本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)基
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
：人體外周血液中的小淋巴細(xì)胞，幾乎都處在GI期(GO期)，一般情況下是不再分裂的，在培養(yǎng)液中加入植物凝血素PHA時(shí)，這種小淋巴細(xì)胞受刺激轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，隨后進(jìn)入有絲分裂，這樣經(jīng)過(guò)短期培養(yǎng)，秋水仙素的處理，低滲和固定，就可獲得部分有絲分裂細(xì)胞。這種方法已為臨床醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)、藥理學(xué)、遺傳毒性學(xué)等方面廣泛應(yīng)用。目前，影響人體外周血淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的原因有：(1)病毒或微生物感染：當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時(shí)，與體內(nèi)相比細(xì)胞丟失了對(duì)微生物和有毒物質(zhì)的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此在進(jìn)行培養(yǎng)中，保持細(xì)胞生存環(huán)境無(wú)污染、代謝物及時(shí)清除等，是維持細(xì)胞生存的基本條件；(2)培養(yǎng)溫度不恒定：維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長(zhǎng)，必須有恒定適宜的溫度，如果溫度有偏離，細(xì)胞的正常代謝會(huì)受到影響，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。(3)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏：充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)細(xì)胞正常代謝生長(zhǎng)的最重要前提，如在細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中，一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)被細(xì)胞代謝消耗，若供應(yīng)不足會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，影響細(xì)胞各項(xiàng)功能，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中需要及時(shí)補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)滿(mǎn)足細(xì)胞生長(zhǎng)所需。(4)氣體環(huán)境：氧氣和二氧化碳是維持細(xì)胞生存的必要條件之一，氧氣的功能是參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的能量和合成細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的各種成分；二氧化碳的主要功能是維持細(xì)胞培養(yǎng)體系的pH。(5)pH不穩(wěn)定：適宜的pH環(huán)境是細(xì)胞生長(zhǎng)的重要前提，而在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的代謝物會(huì)影響pH變化，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)。因此開(kāi)發(fā)一種適宜細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，是解決上述問(wèn)題的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的培養(yǎng)基一般是在合成培養(yǎng)基中添加血清，但血清來(lái)源復(fù)雜，難以確保質(zhì)量均一，同時(shí)血清中可能含有病毒等對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有害的因子。并且，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，只能通過(guò)操作無(wú)菌和環(huán)境無(wú)菌來(lái)確保無(wú)菌的環(huán)境。中國(guó)專(zhuān)利(CN101550408B)公開(kāi)了一種人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，其包括：RPMI1640液體培養(yǎng)基77-81.9％、牛血清10-14.9％、PHA4-6％、非硫酸化糖胺聚糖2-5％、CPPs2-5％和雙抗0.05-0.1％。該培養(yǎng)基具有淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率與淋巴細(xì)胞分裂指數(shù)高，試劑穩(wěn)定性好的優(yōu)勢(shì)。但是在培養(yǎng)基中采用青霉素、鏈霉素雖然能夠有效抑制微生物和病毒的感染，但是在一定程度上也會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。培養(yǎng)集中添加有牛血清，則會(huì)存在血清帶來(lái)的各種風(fēng)險(xiǎn)。因此，目前仍需要開(kāi)發(fā)一種效果優(yōu)良的人外周淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有細(xì)胞培養(yǎng)基存在容易被病毒或微生物感染、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏和pH不穩(wěn)定等問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法。本發(fā)明培養(yǎng)基能夠有效抑制微生物和病毒，試劑穩(wěn)定性好，培養(yǎng)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與淋巴細(xì)胞分裂指數(shù)高。