一種嵌合抗原受體T細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用與流程

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導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專(zhuān)利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明涉及一種嵌合抗原受體T細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

嵌合抗原受體T細(xì)胞(Chimeric Antigen Receptor T cells，CART)是通過(guò)基因修飾的手段，使能特異性識(shí)別靶抗原的單克隆抗體的單鏈可變區(qū)

(scFv)表達(dá)在T細(xì)胞表面，同時(shí)scFv通過(guò)跨膜區(qū)與人工設(shè)計(jì)的T細(xì)胞胞內(nèi)的活化增殖信號(hào)域相耦連。這樣，單克隆抗體對(duì)靶抗原的特異性識(shí)別與T細(xì)胞的功能相結(jié)合，產(chǎn)生特異性的殺傷作用，而且CART能夠以非MHC限制性的方式殺傷靶細(xì)胞?，F(xiàn)CAR-T淋巴細(xì)胞技術(shù)已發(fā)展到了第三代。1989年，科學(xué)家Zelig Eshhar提出了CART的構(gòu)想，在隨后的CART技術(shù)發(fā)展中，主要經(jīng)過(guò)了3代的演化，第一代CAR由識(shí)別腫瘤表面抗原的單鏈抗體(scFv)抗原結(jié)合部和免疫受體酪氨酸活化基序構(gòu)成，胞外通過(guò)單鏈抗體(scFv)識(shí)別腫瘤標(biāo)志分子，如CD19，胞內(nèi)利用CD3分子ζ鏈傳遞信號(hào)，由于沒(méi)有協(xié)同刺激信號(hào)，T細(xì)胞增殖時(shí)間短，細(xì)胞因子分泌低，在臨床試驗(yàn)中，效果不理想。2011年，Carl June教授利用二代CART技術(shù)治療3例慢性淋巴細(xì)胞性白血病取得了非常好的效果，2例完全緩解，1例部分緩解；二代CART技術(shù)根據(jù)選用的協(xié)同刺激分子不同分為兩類(lèi)，一種為協(xié)同刺激分子CD28+CD3ζ，一種為協(xié)同刺激分子4-1BB+CD3ζ，即引入了共刺激的信號(hào)序列，可提高T細(xì)胞的細(xì)胞獨(dú)活性、增殖性與存活時(shí)間、促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放，這兩類(lèi)CART在臨床治療急性淋巴細(xì)胞性白血病時(shí)都取得了成功。CD28協(xié)同刺激信號(hào)促使T細(xì)胞快速擴(kuò)增，4-1BB信號(hào)促使T細(xì)胞擴(kuò)增、存活、持續(xù)存活時(shí)間更長(zhǎng)，結(jié)合CD28和4-1BB兩個(gè)分子在一個(gè)CAR分子結(jié)構(gòu)上的CART，稱(chēng)為三代CART，即同時(shí)在胞漿區(qū)串聯(lián)排列了CD28、4-1BB協(xié)同刺激分子和CD3ζ分子，基本模擬了T細(xì)胞正常發(fā)揮作用時(shí)受到的刺激信號(hào)，和二代載體相比，引入了雙共刺激的信號(hào)序列將具有更好的效果。

CART是近兩年取得顯著進(jìn)展的治療腫瘤的技術(shù)，該技術(shù)首先在治療以CD19為靶點(diǎn)的急性淋巴細(xì)胞性白血病和淋巴瘤上取得了成功，據(jù)諾華公司報(bào)道的臨床數(shù)據(jù)，利用CD19CART治療兒童B細(xì)胞性急性淋巴細(xì)胞性白血病，可達(dá)到93％的完全緩解率。目前，在臨床廣泛應(yīng)用中，用于治療白血病和淋巴瘤的CART載體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)皆為二代載體的結(jié)構(gòu)。盡管臨床治療中尤其是用于治療白血病時(shí)取得了非常好的效果，但是這些患者的入組條件較為嚴(yán)苛，對(duì)于病情非常嚴(yán)重的患者仍不能入組治療；另外，針對(duì)CD19的CART治療淋巴瘤時(shí)的完全緩解率約為30％-47％，仍存在繼續(xù)改進(jìn)提高的空間。因此，亟待進(jìn)一步增加CAR分子結(jié)構(gòu)胞漿區(qū)內(nèi)協(xié)同刺激分子的數(shù)量，以能更好模擬T細(xì)胞在生理和病理情況下自然活化的機(jī)制，促使細(xì)胞擴(kuò)增，殺傷腫瘤細(xì)胞，延長(zhǎng)體內(nèi)持續(xù)存活時(shí)間，提高CD19CART治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種嵌合抗原受體T細(xì)胞，表面表達(dá)嵌合抗原受體CD19CAR基因，其堿基序列如SEQ ID NO:3所示。

