本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

諸多研究表明干細(xì)胞不僅可以自我更新，在條件合適的情況下能分化成其他功能細(xì)胞，因此干細(xì)胞有望成為治療人類(lèi)疑難疾病的有效手段。然而，干細(xì)胞在正常成體組織中含量甚微，在體外如何快速擴(kuò)增與培養(yǎng)干細(xì)胞培養(yǎng)是研究干細(xì)胞的作用機(jī)制及探索其在治療人類(lèi)疾病治療方法的重要技術(shù)。

專(zhuān)利申請(qǐng)(CN103243070A)公開(kāi)了一種干細(xì)胞培養(yǎng)基及其應(yīng)用，所述培養(yǎng)基組分包括有基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、細(xì)胞因子或蛋白多肽、維生素及脂類(lèi)。其所提供的培養(yǎng)基能夠快速擴(kuò)增干細(xì)胞同時(shí)又不影響干細(xì)胞的潛能，干細(xì)胞的擴(kuò)增速度較常規(guī)培養(yǎng)基提高3-5倍，而且能用于培養(yǎng)多種組織的干細(xì)胞。

但是在干細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中，血清中大量成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)，給細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化帶來(lái)困難，其中復(fù)雜的蛋白和多重的細(xì)胞因子，會(huì)導(dǎo)致本身就容易分化的干細(xì)胞生出多種完全不同的細(xì)胞表型，而產(chǎn)生多種完全不同的細(xì)胞分化趨勢(shì)，也給細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)產(chǎn)品分離純化和結(jié)果的重復(fù)性帶來(lái)很大的困難。

因此，迫切需要一種成本低、成分明確、簡(jiǎn)單的的無(wú)血清培養(yǎng)基。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、成分明確、簡(jiǎn)單的無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，主要由以下成分及其濃度組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基1L，胰島素6-15mg/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白21-35mg/L，淫羊藿苷0.45-0.55μM，甘氨酰丙氨酸365-850mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸1.85-2.15g/L，多聚賴氨酸0.15-0.75mg/L，維生素E 0.3-0.5mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.03-0.045mg/L，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β10-30μg/L，還原性谷胱甘肽0.025-0.54mg/L和碳酸氫鈉0.45-0.65g/L。

進(jìn)一步，所述無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：DMEM/F12 1L，胰島素7.5mg/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白24.5mg/L，淫羊藿苷0.51μM，甘氨酰丙氨酸765mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸1.97g/L，多聚賴氨酸0.34mg/L，維生素E 0.32mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.042mg/L，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β19μg/L，還原性谷胱甘肽0.43mg/L和碳酸氫鈉0.52g/L。

進(jìn)一步，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM-L培養(yǎng)基或DMEM/F12培養(yǎng)基。

進(jìn)一步，所述無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：

(1)準(zhǔn)確稱取相應(yīng)濃度的胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，淫羊藿苷，甘氨酰丙氨酸，丙氨酰-L-酪氨酸，多聚賴氨酸，維生素E，聚乙烯吡咯烷酮，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，還原性谷胱甘肽，溶于溫度為20-30℃超純水中，攪拌至溶解完全，得溶液I；

(2)向上述溶液I中加入相應(yīng)濃度的碳酸氫鈉，攪拌均勻，加入1LDMEM/F12培養(yǎng)液，攪拌均勻得溶液II；

(3)用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調(diào)溶液II的pH至7.2，得溶液III；

(4)將溶液III用0.22μm濾膜正壓過(guò)濾除菌，即得。

采用本發(fā)明的上述無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，針對(duì)干細(xì)胞自身容易生出多種完全不同的細(xì)胞表型和多種完全不同的細(xì)胞分化趨勢(shì)的情形，采用上述各功能成分穩(wěn)定和保持其分化水平；并且可以避免現(xiàn)有技術(shù)血清蛋白培養(yǎng)基存在的血清批次間的質(zhì)量差異，提高細(xì)胞培養(yǎng)和試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性；并避免血清所帶來(lái)的外源性污染及血清組分的細(xì)胞毒性作用。并且其自身成分相對(duì)明確、質(zhì)量一致且蛋白含量低，有利于提高細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的穩(wěn)定性并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)利用本發(fā)明培養(yǎng)基能夠使細(xì)胞生長(zhǎng)延滯期縮短，擴(kuò)增速度快，細(xì)胞平頂期時(shí)間延長(zhǎng)，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。

(2)本發(fā)明培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)多種干細(xì)胞，包括脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和臍帶血干細(xì)胞等。

(3)本發(fā)明培養(yǎng)能夠明顯地促進(jìn)干細(xì)胞的分化，同時(shí)培養(yǎng)增殖后的干細(xì)胞對(duì)細(xì)胞退行性模型的保護(hù)作用。

