，包括：

將待診斷主體的細(xì)胞裂解液或組織裂解液與如上所述的多肽探針，或如上所述診斷試劑盒中的成分進(jìn)行接觸，根據(jù)反應(yīng)所得信號(hào)值對(duì)所述主體進(jìn)行診斷。

優(yōu)選的，如上所述的診斷細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的方法，所述信號(hào)值為所述多肽探針與雙砷染料反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)值。

優(yōu)選的，如上所述的診斷細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的方法，所述主體為動(dòng)物，更優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為靈長類動(dòng)物，更優(yōu)選為人。

優(yōu)選的，如上所述的診斷細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的方法，所述細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病為腫瘤、自體免疫性疾病或神經(jīng)退行性疾??；

更優(yōu)選的，所述腫瘤包括：白血病、淋巴瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、食道癌、肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、腎細(xì)胞癌和黑色素瘤；

更優(yōu)選的，所述自體免疫性疾病包括：系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、甲狀腺炎；

更優(yōu)選的，所述神經(jīng)退化性疾病包括：阿茲海默氏癥、亨丁頓舞蹈癥、帕金森病、中風(fēng)和肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

1)、多肽分子探針沒有任何標(biāo)記，與待檢測酶之間具有較好的生物相容性，可提高切割效率；

2)、在本發(fā)明所提供試劑盒的整個(gè)檢測反應(yīng)過程中，沒有分離和清洗步驟，操作簡單和方便；

3)、檢測模式具有靈活性，探針可以被具有不同激發(fā)和發(fā)射波長的雙砷染料所標(biāo)記，因而有多種方式來測定細(xì)胞凋亡水平；

4)、本發(fā)明特定提供的用于測定Caspase3及Caspase7的多肽探針由氨基酸構(gòu)成，將編碼多肽探針的DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，可以測定單個(gè)細(xì)胞的凋亡情況。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。

圖1為新型無標(biāo)記多肽分子探針的性能測定；(A)多肽探針與雙砷染料FlAsH-EDT₂結(jié)合所形成復(fù)合物的發(fā)射光譜；(B)多肽探針與雙砷染料FlAsH-EDT₂的結(jié)合動(dòng)力學(xué)測定；

圖2為利用新型探針定量測定體外重組半胱氨酸蛋白酶-3；(A)半胱氨酸蛋白酶-3對(duì)多肽探針的切割會(huì)降低多肽探針-雙砷染料復(fù)合物的熒光強(qiáng)度；位于上方的曲線代表的是Jun-CCC，位于下方的曲線代表的是Jun-CCC+半胱氨酸蛋白酶-3；(B)對(duì)圖A的定量分析；(C)多肽探針特異性測定半胱氨酸蛋白酶-3的活性；(D)半胱氨酸蛋白酶-3切割導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的減少(ΔF)與半胱氨酸蛋白酶-3濃度之間的關(guān)系圖；

圖3為利用新型探針測定星孢菌素誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的凋亡；(A)星孢菌素誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞凋亡的免疫印跡分析；(B)多肽探針測定星孢菌素誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的凋亡；(C)Ac-DEVD-CHO抑制細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶-3活性的免疫印跡分析；(D)Ac-DEVD-CHO抑制凋亡細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶-3活性的熒光分析。

具體實(shí)施方式

除非另有限定，本發(fā)明使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與所公開的實(shí)施方案所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。雖然與本發(fā)明所述的方法和材料類似或等同的方法和材料可用于本實(shí)施方式的實(shí)踐或測試中，但下文仍然描述了合適的方法和材料。本發(fā)明提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利以及其他參考文獻(xiàn)通過引用全部內(nèi)容結(jié)合于本文中。在沖突的情況下，本說明書(包括定義)將起支配作用。此外，材料、方法以及實(shí)施例僅僅是說明性的，而不旨在限制。實(shí)施方式的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將從以下詳細(xì)的說明書和權(quán)利要求中變得明顯。