進(jìn)一步，所述嵌合抗原受體CD19CAR基因是由合成ScFV基因和合成3代CAR結(jié)構(gòu)基因通過(guò)重疊PCR進(jìn)行拼接。

進(jìn)一步，所述合成ScFV基因是通過(guò)PCR方法獲得編碼CD8信號(hào)肽、序列號(hào)CAA74659.1的重鏈氨基酸密碼子優(yōu)化為核苷酸、(G4S)₃鉸鏈區(qū)和序列號(hào)為

CAA74660.1的輕鏈氨基酸密碼子優(yōu)化為核苷酸序列的CD19單鏈抗體的ScFV基因的核苷酸片段，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。

進(jìn)一步，所述合成3代CAR結(jié)構(gòu)基因是通過(guò)PCR方法獲得編碼CD8鉸鏈區(qū)、CD28跨膜區(qū)、胞漿區(qū)、4-1BB胞漿區(qū)和CD3ζ胞漿區(qū)的核苷酸片段的CAR結(jié)構(gòu)基因的核苷酸片段，其堿基序列如SEQ ID NO:2所示。

本發(fā)明進(jìn)一步的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建3代慢病毒CAR載體：首先將合成ScFV基因或合成3代CAR結(jié)構(gòu)基因分別擴(kuò)增PCR，得到合成ScFV基因片段的PCR產(chǎn)物和合成3代CAR結(jié)構(gòu)基因片段的PCR產(chǎn)物；然后進(jìn)行重疊PCR將這兩個(gè)基因片段的PCR產(chǎn)物連接在一起，得到3代CAR結(jié)構(gòu)的CD19CAR基因；最后通過(guò)Pre-Lenti-EF1-MCS載體對(duì)CD19CAR基因酶切，連接，轉(zhuǎn)化，挑克隆，提質(zhì)粒，測(cè)序，得到序列正確的表達(dá)CD19CAR的慢病毒載體Pre-Lenti-EF1-CD19CAR；

(2)包裝CD19CAR慢病毒，感染T細(xì)胞，制備得到CART。

進(jìn)一步，步驟(1)中，用于所述擴(kuò)增PCR的引物為EcoRI-up序列如SEQ ID NO:4所示和BamHI-down序列如SEQ ID NO:5所示。

進(jìn)一步，步驟(1)中，用于所述重疊PCR的引物為Middle-R如SEQ ID NO:6所示和Middle-F如SEQ ID NO:7所示。

進(jìn)一步，步驟(1)中，測(cè)序引物為Pre-up-Seq，如SEQ ID NO:8所示和Pre-down-Seq，如SEQ ID NO:9所示。

進(jìn)一步，步驟(1)中，步驟(1)中，所述雙酶選自EcoRI-HF限制性?xún)?nèi)切酶和BamHI-HF限制性?xún)?nèi)切酶。

本發(fā)明進(jìn)一步的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種嵌合抗原受體T細(xì)胞在制備抗白血病和淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明在3代CD19CAR載體的結(jié)構(gòu)中加入了兩種協(xié)同刺激信號(hào)，構(gòu)建了慢病毒載體，并在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察了三代CD19CART的效果，證實(shí)了三代CD19CART能夠有效殺死腫瘤細(xì)胞。

附圖說(shuō)明

通過(guò)閱讀下文優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述，各種其他的優(yōu)點(diǎn)和益處對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將變得清楚明了。附圖僅用于示出優(yōu)選實(shí)施方式的目的，而并不認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。而且在整個(gè)附圖中，用相同的參考符號(hào)表示相同的部件。在附圖中：

圖1為CART載體設(shè)計(jì)的演化。

圖2為CD19CAR慢病毒載體構(gòu)建流程圖

圖3為ScFV基因和3代CAR結(jié)構(gòu)基因PCR產(chǎn)物電泳圖。其中，左邊為ScFV基因，中間為Marker(1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp)，右邊為3代CAR結(jié)構(gòu)基因。

圖4為重疊PCR產(chǎn)物電泳圖。其中，左邊為Marker(1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp)，右邊為CD19CAR基因(1728bp)。