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，主要包含以下成分及其濃度：RPMI1640培養(yǎng)基50-56g/L，小牛血清1-2g/L，膠原蛋白4-5g/L，透明質(zhì)酸鈉3-4.5g/L，胰高血糖素0.1-1.5mg/L，促甲狀腺釋放激素5-7μg/L，白芍總苷15-30mg/L，亞油酸1-3g/L，丁二胺0.1-0.5g/L，水合葡糖酸鐵鹽1-5mg/L，谷胱甘肽0.1-5μg/L，多聚賴(lài)氨酸0.5-3.5mg/L。優(yōu)選地，所述人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基由以下成分及其濃度組成：RPMI1640培養(yǎng)基55g/L，小牛血清1.5g/L，膠原蛋白4.76g/L，透明質(zhì)酸鈉3.75g/L，胰高血糖素1.43mg/L，促甲狀腺釋放激素6.8μg/L，白芍總苷22.56mg/L，亞油酸2.75g/L，丁二胺0.32g/L，水合葡糖酸鐵鹽3.5mg/L，谷胱甘肽4.25μg/L，多聚賴(lài)氨酸3.15mg/L。膠原蛋白(也稱(chēng)膠原)是細(xì)胞外基質(zhì)的一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，呈白色，含有少量的半乳糖和葡萄糖，具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)因子與細(xì)胞因子的運(yùn)輸?shù)墓δ?；同時(shí)還具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞貼壁的功能。透明質(zhì)酸鈉為白色纖維狀或粉末狀固體，有很強(qiáng)的吸濕性，溶于水。透明質(zhì)酸鈉可有效地增加細(xì)胞培養(yǎng)液中電解質(zhì)擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn)，能夠增加細(xì)胞通透性，減少有關(guān)蛋白質(zhì)的丟失，改善營(yíng)養(yǎng)代謝；并且有效穩(wěn)定pH值，從而使細(xì)胞能達(dá)到有效生長(zhǎng)并增加目的蛋白表達(dá)率。白芍總苷在低濃度范圍內(nèi)能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖。亞油酸，丁二胺能提供細(xì)胞膜合成所需的脂質(zhì)和細(xì)胞生長(zhǎng)所需的水溶性脂質(zhì)。水合葡糖酸鐵鹽(CAS號(hào)：22830-45-1)能夠有效促進(jìn)細(xì)胞對(duì)鐵的吸收。多聚賴(lài)氨酸(CAS號(hào)：25988-63-0)目前天然防腐劑中具有優(yōu)良防腐性能的微生物類(lèi)防腐劑。它是由25～30賴(lài)氨酸殘基聚合而成，具有強(qiáng)烈的抑菌能力，并且是一種促細(xì)胞貼壁成分。優(yōu)選地，所述人體外周血細(xì)胞培養(yǎng)基制備方法，分為以下步驟：(1)準(zhǔn)確稱(chēng)取RPMI1640培養(yǎng)基干粉后置于消毒容器內(nèi)，添加超純水稀釋后攪拌混勻，得溶液I；(2)采用巴氏消毒法將牛血清溶解后低溫處理后加入溶液I中，得溶液II；(3)將膠原蛋白，透明質(zhì)酸鈉，胰高血糖素，促甲狀腺釋放激素，白芍總苷，亞油酸，丁二胺，水合葡糖酸鐵鹽，谷胱甘肽4，多聚賴(lài)氨酸加入溶液II，充分混勻后過(guò)濾滅菌，即得。本發(fā)明培養(yǎng)基與現(xiàn)有培養(yǎng)基相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明培養(yǎng)基能夠有效抑制微生物和病毒，試劑穩(wěn)定性好。(2)本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與淋巴細(xì)胞分裂指數(shù)高。具體實(shí)施例下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。白芍總苷，購(gòu)于陜西森弗生物技術(shù)有限公司；膠原蛋白，購(gòu)于天津?yàn)I海捷成專(zhuān)類(lèi)化工有限公司；小牛血清，購(gòu)于上海士鋒生物科技有限公司。實(shí)施例1一種人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基一種人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：RPMI1640培養(yǎng)基55g/L，小牛血清1.5g/L，膠原蛋白4.76g/L，透明質(zhì)酸鈉3.75g/L，胰高血糖素1.43mg/L，促甲狀腺釋放激素6.8μg/L，白芍總苷22.56mg/L，亞油酸2.75g/L，丁二胺0.32g/L，水合葡糖酸鐵鹽3.5mg/L，谷胱甘肽4.25μg/L，多聚賴(lài)氨酸3.15mg/L。制備方法，分為以下步驟：(1)準(zhǔn)確稱(chēng)取RPMI1640培養(yǎng)基干粉后置于消毒容器內(nèi)，添加超純水稀釋后攪拌混勻，得溶液I；(2)采用巴氏消毒法將牛血清溶解后低溫處理后加入溶液I中，得溶液II；(3)將膠原蛋白，透明質(zhì)酸鈉，胰高血糖素，促甲狀腺釋放激素，白芍總苷，亞油酸，丁二胺，水合葡糖酸鐵鹽，谷胱甘肽4，多聚賴(lài)氨酸加入溶液II，充分混勻后過(guò)濾滅菌，即得。實(shí)施例2一種人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基一種人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：RPMI1640培養(yǎng)基56g/L，小牛血清2g/L，膠原蛋白5g/L，透明質(zhì)酸鈉4.5g/L，胰高血糖素1.5mg/L，促甲狀腺釋放激素7μg/L，白芍總苷30mg/L，亞油酸3g/L，丁二胺0.5g/L，水合葡糖酸鐵鹽5mg/L，谷胱甘肽5μg/L，多聚賴(lài)氨酸3.5mg/L。上述培養(yǎng)基制備方法與實(shí)施例1類(lèi)似。實(shí)施例3一種人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基一種人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：RPMI1640培養(yǎng)基50g/L，小牛血清1g/L，膠原蛋白4g/L，透明質(zhì)酸鈉3g/L，胰高血糖素0.1mg/L，促甲狀腺釋放激素5μg/L，白芍總苷15mg/L，亞油酸1g/L，丁二胺0.1g/L，水合葡糖酸鐵鹽1mg/L，谷胱甘肽0.1μg/L，多聚賴(lài)氨酸0.5mg/L。上述培養(yǎng)基制備方法與實(shí)施例1類(lèi)似。