本發(fā)明涉及工業(yè)生物發(fā)酵領域，具體的說是一種提高Vc二步產酸菌生產能力的方法。
背景技術：
維生素C(Vitamin C,簡稱Vc)，又稱L-抗壞血酸(L-Ascorbic Acid)，是一種植物體內常見、人類無法自身合成的維生素。Vc具有多種功能，廣泛應用于藥品、食品、飼料和化妝品領域，市場需求巨大。Vc二步發(fā)酵法是目前工業(yè)上制備Vc前體—古龍酸的主要方法。Vc二步發(fā)酵系兩種菌的混合發(fā)酵，一種為產酸菌，通過酶催化山梨糖為古龍酸，俗稱“產酸”，但產酸菌自身不能單獨培養(yǎng)，需依賴另外一種伴生菌的存在才能生長、繁殖和產酸；另一種為伴生菌，伴生菌不產酸，但可為產酸菌的生長和產酸提供保障。在發(fā)酵時兩種菌需要混和培養(yǎng)，并且相互間要保持一定的動態(tài)平衡，才能較好地完成菌體生長和糖酸轉化。但兩種菌的生物學特征不同，生長條件和營養(yǎng)需求也不一樣。所以，這種產酸菌對伴生菌的高度依賴性同時又伴有較強負面影響，如伴生菌與產酸菌間競爭營養(yǎng)和生態(tài)位等，常常使產酸菌的數量和活性受到壓制。所以，在培養(yǎng)或發(fā)酵時需要同時兼顧兩者的各自需求，實現起來十分不易。在實踐操作中，往往會顧此失彼，導致產酸菌和伴生菌間生長失衡。因此，該工藝的過程可控性差、批次波動大、整體收率低、生產能力難以進一步提高。所以，處理好兩種菌在混和發(fā)酵時的相互關系，研發(fā)出一種操作簡便、安全性高、發(fā)酵期短、回收率高、產品質量好、成本低廉、綠色環(huán)保的Vc古龍酸發(fā)酵新技術，是目前Vc混菌工業(yè)發(fā)酵領域一個亟待解決的難題。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種提高Vc二步發(fā)酵產酸菌生產能力的方法。
為實現上述目的，本發(fā)明采用技術方案為：
一種提高Vc二步發(fā)酵產酸菌生產能力的方法，包括以下具體步驟：
(1)將伴生菌在種子培養(yǎng)基中單獨培養(yǎng)至穩(wěn)定末期，所得培養(yǎng)液進行細胞破碎，制成活性蛋白液；其中，所述菌種細胞破碎的方法包括超聲、壓榨、研磨或酶解；
(2)將產酸菌的菌種懸液，接入內含上述活性蛋白液的發(fā)酵培養(yǎng)基中，經發(fā)酵獲得產酸菌發(fā)酵種液；
(3)將所述產酸菌發(fā)酵種液接入內含上述活性蛋白液的發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行產酸菌發(fā)酵并對山梨糖進行生物轉化，至發(fā)酵結束獲得古龍酸。
所述步驟(1)中種子培養(yǎng)基中葡萄糖的質量含量為0.5-1.2％，所述發(fā)酵至穩(wěn)定末期發(fā)酵液中伴生菌濃度為1-9×108CFU/ml。
所述步驟(2)中產酸菌的菌種懸液接入內含活性蛋白液的發(fā)酵培養(yǎng)基的接入量為體積含量的1-15％；所述產酸菌的菌種懸液中，產酸菌的濃度為1-9×109CFU/ml。
優(yōu)選所述步驟(2)中產酸菌的菌種懸液接入內含活性蛋白液的發(fā)酵培養(yǎng)基的接入量為體積含量的3-8％；所述產酸菌的菌種懸液中，產酸菌的濃度為4-9×109CFU/ml。
所述步驟(2)中，產酸菌的菌種懸液接入內含活性蛋白液的發(fā)酵培養(yǎng)基時，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中活性蛋白液的體積含量為0.2-2.4％，優(yōu)選為1.2％。
所述步驟(3)中產酸菌的菌種懸液接入內含活性蛋白液的發(fā)酵培養(yǎng)基的接入量為體積含量的2-10％，優(yōu)選為5％；所述產酸菌的發(fā)酵種液中，產酸菌的濃度為1-9×109CFU/ml。
所述步驟(3)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中活性蛋白液的體積含量為0.2-1.2％，優(yōu)選為0.5％。
所述步驟(3)中，在發(fā)酵中期時補加發(fā)酵培養(yǎng)基體積含量0.05-0.5％的活性蛋白液；優(yōu)選補加體積含量為0.1-0.3％的活性蛋白液。