圖5為CD19-CART的殺傷效果。

圖6為注射Raji淋巴瘤細(xì)胞后分別注射Control或CD19CART兩周后的小鼠肝臟表現(xiàn)。

圖7為小鼠生存曲線。

具體實(shí)施方式

下面將參照附圖更詳細(xì)地描述本公開(kāi)的示例性實(shí)施方式。雖然附圖中顯示了本公開(kāi)的示例性實(shí)施方式，然而應(yīng)當(dāng)理解，可以以各種形式實(shí)現(xiàn)本公開(kāi)而不應(yīng)被這里闡述的實(shí)施方式所限制。相反，提供這些實(shí)施方式是為了能夠更透徹地理解本公開(kāi)，并且能夠?qū)⒈竟_(kāi)的范圍完整的傳達(dá)給本領(lǐng)域的技術(shù)人員。

實(shí)施例1：Pre-Lenti-EF1-CD19CAR載體構(gòu)建

1、合成ScFV基因：通過(guò)PCR方法獲得編碼CD8信號(hào)肽、序列號(hào)CAA74659.1的重鏈氨基酸密碼子優(yōu)化為核苷酸、(G4S)₃鉸鏈區(qū)和序列號(hào)為CAA74660.1的輕鏈氨基酸密碼子優(yōu)化為核苷酸序列的CD19單鏈抗體的ScFV基因的核苷酸片段，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。

2、合成3代CAR結(jié)構(gòu)基因，通過(guò)PCR方法獲得編碼CD8鉸鏈區(qū)、CD28跨膜區(qū)、胞漿區(qū)、4-1BB胞漿區(qū)和CD3ζ胞漿區(qū)的核苷酸片段的CAR結(jié)構(gòu)基因的核苷酸片段，其堿基序列如SEQ ID NO:2所示。

3、將合成ScFV基因和3代CAR結(jié)構(gòu)基因通過(guò)重疊PCR進(jìn)行拼接，得到CD19CAR基因，如SEQ ID NO:3所示。具體過(guò)程如下：

(1)引物設(shè)計(jì)：使用序列分析軟件pDRAW32分析CD19CAR基因序列，單酶切位點(diǎn)EcoRI、BamHI適合用于基因克隆，能夠和Pre-Lenti-EF1-MCS載體的MCS(多克隆位點(diǎn))匹配，設(shè)計(jì)兩端引物如下：

EcoRI-up序列：CGGAATTC GCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGC，如SEQ ID NO:4所示；

BamHI-down序列：CGGGATCC TTAGCGAGGGGGCAGGGCCTG，如SEQ ID NO:5所示。用于重疊PCR的引物為：

Middle-R，GTCGTGGTGGGCTTCGCTGGTGAGGAGACGGTGACTGAGG，如SEQ ID NO:6所示。

Middle-F，CCTCAGTCACCGTCTCCTCACCAGCGAAGCCCACCACGAC，如SEQ ID NO:7所示。

(2)PCR重疊延伸：收到合成的基因和引物后，進(jìn)行PCR重疊延伸。

PCR體系如下(使用Toyobo的KOD Fx酶)：

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

PCR產(chǎn)物電泳：見(jiàn)圖3，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，膠回收(Biomiga，貨號(hào)：DC-3511-01)，定量PCR片段濃度后，進(jìn)行重疊PCR。

PCR體系見(jiàn)下：

PCR程序?yàn)椋?/p>

PCR產(chǎn)物電泳：見(jiàn)圖4，PCR產(chǎn)物凝膠電泳，膠回收，進(jìn)行后續(xù)克隆實(shí)驗(yàn)。

(3)酶切：

酶切反應(yīng)體系如下：

(4)回收酶切后產(chǎn)物：Biomiga膠回收試劑盒(貨號(hào)：DC-3511-01)。

(5)連接反應(yīng)：

根據(jù)載體nmole數(shù)：片段nmole數(shù)＝1：3，即

配制連接體系：

上述內(nèi)容各組分加至1.5mL離心管中，充分混勻；22℃水浴30min；

(5)轉(zhuǎn)化，涂氨芐平板：冰上將上述連接產(chǎn)物加入50μL感受態(tài)中，輕彈，靜置20min；42℃水浴熱激90秒；冰上5min；加500μL LB，37℃復(fù)蘇1h；4000rpm離心5min，留適量上清液，加樣槍重懸，涂氨芐抗性平板；37℃溫箱過(guò)夜。10、挑克隆，搖菌：連接反應(yīng)時(shí)設(shè)置一不加連接片段的陰性對(duì)照，第二日觀察可見(jiàn)加入CD19CAR片段的平板內(nèi)克隆數(shù)約50個(gè)左右，明顯比未加片段的克隆數(shù)(10個(gè))多，因此判斷連接成功。隨機(jī)挑取6個(gè)克隆，搖菌擴(kuò)增。