為了促進(jìn)理解本文描述的實(shí)施方式這一目的，將參考某些實(shí)施方式，并且將使用特定語言來描述這些實(shí)施方式。本文所使用的術(shù)語僅用于描述具體實(shí)施方式目的，而不旨在限制本公開的范圍。

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，以用于測定Caspase3的探針為例，來說明本發(fā)明探針的效果。該實(shí)施例的技術(shù)方案包括新型無標(biāo)記多肽分子探針的設(shè)計(jì)、新型探針的性能測定、新型探針定量測定體外重組半胱氨酸蛋白酶-3、新型探針對(duì)凋亡細(xì)胞的測定四個(gè)方面。

實(shí)施例

1.新型無標(biāo)記多肽分子探針的設(shè)計(jì)

所設(shè)計(jì)的多肽分子探針命名為Jun-CCC，其序列為asaaeleervktlkaeiyelrskanmlreqiaqlgapDEVDGCC，探針的N端和C端分別進(jìn)行了乙?；王０坊揎梺碓黾犹结樀姆€(wěn)定性。該探針包含有三個(gè)不同的功能區(qū)域，其中asaaeleervktlkaeiyelrskanmlreqiaqlgap是二聚化功能區(qū)，為防止多肽探針被其它蛋白酶非特異性切割，該區(qū)域全部由D-型氨基酸構(gòu)成；DEVD是半胱氨酸蛋白酶-3的特異性切割序列，由L-型氨基酸構(gòu)成；其后的氨基酸G為linker，用以增加CC與雙砷染料反應(yīng)的靈活性；CC是與雙砷染料結(jié)合的部位，用來讀取半胱氨酸蛋白酶-3的活性。在沒有被半胱氨酸蛋白酶-3切割的時(shí)候，多肽探針之間的自二聚化會(huì)使得兩個(gè)半胱氨酸-半胱氨酸二聯(lián)子在空間上相互接近，從而能與雙砷染料結(jié)合發(fā)出較強(qiáng)的熒光；相反，半胱氨酸蛋白酶-3的酶解作用會(huì)將半胱氨酸-半胱氨酸二聯(lián)子從多肽中解離下來，雖然被切割的多肽依然能夠二聚，但卻缺少了錨定雙砷染料的部位，雙砷染料因而不能發(fā)光。因此，通過測定切割前后熒光的變化，可以定量測定半胱氨酸蛋白酶-3的活性，進(jìn)而測定細(xì)胞凋亡過程。

2.新型探針的性能測定

為表明雙砷染料與探針的結(jié)合依賴于探針之間的二聚化作用，我們同時(shí)設(shè)計(jì)了兩條沒有二聚化能力的探針Jun^P-CCC和CCC，其中Jun^P-CCC的序列為asaaepeervktpkaeiyeprskanmpreqiaqpgapDEVDGCC，CCC的序列為GCC，Jun^P-CCC是將Jun-CCC中二聚化區(qū)域中的亮氨酸殘基全部突變?yōu)楦彼釟埢鶃韱适涠刍δ?，CCC是通過缺失Jun-CCC中的二聚化功能區(qū)使之不能二聚化。另外，兩個(gè)多肽的N端和C端分別進(jìn)行了乙?；揎椇王０坊揎棥Ｎ覀儨y定了Jun-CCC、Jun^P-CCC以及CCC與雙砷染料之間的結(jié)合能力。如圖1A所示，Jun-CCC可以與雙砷染料結(jié)合，產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號(hào)，相反，缺少二聚化能力的Jun^P-CCC和CCC則只能產(chǎn)生一些背景熒光信號(hào)，這表明是二聚化的探針而不是單個(gè)探針與雙砷染料相結(jié)合。并且，Jun-CCC探針與雙砷染料之間的結(jié)合是十分迅速的，約十分鐘左右的時(shí)間就可以達(dá)到最大熒光強(qiáng)度(圖1B)；此外，Jun-CCC探針與雙砷染料之間的結(jié)合是比較穩(wěn)定的(測定的平衡解離常數(shù)為3.17±0.39微摩爾每升)。

