本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)沙門氏菌的恒溫檢測(cè)方法及其試劑盒，特別涉及一種不依賴于高能量分子的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。

背景技術(shù)：

鼠傷寒沙門氏菌沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一，其病原沙門氏菌屬腸道細(xì)菌科，包括那些引起食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細(xì)菌。它們除可感染人外，還可感染很多動(dòng)物包括哺乳類、鳥(niǎo)、爬行類、魚(yú)、兩棲類及昆蟲(chóng)。人畜感染后可呈無(wú)癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾，它可能加重病態(tài)或死亡率，或者降低動(dòng)物的繁殖生產(chǎn)力。

1983年，Mullis等發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，30多年間，PCR技術(shù)得到長(zhǎng)足發(fā)展，由于其在靈敏度和特異性方面的優(yōu)勢(shì)，PCR技術(shù)被迅速運(yùn)用到科學(xué)研究和臨床研究的各個(gè)方面。這種類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程的PCR技術(shù)，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。

與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要利用重組酶的活性，不進(jìn)行核酸解鏈和退火即可在恒溫條件下（如37℃）進(jìn)行核酸的擴(kuò)增，因此不需要昂貴的儀器，也避免了高溫對(duì)酶的損耗。同時(shí)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在體系中不需要加入過(guò)量的引物，降低了引物與模板錯(cuò)配或生成引物二聚體的可能性。另外，恒溫?cái)U(kuò)增體系有多重工具酶匹配進(jìn)行有效擴(kuò)增，擴(kuò)增效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，所用時(shí)間更短，最短可以在5min內(nèi)實(shí)現(xiàn)。由于恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有擴(kuò)增用時(shí)短、不需昂貴儀器、特異性好等特點(diǎn)，使其在項(xiàng)目上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。本發(fā)明將恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)用在食品安全中沙門氏菌的檢測(cè)上，讓沙門氏菌的檢測(cè)過(guò)程更加簡(jiǎn)便快捷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于一種快速檢測(cè)沙門氏菌的恒溫檢測(cè)方法及其試劑盒，包括反應(yīng)液，啟動(dòng)液，反應(yīng)酶系，沙門氏菌stn基因特異性引物。

快速檢測(cè)沙門氏菌試劑盒反應(yīng)液的具體成分如下：

Tris-HCl（pH8.3） 50mM

KCl 60mM

二硫蘇糖醇 2mM

甜菜堿 1M

海藻糖 5.5%

PEG 5.5%

BSA 0.1mg/mL

快速檢測(cè)沙門氏菌試劑盒啟動(dòng)液的具體組分如下：

氯化鎂 10mM

快速檢測(cè)沙門氏菌試劑盒反應(yīng)酶系的具體組分如下：

dNTPs 200uM

聚合酶Bsu 50U

單鏈結(jié)合蛋白 262ng/ul

重組酶（E.coli RecT） 360ng/ul

上游引物 200nM

下游引物 200nM

快速檢測(cè)沙門氏菌試劑盒特異性引物序列如下：

上游引物：TGTAAAATCGTGCAGTGGCTTACATCATCATCC

下游引物：GTATTGAGGGTAAAGGCGCGGTCTTTACTATCT

附圖說(shuō)明：

圖1是實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖2是實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖3是實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

本發(fā)明的有益效果：擴(kuò)增用時(shí)短，特異性好，檢測(cè)過(guò)程更快捷。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步說(shuō)明快速檢測(cè)沙門氏菌試劑盒的優(yōu)勢(shì)。

本發(fā)明的目的在于一種快速檢測(cè)沙門氏菌的恒溫檢測(cè)方法及其試劑盒，包括反應(yīng)液，啟動(dòng)液，反應(yīng)酶系，沙門氏菌stn基因特異性引物。各組分的具體成分如下：

快速檢測(cè)沙門氏菌試劑盒反應(yīng)液的具體成分如下：

Tris-HCl（pH8.3） 50mM

KCl 60mM

二硫蘇糖醇 2mM

甜菜堿 1M

海藻糖 5.5%

PEG 5.5%

BSA 0.1mg/mL

快速檢測(cè)沙門氏菌試劑盒啟動(dòng)液的具體組分如下：

氯化鎂 10mM

快速檢測(cè)沙門氏菌試劑盒反應(yīng)酶系的具體組分如下：

dNTPs 200uM

聚合酶Bsu 50U

單鏈結(jié)合蛋白 262ng/ul

重組酶（E.coli RecT） 360ng/ul

上游引物 200nM

下游引物 200nM

快速檢測(cè)沙門氏菌試劑盒特異性引物序列如下：

上游引物：TGTAAAATCGTGCAGTGGCTTACATCATCATCC

下游引物：GTATTGAGGGTAAAGGCGCGGTCTTTACTATCT

下面結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步說(shuō)明快速檢測(cè)沙門氏菌試劑盒的優(yōu)勢(shì)，但并非限制本發(fā)明。