(6)質(zhì)粒提取：Biomiga無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(貨號(hào)：PD1220-02)。

(7)測(cè)序：選取濃度較高質(zhì)粒測(cè)序，引物為：

Pre-up-Seq：GGAGCCTACCTAGACTCAGC，如SEQ ID NO:8所示，

Pre-down-Seq：CAACCAGGATTTATACAAGG，如SEQ ID NO:9所示，

測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)，完全正確，得到了表達(dá)CD19CAR基因的慢病毒載體Pre-Lenti-EF1-CD19CAR，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

實(shí)施例2：細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)

1、慢病毒包裝

(1)293T細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5％CO₂孵箱內(nèi)，培養(yǎng)基為DMEM/10％FBS。

(2)包裝病毒前一天，胰酶消化293T細(xì)胞，1×10⁷細(xì)胞/孔種植10cm培養(yǎng)皿。

(3)轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，除了Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19CAR質(zhì)粒外，每種質(zhì)粒還要和包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.0G共轉(zhuǎn)染。其中Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19CAR使用5μg，psPAX2使用3.75μg，pMD2.0G使用1.25μg。轉(zhuǎn)染時(shí)，將以上三種質(zhì)粒的混合物加入500μl opti-MEM培養(yǎng)基內(nèi)，在另一個(gè)微型離心管內(nèi)將25μl Lipofectamine 2000試劑加入500μl opti-MEM培養(yǎng)基內(nèi)，然后將稀釋的轉(zhuǎn)染試劑逐滴加入稀釋的質(zhì)粒上方，混勻，離心，室溫靜置20min，最后將質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的混合物加入10cm培養(yǎng)皿內(nèi)，輕晃、混勻，放入孵箱。

(4)細(xì)胞轉(zhuǎn)染3天后，可以收獲病毒，將10ml含病毒培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入50ml離心管內(nèi)，4℃，1250rpm，5min，去除漂浮死亡的293T細(xì)胞，然后將含病毒培養(yǎng)基過(guò)濾，濃縮，分裝，-80℃凍存，和留存部分病毒測(cè)定滴度。

2、淋巴細(xì)胞分離

(1)抽血：在無(wú)菌的條件下抽取人體的靜脈血10ml。

(2)稀釋?zhuān)簩@得的血液用相同體積的1640培養(yǎng)基10ml稀釋。

(3)在離心管中加入10ml人淋巴細(xì)胞分離液(達(dá)科為生物工程有限公司)。

(4)用電動(dòng)移液槍將血液貼壁緩慢加入離心管中。

(5)將離心管放入離心機(jī)中，以700g，22℃離心25min。

(6)離心結(jié)束后，淋巴細(xì)胞在上層血漿層和分離液之間的白膜層中。

(7)用84滴管盡量將白膜層吸到另一支離心管中(加入30ml 1640培養(yǎng)基)，注意不要吸到分離液。

(8)250g，22℃，10分鐘。

(9)棄掉上層液體，用含IL2、滅活血清的1640培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)。

3、T細(xì)胞純化

(1)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，取1x10⁷個(gè)淋巴細(xì)胞于微型離心管中。

(2)250g，22℃，10分鐘。

(3)棄掉上層液體，80μL磁珠分離緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，加入20μl的CD3MicroBeads(美天旎)。

(4)4℃冰箱中放置1小時(shí)，保證充分結(jié)合。

(5)1小時(shí)后，在微型離心管中加入1mL的磁珠分離緩沖液，250g，5℃離心10分鐘。期間準(zhǔn)備過(guò)濾柱子，將過(guò)濾柱安放在磁鐵上，用500μl的緩沖液潤(rùn)洗(緩沖液隨著重力留下)。

(6)離心后細(xì)胞棄上清，500μl的緩沖液重懸，加入柱子，緩沖液隨著重力向下，細(xì)胞懸液流出后，柱子用500μl的緩沖液洗四次。

(7)將柱子從磁鐵上卸掉，用1mL緩沖液將T細(xì)胞沖出，至1ml離心管。

(8)250g，5℃離心10分鐘。

(9)含IL2、含滅活血清的1640培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)。

4、T細(xì)胞慢病毒感染

(1)純化T計(jì)數(shù)，2×10⁶個(gè)T細(xì)胞/孔(6孔板)種植，培養(yǎng)過(guò)夜后，加入MOI為2的對(duì)照病毒液(空載體包裝，Control)和Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19CAR病毒液，感染過(guò)夜。