3.新型探針對(duì)體外重組半胱氨酸蛋白酶-3的定量測定

為了測定探針Jun-CCC能否被半胱氨酸蛋白酶-3所切割，我們添加0.1微升1毫摩爾每升的Jun-CCC以及0.2微升半胱氨酸蛋白酶-3到10微升的切割緩沖液(25mM HEPES,100mM NaCl,1mM EDTA,10％sucrose,0.1％CHAPS,1mM DTT,pH＝7.4)中，并在37度孵育一小時(shí)。該混合物隨后加入到40微升包含有1微摩爾每升FlAsH-EDT₂的雙砷染料標(biāo)記緩沖液(100mM Tris·Cl,75mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT,0.05mM BAL,pH＝7.4)中，并在室溫避光孵育30分鐘。我們測定了酶解前后的熒光水平(圖2A)。半胱氨酸蛋白酶-3的切割會(huì)導(dǎo)致Jun-CCC-雙砷染料復(fù)合物的熒光強(qiáng)度下降30倍(圖2B)。進(jìn)一步，我們測定該探針能否特異性測定半胱氨酸蛋白酶-3的活性，我們?cè)谙嗤姆磻?yīng)體系中測定了胰蛋白酶、凝血酶、類泛素蛋白酶1對(duì)Jun-CCC的切割作用，從圖2C中我們可以看到，胰蛋白酶、凝血酶、類泛素蛋白酶1不能切割Jun-CCC，因此，探針Jun-CCC可以特異性測定半胱氨酸蛋白酶-3的活性。進(jìn)一步，我們將Jun-CCC探針與不同濃度半胱氨酸蛋白酶-3相孵育，并測定每種濃度半胱氨酸蛋白酶-3所導(dǎo)致熒光的下降ΔF，ΔF與半胱氨酸蛋白酶-3濃度之間的關(guān)系如圖2D所示，計(jì)算出的最低檢測限為0.128納克每毫升，優(yōu)于現(xiàn)有大部分檢測方法。

4.新型探針對(duì)凋亡細(xì)胞的測定

進(jìn)一步，我們利用探針Jun-CCC來測定星孢菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。我們采用RAW264.7細(xì)胞作為研究模型，并利用1微摩爾每升的星孢菌素來誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的凋亡，同時(shí)將沒有經(jīng)過任何處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。細(xì)胞的凋亡同時(shí)采用免疫印跡法以及基于探針Jun-CCC的熒光法來測定。加入星孢菌素可明顯看到半胱氨酸蛋白酶-3大亞基的出現(xiàn)(圖3A)，表明細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶-3被成功激活。與免疫印跡結(jié)果相一致的是，星孢菌素處理過的細(xì)胞中其熒光信號(hào)要弱于對(duì)照組(圖3B)。并且，星孢菌素誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的凋亡是時(shí)間依賴的，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，會(huì)出現(xiàn)更多的半胱氨酸蛋白酶-3大亞基以及更弱的熒光信號(hào)。為進(jìn)一步驗(yàn)證熒光較少是由于激活半胱氨酸蛋白酶-3對(duì)探針Jun-CCC的切割所導(dǎo)致的，我們加入了半胱氨酸蛋白酶-3特異性抑制劑Ac-DEVD-CHO來抑制細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶-3的活性。如圖3C和3D所示，加入Ac-DEVD-CHO并不會(huì)改變半胱氨酸蛋白酶-3的蛋白量，但是卻會(huì)導(dǎo)致熒光恢復(fù)，表明熒光的減少是由于半胱氨酸蛋白酶-3對(duì)探針Jun-CCC的切割引起的。因此，探針Jun-CCC是可以有效測定細(xì)胞凋亡的。

最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。