附圖說(shuō)明

圖1：不同細(xì)胞培養(yǎng)基中干細(xì)胞密度變化；

圖2：不同細(xì)胞培養(yǎng)基中干細(xì)胞分化成RPE細(xì)胞的比率；

圖3：實(shí)施例1培養(yǎng)基中不同干細(xì)胞在細(xì)胞退行性模型中感光細(xì)胞的變化情況。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

原料來(lái)源：DMEM(L)液體：美國(guó)Hyclone公司；DMEM/F12液體：Hyclone公司；淫羊藿苷，CAS號(hào)：489-32-7；多聚賴氨酸，CAS號(hào)：25988-63-0。

實(shí)施例1一種無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基

一種無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：DMEM/F12 1L，胰島素7.5mg/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白24.5mg/L，淫羊藿苷0.51μM，甘氨酰丙氨酸765mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸1.97g/L，多聚賴氨酸0.34mg/L，維生素E 0.32mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.042mg/L，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β19μg/L，還原性谷胱甘肽0.43mg/L，碳酸氫鈉0.52g/L。

培養(yǎng)基制備方法為：

(1)準(zhǔn)確稱取相應(yīng)濃度的胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白，淫羊藿苷，甘氨酰丙氨酸，丙氨酰-L-酪氨酸，多聚賴氨酸，維生素E，聚乙烯吡咯烷酮，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，還原性谷胱甘肽，溶于溫度為25℃超純水中，攪拌至溶解完全，得溶液I；

(2)向上述溶液I中加入相應(yīng)濃度的碳酸氫鈉，攪拌均勻，加入1L DMEM/F12培養(yǎng)液，攪拌均勻得溶液II；

(3)用1mol/L氫氧化鈉溶液或1mol/L鹽酸溶液調(diào)溶液II的pH至7.2，得溶液III；

(4)將溶液III用0.22μm濾膜正壓過(guò)濾除菌，即得。

實(shí)施例2一種無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基

一種無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：DMEM-L 1L，胰島素6mg/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白21mg/L，淫羊藿苷0.45μM，甘氨酰丙氨酸365mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸1.85g/L，多聚賴氨酸0.15mg/L，維生素E 0.3mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.03mg/L，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β10μg/L，還原性谷胱甘肽0.025mg/L，碳酸氫鈉0.45g/L。

制備方法與實(shí)施例1相似。

實(shí)施例3一種無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基

一種無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：DMEM-L 1L，胰島素15mg/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白35mg/L，淫羊藿苷0.55μM，甘氨酰丙氨酸850mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸2.15g/L，多聚賴氨酸0.75mg/L，維生素E 0.5mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.045mg/L，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β30μg/L，還原性谷胱甘肽0.54mg/L，碳酸氫鈉0.65g/L。

制備方法與實(shí)施例1相似。

對(duì)比例1一種無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基

一種無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：DMEM/F12 1L，胰島素7.5mg/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白24.5mg/L，淫羊藿苷0.85μM，甘氨酰丙氨酸765mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸1.97g/L，多聚賴氨酸0.34mg/L，維生素E 0.32mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.042mg/L，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β19μg/L，還原性谷胱甘肽0.43mg/L，碳酸氫鈉0.52g/L。

制備方法與實(shí)施例1相似。

與對(duì)實(shí)施例1區(qū)別在于，淫羊藿苷的濃度增加至0.85μM。

對(duì)比例2一種無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基

一種無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：DMEM/F12 1L，胰島素7.5mg/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白24.5mg/L，淫羊藿苷0.51μM，甘氨酸320mg/L，丙氨酸445mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸1.97g/L，多聚賴氨酸0.34mg/L，維生素E 0.32mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.042mg/L，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β19μg/L，還原性谷胱甘肽0.43mg/L，碳酸氫鈉0.52g/L。

制備方法與實(shí)施例1相似。

與對(duì)實(shí)施例1區(qū)別在于，將甘氨酰丙氨酸替換為甘氨酸，丙氨酸。

對(duì)比例3一種無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基

一種無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下組分及重量份組成：DMEM/F12 1L，胰島素7.5mg/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白24.5mg/L，淫羊藿苷0.51μM，甘氨酰丙氨酸765mg/L，丙氨酰-L-酪氨酸1.15g/L，多聚賴氨酸0.34mg/L，維生素E 0.32mg/L，聚乙烯吡咯烷酮0.042mg/L，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β19μg/L，還原性谷胱甘肽0.43mg/L，碳酸氫鈉0.52g/L。