所述伴生菌選自巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、擲孢酵母或啤酒酵母中的一種或幾種；所述產酸菌選自生酮基古龍酸菌。
本發(fā)明的優(yōu)點在于：
本發(fā)明方法具備單菌種(即產酸菌)發(fā)酵的特征，可極大地提高發(fā)酵過程的可控性和生產效率，有著操作簡便、安全性高、收率高、發(fā)酵周期短、產品質量好、成本低、綠色環(huán)保等優(yōu)點，適合在Vc發(fā)酵制備古龍酸的工業(yè)生產領域中應用；具體為：
(1)本發(fā)明改變Vc二步雙菌種混合發(fā)酵為單菌種發(fā)酵，排除產酸菌種對伴生菌的過度依賴。
(2)本發(fā)明中產酸菌和伴生菌各自單獨培養(yǎng)，排除混合培養(yǎng)時之間的干擾，最大程度地滿足各自的最佳需求，保障了活性蛋白的充足供應，使新種液質量得到大幅提升，保障發(fā)酵的快速啟動及后續(xù)的高效進行。
(3)本發(fā)明發(fā)酵過程中的管理和調節(jié)得以規(guī)范化和簡便化，生產得以穩(wěn)定、高效進行。
具體實施方式
以下實施例將有助于對本發(fā)明的了解，但這些實施例僅為了對本發(fā)明加以說明，本發(fā)明并不限于這些內容。下述各實施例中的發(fā)酵條件，無需特殊限定，按照現階段通用的Vc發(fā)酵條件即可。
實施例1
(1)選取5L發(fā)酵罐，注入3L葡萄糖質量含量為0.5％的種子培養(yǎng)基，接入150ml濃度為2×108CFU/ml的巨大芽孢桿菌懸液作為伴生菌，發(fā)酵至穩(wěn)定末期，伴生菌濃度達3.6×108CFU/ml，再以25KHz超聲破碎得活性蛋白液。
(2)取100ml上述活性蛋白液，接入內含15L發(fā)酵培養(yǎng)基的20L發(fā)酵罐中，再接入400ml菌濃度為3×109CFU/ml的產酸菌懸液(產酸菌為生酮基古龍酸菌)，發(fā)酵至菌濃度達4.5×109CFU/ml，得到產酸菌發(fā)酵種液。(3)取上述產酸菌發(fā)酵種液15L接入內含300L發(fā)酵培養(yǎng)基及1.5L上述步驟(1)所獲活性蛋白液的500L發(fā)酵罐，對山梨糖進行發(fā)酵至發(fā)酵結束，在發(fā)酵醪液中獲得古龍酸。
在同等條件下，采用實施例1的Vc二步單菌種發(fā)酵制備古龍酸的方法與傳統的Vc二步混菌發(fā)酵法相比，古龍酸收率提高2個百分點，即收率為93％，發(fā)酵周期縮短6％。
實施例2
(1)選取5L發(fā)酵罐，注入3L葡萄糖質量含量為0.5％的種子培養(yǎng)基，接入150ml菌濃度為2×108CFU/ml的巨大芽孢桿菌懸液作為伴生菌，發(fā)酵至穩(wěn)定末期，伴生菌濃度達3.6×108CFU/ml。25KHz超聲破碎得活性蛋白液。
(2)取100ml上述獲得活性蛋白液，接入內含15L發(fā)酵培養(yǎng)基的20L發(fā)酵罐，再接入400ml菌濃度為3×109CFU/ml的產酸菌懸液(產酸菌為生酮基古龍酸菌)，發(fā)酵至菌濃度達4.5×109CFU/ml，得到產酸菌發(fā)酵種液。
(3)取上述產酸菌發(fā)酵種液15L接入內含300L發(fā)酵培養(yǎng)基及1.5L上述步驟(1)獲得的活性蛋白液的500L發(fā)酵罐對山梨糖進行發(fā)酵，發(fā)酵20小時至發(fā)酵中期，再補加500ml上述步驟(1)獲得的活性蛋白液，至發(fā)酵結束，在發(fā)酵醪液中獲得古龍酸。
在同等條件下，采用實施例二的Vc二步單菌種發(fā)酵制備古龍酸的方法與傳統的Vc二步混菌發(fā)酵法相比，古龍酸收率提高2.6個百分點，即收率為93.6％，發(fā)酵周期縮短8％。
實施例3
(1)選取5L發(fā)酵罐，注入3L葡萄糖質量含量為0.6％的種子培養(yǎng)基，接入200ml濃度為3×108CFU/ml的蠟狀芽孢桿菌懸液作為伴生菌，發(fā)酵至穩(wěn)定末期，伴生菌濃度達5.5×108CFU/ml。25KHz超聲破碎得活性蛋白液。
(2)取100ml上述獲得的活性蛋白液，接入內含15L發(fā)酵培養(yǎng)基的20L發(fā)酵罐，再接入400ml濃度為2.5×109CFU/ml的產酸菌懸液(產酸菌為生酮基古龍酸菌)，發(fā)酵至菌濃度達4×109CFU/ml，得到產酸菌發(fā)酵種液。