(2)感染第二天，補(bǔ)加1ml新鮮培養(yǎng)基。

(3)感染第三天，T細(xì)胞已充分活化，增殖旺盛，此時(shí)將T細(xì)胞轉(zhuǎn)入25cm 2培養(yǎng)瓶。

(4)感染5天后，進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)。

5、殺傷實(shí)驗(yàn)

計(jì)數(shù)表達(dá)CD19分子的K562細(xì)胞(K562-CD19，通過(guò)慢病毒感染的方法建立的穩(wěn)定細(xì)胞系)，1×10⁴個(gè)K562-CD19細(xì)胞/孔(96孔板)；計(jì)數(shù)病毒感染的T細(xì)胞(Control病毒液感染的Control T細(xì)胞和Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19CAR病毒液感染的CD19CAR-T細(xì)胞)，按照效靶比10:1,5:1,2.5:1的比例加入K562-CD19細(xì)胞上層，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1.殺傷實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表(靶細(xì)胞：K562.CD19)

6、殺傷測(cè)量：通過(guò)測(cè)量死亡細(xì)胞釋放入細(xì)胞培養(yǎng)上清的LDH，來(lái)確定CAR-T細(xì)胞殺死K562-CD19靶細(xì)胞的效果。

(1)操作按照Promega試劑盒說(shuō)明書(shū)(CytoTox 96非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)，貨號(hào)：G1780)。

(2)步驟5中殺傷實(shí)驗(yàn)孵育過(guò)夜，約18h后，最大釋放孔加入10×細(xì)胞裂解液。

(3)2小時(shí)后，每孔取50μl上清，再加入50μl LDH酶底物，室溫靜置20分鐘后，酶標(biāo)儀測(cè)量492nm處吸光度OD492。

(4)殺傷率計(jì)算，計(jì)算公式為

實(shí)驗(yàn)孔為不同效靶比得到的OD492，效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)為Control T細(xì)胞或CD19CAR-T細(xì)胞的OD492，靶細(xì)胞自發(fā)為K562-CD19最小釋放，靶細(xì)胞最大為K562-CD19最大釋放。計(jì)算得到的殺傷率見(jiàn)圖5，靶細(xì)胞為K562表達(dá)CD19的細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞為對(duì)照(Control)T細(xì)胞和CD19-CART細(xì)胞，從圖5可知，CD19-CART細(xì)胞可以特異性殺傷表達(dá)CD19的K562細(xì)胞，表明Pre-Lenti-EF1-MCS-CD19CAR-T構(gòu)建成功。

實(shí)施例3：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1、小鼠品系：為NSG免疫缺陷小鼠品系(缺乏T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞功能)。2、腫瘤接種：采用Raji淋巴瘤細(xì)胞系，1x10⁶細(xì)胞/200ul PBS尾靜脈注射(6只小鼠)。

3、CART注射：Raji腫瘤細(xì)胞接種2天后，尾靜脈注射Control或CD19CART細(xì)胞(1x10⁷細(xì)胞/200ul PBS，一組3只小鼠)，見(jiàn)圖6。由圖6可知，對(duì)照CART不能有效抑制淋巴瘤細(xì)胞在肝臟的生長(zhǎng)(白色斑塊為淋巴瘤細(xì)胞形成的腫瘤)，CD19CART能有效抑制淋巴瘤。

4、每隔2天觀察，測(cè)量小鼠體重，直至CART細(xì)胞注射2周后，對(duì)照組(Control)小鼠開(kāi)始出現(xiàn)后肢癱瘓，陸續(xù)死亡，解剖觀察，記錄死亡時(shí)間，整理生存曲線，見(jiàn)圖7。由圖7可知，CD19CART明顯延長(zhǎng)了小鼠生存時(shí)間。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京普瑞金科技有限公司

<120> 一種嵌合抗原受體T細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用

<130> 2016

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 789

<212> DNA

<213> ScFV基因

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480

ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540

cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctca 789

<210> 2

<211> 939

<212> DNA

<213> CAR結(jié)構(gòu)基因

<400> 2

ccagcgaagc ccaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 60

tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 120

acgagggggc tggacttcgc cccacgcaaa attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 180

gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 240

cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 300

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 360

agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 420

aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc caaacggggc 480

agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 540

gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 600

gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 660

aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 720

gaccctgaga tggggggaaa gccgcagaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 780

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 840

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 900

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 939

<210> 3

<211> 1728

<212> DNA

<213> CD19 CAR基因

<400> 3