制備方法與實(shí)施例1相似。

與對(duì)實(shí)施例1區(qū)別在于，將丙氨酰-L-酪氨酸濃度降低至1.15g/L。

試驗(yàn)例一 對(duì)干細(xì)胞增殖的加速作用的實(shí)驗(yàn)

1、受試培養(yǎng)基：常規(guī)培養(yǎng)基組分：DMEM/F12基本培養(yǎng)基，10％胎牛血清(FBS)；實(shí)施例1培養(yǎng)基，對(duì)比例1-3培養(yǎng)基

2、培養(yǎng)干細(xì)胞來(lái)源：來(lái)源于脂肪組織器官的人體干細(xì)胞。

3、體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞接種密度控制在10-20％之間，接種后加入培養(yǎng)基培養(yǎng)(37℃，5％CO₂)。通過(guò)MTT法每隔12小時(shí)測(cè)一次細(xì)胞密度。圖1為本試驗(yàn)例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從圖中可以看出，經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例1的培養(yǎng)基培養(yǎng)的干細(xì)胞比對(duì)比例1-3的培養(yǎng)基培養(yǎng)表現(xiàn)出更快的擴(kuò)增速度，并且擴(kuò)增速度快于常規(guī)培養(yǎng)基，在36h時(shí)本發(fā)明實(shí)施例1的培養(yǎng)基培養(yǎng)的干細(xì)胞的濃度是常規(guī)培養(yǎng)基的2.9倍。

試驗(yàn)例二 對(duì)成視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞的潛能分析影響實(shí)驗(yàn)

1、受試培養(yǎng)基：常規(guī)培養(yǎng)基組分：DMEM/F12基本培養(yǎng)基，10％胎牛血清(FBS)；實(shí)施例1培養(yǎng)基，對(duì)比例1-3培養(yǎng)基。

2、培養(yǎng)干細(xì)胞來(lái)源：分別來(lái)源于脂肪、骨髓間及臍帶三種組織器官的人體干細(xì)胞(ADSC，BMSC，UMBSC)。

3、體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：為進(jìn)一步檢查干細(xì)胞經(jīng)本發(fā)明所描述的培養(yǎng)基擴(kuò)增后對(duì)其分化潛能的影響，我們按文獻(xiàn)所描述測(cè)定了按文獻(xiàn)所描述的方法測(cè)定了脂肪、骨髓間以及臍三種組織器官來(lái)源的人干細(xì)胞(ADSC，BMSC，UMBSC)擴(kuò)增8代之后視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞(RPE)的分化實(shí)驗(yàn)(Nat Biotechnol.2008Feb；26(2):215-24.)。對(duì)RPE細(xì)胞標(biāo)志物染色后統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果如圖2所示，經(jīng)本發(fā)明描述的培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)的干細(xì)胞分化成RPE細(xì)胞的比率均在80％左右，高于對(duì)比例培養(yǎng)基并高于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基。因此本發(fā)明所描述的培養(yǎng)基培養(yǎng)的干細(xì)胞能夠促進(jìn)干細(xì)胞分化成RPE細(xì)胞的潛能。

試驗(yàn)例三 增殖后干細(xì)胞對(duì)細(xì)胞退行性模型的保護(hù)作用

1、受試培養(yǎng)基：本發(fā)明實(shí)施例1培養(yǎng)基

2、培養(yǎng)干細(xì)胞來(lái)源：分別來(lái)源于脂肪、骨髓間及臍帶三種組織器官的人體干細(xì)胞(ADSC，BMSC，UMBSC)。

3、體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：為檢測(cè)干細(xì)胞經(jīng)本發(fā)明所描述的培養(yǎng)基擴(kuò)增后對(duì)退行性疾病的治療作用，我們選用了視網(wǎng)膜感光細(xì)胞退行性視網(wǎng)膜疾病小鼠模型(rd1)，將8代擴(kuò)增后的脂肪、骨髓以及臍三種組織器官來(lái)源的人干細(xì)胞(ADSC，BMSC或UMBSC)擴(kuò)增之后植入rd1退行性視網(wǎng)膜之后，組織學(xué)檢測(cè)感光細(xì)胞的數(shù)量，以確定其對(duì)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞退行性小鼠經(jīng)干細(xì)胞治療1個(gè)月之后，感光細(xì)胞的數(shù)量由原來(lái)不到8％提高到45-57％，干細(xì)胞經(jīng)本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)之后保護(hù)減緩組織細(xì)胞退化的能力仍然維持。干細(xì)胞細(xì)胞移植之后rd1小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞退化明顯變慢，因此經(jīng)本發(fā)明所描述的培養(yǎng)基擴(kuò)增后的干細(xì)胞在對(duì)退行性視網(wǎng)膜具有保護(hù)作用。