實(shí)驗(yàn)樣本來(lái)源：

以外購(gòu)沙門氏菌經(jīng)放大培養(yǎng)后提取得到的核酸溶液作為樣本；

以外購(gòu)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、志賀氏菌、李斯特菌經(jīng)放大培養(yǎng)后提取得到的核酸溶液作為特異性實(shí)驗(yàn)的樣本；

以混合感染沙門氏菌-金黃色葡萄球菌、大腸桿菌-沙門氏菌的奶制品經(jīng)放大培養(yǎng)后提取得到的核酸溶液作為混合感染實(shí)驗(yàn)的樣本；

以滅菌純水為陰性對(duì)照樣本。

實(shí)施例1（靈敏度實(shí)驗(yàn)）：

本實(shí)施例將沙門氏菌核酸按照10倍、100倍、1000倍、10000倍稀釋，將稀釋后的核酸依次標(biāo)記為樣本1、樣本2、樣本3、樣本4，其濃度分別是10ng/ul、1ng/ul、0.1ng/ul、0.01ng/ul，用滅菌水作為陰性對(duì)照。取5個(gè)200ul反應(yīng)管，依次標(biāo)記為反應(yīng)管1~5，分別加入20ul反應(yīng)液、5ul反應(yīng)酶系到反應(yīng)管1~5中，在反應(yīng)管1中加入2ul 樣本1，在反應(yīng)管2中加入2ul 樣本2，依次類推，反應(yīng)管5加入2ul滅菌水，最后用滅菌水將體系補(bǔ)足到45ul，混勻后再分別加入5ul啟動(dòng)液。

選擇恒溫水浴鍋提供反應(yīng)所需要的恒溫環(huán)境，設(shè)置恒溫水浴鍋溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為30min。

反應(yīng)結(jié)束后，從反應(yīng)管1~5中分別取10ul產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖1.

實(shí)施例2（特異性實(shí)驗(yàn)）：

本實(shí)施例將沙門氏菌核酸、金黃色葡萄球菌核酸、大腸桿菌核酸、志賀氏菌核酸、李斯特菌核酸依次標(biāo)記為樣本1、樣本2、樣本3、樣本4，樣本5，其濃度均為10ng/ul。取5個(gè)200ul反應(yīng)管，依次標(biāo)記為反應(yīng)管1~5，分別加入20ul反應(yīng)液、5ul反應(yīng)酶系到反應(yīng)管1~5中，在反應(yīng)管1中加入2ul 樣本1，在反應(yīng)管2中加入2ul 樣本2，依次類推，最后用滅菌水將體系補(bǔ)足到45ul，混勻后再分別加入5ul啟動(dòng)液。

選擇恒溫水浴鍋提供反應(yīng)所需要的恒溫環(huán)境，設(shè)置恒溫水浴鍋溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為30min。

反應(yīng)結(jié)束后，從反應(yīng)管1~5中分別取10ul產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖2.

實(shí)施例3（混合感染實(shí)驗(yàn)）：

本實(shí)施例將沙門氏菌-金黃色葡萄球菌核酸、大腸桿菌-沙門氏菌核酸依次標(biāo)記為樣本1、樣本2，其濃度均為10ng/ul。取3個(gè)200ul反應(yīng)管，依次標(biāo)記為反應(yīng)管1~3，分別加入20ul反應(yīng)液、5ul反應(yīng)酶系到反應(yīng)管1~3中，在反應(yīng)管1中加入2ul 樣本1，在反應(yīng)管2中加入2ul 樣本2，反應(yīng)管3加入2ul滅菌水，，最后用滅菌水將體系補(bǔ)足到45ul，混勻后再分別加入5ul啟動(dòng)液。

選擇恒溫水浴鍋提供反應(yīng)所需要的恒溫環(huán)境，設(shè)置恒溫水浴鍋溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為30min。

反應(yīng)結(jié)束后，從反應(yīng)管1~3中分別取10ul產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖3.

結(jié)論：

1.從圖1的結(jié)果可以看到，沙門氏菌核酸濃度在10ng/ul、1ng/ul跟0.1ng/ul在200bp處有清晰的目的條帶，濃度0.01ng/ul有較弱的目的條帶，說(shuō)明本發(fā)明試劑盒擴(kuò)增效果好，靈敏度高。

2.從圖2的結(jié)果可以看到，僅在樣本1即沙門氏菌核酸在200bp處有擴(kuò)增條帶，其余樣本無(wú)非特異性條帶，說(shuō)明本發(fā)明試劑盒擴(kuò)增的特異性好，能準(zhǔn)確的區(qū)分所檢測(cè)的目的菌與其他食品常見(jiàn)菌。

3.從圖3的結(jié)果可以看到，混合感染樣本1跟2在200bp處有擴(kuò)增條帶，說(shuō)明樣本中不同核酸對(duì)本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)不造成干擾，說(shuō)明本發(fā)明試劑盒特異性好，穩(wěn)定性高。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣州和實(shí)生物技術(shù)有限公司

<120> 一種快速檢測(cè)沙門氏菌的恒溫檢測(cè)方法及其試劑盒

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<212> DNA

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gtattgaggg taaaggcgcg gtctttacta tct 33