對(duì)比例1一種人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基一種人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：RPMI1640培養(yǎng)基55g/L，小牛血清1.5g/L，膠原蛋白4.76g/L，透明質(zhì)酸鈉3.75g/L，胰高血糖素1.43mg/L，促甲狀腺釋放激素6.8μg/L，白芍總苷35mg/L，亞油酸2.75g/L，丁二胺0.32g/L，水合葡糖酸鐵鹽3.5mg/L，谷胱甘肽4.25μg/L，多聚賴(lài)氨酸3.15mg/L。上述培養(yǎng)基制備方法與實(shí)施例1類(lèi)似。與實(shí)施例1的區(qū)別在于，白芍總苷35mg/L。對(duì)比例2一種人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基一種人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分及其濃度組成：RPMI1640培養(yǎng)基55g/L，小牛血清1.5g/L，膠原蛋白4.76g/L，透明質(zhì)酸鈉3.75g/L，胰高血糖素1.43mg/L，促甲狀腺釋放激素6.8μg/L，白芍總苷22.56mg/L，丁二胺3.07g/L，水合葡糖酸鐵鹽3.5mg/L，谷胱甘肽4.25μg/L，多聚賴(lài)氨酸3.15mg/L。上述培養(yǎng)基制備方法與實(shí)施例1類(lèi)似。與實(shí)施例1的區(qū)別在于，未添加亞油酸，提高了丁二胺的濃度。試驗(yàn)例1培養(yǎng)基質(zhì)量測(cè)試測(cè)試培養(yǎng)基：實(shí)施例1-3制備得到的培養(yǎng)基以及對(duì)比例1-2制備得到的培養(yǎng)基。測(cè)試內(nèi)容：(1)無(wú)菌檢測(cè)使用平板法檢測(cè)，取羊血瓊脂平板1塊和沙保弱瓊脂平板1塊，平衡至室溫。取上述測(cè)試培養(yǎng)基為樣品經(jīng)4000rpm離心15min后從樣品管底部吸取樣品，每塊平板100μL，用接種針劃線。將平板放入37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果為陰性，樣品合格。(2)內(nèi)毒素檢測(cè)使用凝膠法檢測(cè)，取上述測(cè)試培養(yǎng)基為樣品經(jīng)稀釋后，同陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、供試品陽(yáng)性對(duì)照分別加入經(jīng)無(wú)菌檢查用水復(fù)融后的鱟試劑中，每種平行兩管。結(jié)果為陰性對(duì)照管為陰性，陽(yáng)性對(duì)照管為陽(yáng)性，供試品陽(yáng)性對(duì)照管為陽(yáng)性且樣品管為陰性，樣品合格。(3)支原體檢測(cè)為PCR法檢測(cè)將上述測(cè)試培養(yǎng)基為樣品進(jìn)行沸水浴10min后經(jīng)12000rpm離心3min后使用，采用25μL體系對(duì)待測(cè)樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上觀察檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果為陰性，樣品合格。試驗(yàn)例2細(xì)胞培養(yǎng)基淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率與淋巴細(xì)胞分裂指數(shù)比較試驗(yàn)對(duì)象：實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-2制備得到的培養(yǎng)基試驗(yàn)內(nèi)容：采血、接種和培養(yǎng)：用2.5％碘酒、75％酒精消毒瓶蓋，用酒精燈火焰過(guò)烤，無(wú)菌條件下抽取患者外周血0.5-1mL，每瓶培養(yǎng)基加20滴左右，輕搖均勻，盡量避免培養(yǎng)物與瓶蓋接觸；置36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，每隔12小時(shí)左右輕搖1次，以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖；細(xì)胞培養(yǎng)：收獲前2小時(shí)左右加秋水仙素，最終濃度為0.02μg/mL培養(yǎng)液，搖勻后置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，以抑止細(xì)胞在分裂中期。從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶終止培養(yǎng)，搖勻后移至10mL尖底離心管中，盡量收集培養(yǎng)細(xì)胞。2000rpm離心8分鐘。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換率的檢測(cè)與計(jì)算方法：淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率＝轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞數(shù)/1000x100％。即每1000個(gè)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。淋巴細(xì)胞分裂指數(shù)檢測(cè)與計(jì)算方法：分裂指數(shù)＝分裂細(xì)胞數(shù)/(1000-分裂細(xì)胞數(shù))x100％。即每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂細(xì)胞數(shù)比上未分裂細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果：數(shù)據(jù)比較，檢測(cè)結(jié)果如表1示：表1不同細(xì)胞培養(yǎng)基淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與淋巴細(xì)胞分裂指數(shù)比較檢測(cè)指標(biāo)實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3對(duì)比例1對(duì)比例2淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率≥65％≥58％≥62％5-7％26-39％分裂指數(shù)≥7.7％≥7.4％≥7.1％1％2-4％由表1可知，實(shí)施例制備得到的培養(yǎng)基中淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、分裂指數(shù)均高于對(duì)比例，并且實(shí)施例1制備得到的培養(yǎng)基效果最好，為最佳實(shí)施例。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3