(3)取上述產酸菌發(fā)酵種液15L接入內含300L發(fā)酵培養(yǎng)基及1.5L上述步驟(1)獲得的活性蛋白液的500L發(fā)酵罐，對山梨糖進行發(fā)酵至結束，得到古龍酸。
在同等條件下，采用實施例三的Vc二步單菌種發(fā)酵制備古龍酸的方法與傳統的Vc二步混菌發(fā)酵法相比，古龍酸收率提高3.2個百分點，即收率為94.2％，發(fā)酵周期縮短6％。
實施例4
(1)選取5L發(fā)酵罐，注入3L葡萄糖質量含量為0.6％的種子培養(yǎng)基，接入200ml濃度為3×108CFU/ml的蠟狀芽孢桿菌懸液作為伴生菌，發(fā)酵至穩(wěn)定末期，伴生菌濃度達5.5×108CFU/ml。25KHz超聲破碎得活性蛋白液。
(2)取100ml上述獲得的活性蛋白液，接入內含15L發(fā)酵培養(yǎng)基的20L發(fā)酵罐，再接入400ml菌濃度為2.5×109CFU/ml的產酸菌懸液，產酸菌為生酮基古龍酸菌，發(fā)酵至菌濃度達4×109CFU/ml，得到產酸菌發(fā)酵種液。
(3)取所述種液15L接入內含300L發(fā)酵培養(yǎng)基及1.5L上述步驟(1)獲得的活性蛋白液的500L發(fā)酵罐對山梨糖進行發(fā)酵，發(fā)酵20小時至發(fā)酵中期，再補加500ml上述步驟(1)獲得的活性蛋白液，繼續(xù)發(fā)酵至結束，得到古龍酸。
在同等條件下，采用實施例四，Vc二步單菌種發(fā)酵制備古龍酸的方法與傳統的Vc二步混菌發(fā)酵法相比，古龍酸收率提高3.5百分點，即收率為94.5％，發(fā)酵周期縮短8％。
實施例5
(1)選取5L發(fā)酵罐，注入3L葡萄糖質量含量為0.5％的種子培養(yǎng)基，接入150ml菌濃度為3.5×108CFU/ml的蘇云金芽孢桿菌懸液作為伴生菌，發(fā)酵至穩(wěn)定末期，伴生菌濃度達9×108CFU/ml。再經酶解得活性蛋白液。
(2)取30ml上述獲得的活性蛋白液，接入內含15L發(fā)酵培養(yǎng)基的20L發(fā)酵罐，再接入300ml菌濃度為4×109CFU/ml的產酸菌懸液，產酸菌為生酮基古龍酸菌，發(fā)酵至菌濃度達9×109CFU/ml，得到種液。
(3)取所述種液12L接入內含600L發(fā)酵培養(yǎng)基及1.2L上述步驟(1)獲得的活性蛋白液的1000L發(fā)酵罐對山梨糖進行發(fā)酵，發(fā)酵20小時至發(fā)酵中期，再補加300ml上述步驟(1)獲得的活性蛋白液，至發(fā)酵結束，在發(fā)酵醪液中得到古龍酸。
在同等條件下，采用實施例五，Vc二步單菌種發(fā)酵制備古龍酸的方法與傳統的Vc二步混菌發(fā)酵法相比，古龍酸收率提高2.7百分點，即收率為93.7％，發(fā)酵周期縮短6％。
實施例6
(1)選取5L發(fā)酵罐，注入3L葡萄糖質量含量為1.2％的種子培養(yǎng)基，接入150ml菌濃度為5×107CFU/ml的啤酒酵母懸液作為伴生菌，發(fā)酵至穩(wěn)定末期，伴生菌濃度達1×108CFU/ml。經研磨得活性蛋白液。
(2)取150ml上述獲得的活性蛋白液，接入內含13L發(fā)酵培養(yǎng)基的20L發(fā)酵罐，再接入1L菌濃度為1×109CFU/ml的產酸菌懸液，產酸菌為生酮基古龍酸菌，發(fā)酵至菌濃度達2×109CFU/ml，得到產酸菌懸液。
(3)取所述種液30L接入內含300L發(fā)酵培養(yǎng)基及3.5L上述步驟(1)獲得的活性蛋白液的500L發(fā)酵罐對山梨糖進行發(fā)酵，發(fā)酵20小時至發(fā)酵中期，再補加1700ml上述步驟(1)獲得的活性蛋白液，得到古龍酸。
在同等條件下，采用實施例6維生素C二步單菌種發(fā)酵制備古龍酸的方法與傳統的維生素C二步混菌發(fā)酵法相比，古龍酸收率提高1.2百分點，即收率為92.2％，發(fā)酵周期縮短4％。
上述各實施例中培養(yǎng)基成分如下表。
表：上述各實施例的培養(yǎng)基情況如下
從上述實施例中可以看到，通過補加伴生菌活性蛋白，可使Vc二步發(fā)酵由產酸菌獨立完成，同時使發(fā)酵收率提高1.5至3.5個百分點，發(fā)酵周期縮短4至8小時，表明采用本發(fā)明方法提高了Vc二步發(fā)酵產酸菌生產能力。