本發(fā)明涉及一株具有分泌IAA能力的內(nèi)生細(xì)菌。

背景技術(shù)：

內(nèi)生細(xì)菌是促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育最大的潛在微生物資源，目前，對(duì)植物根內(nèi)生細(xì)菌促生作用研究較多的是分泌植物激素的能力，主要包括分泌吲哚-3-乙酸(Indole-3-Acetic Acid，簡(jiǎn)稱IAA)、赤霉素(Gibberelin，主要指GA₁、GA₃)和細(xì)胞分裂素(Cytokinin，CTK)等，其中，IAA是最早發(fā)現(xiàn)的也是最常見的促進(jìn)植物生長(zhǎng)的激素之一，屬于天然植物生長(zhǎng)素的活性成分，目前研究較為深入。研究表明，在大豆根際中存在21％的細(xì)菌可以分泌IAA，而在根部可分泌IAA的內(nèi)生細(xì)菌比例高達(dá)34％。在玉米、甘蔗、油菜和其他作物的根部，也存在大量具有分泌IAA潛力的內(nèi)生細(xì)菌。東北黑土區(qū)是我國(guó)重要的商品糧生產(chǎn)基地，其主要生態(tài)特點(diǎn)是冬季氣溫低、時(shí)間長(zhǎng)，夏季作物生長(zhǎng)期雨熱同季。鑒于黑土區(qū)獨(dú)特的生態(tài)特點(diǎn)，許多非本土的微生物資源促生效果受到限制。因此，開展黑土區(qū)作物內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究，篩選適合東北地區(qū)的微生物菌種資源十分必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一株具有分泌IAA能力的內(nèi)生細(xì)菌及其應(yīng)用。

本發(fā)明的一株具有分泌IAA能力的內(nèi)生細(xì)菌，它為L(zhǎng)ysinibacillus endophyticus C9，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2016年10月26日，保藏號(hào)CGMCC No.1.15291。

該菌株應(yīng)用于促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育。

本發(fā)明的一株具有分泌IAA能力的內(nèi)生細(xì)菌為賴氨酸芽孢桿菌屬新種(Lysinibacillus.Endophyticus sp.nov.)，其英文命名描述如下：Lysinibacillus endophyticus(en.do.phy’ti.cus.Gr.pref.endo within；Gr.n.phyt plant.N.L.adj.endophyticus within plant,pertaining to the isolation from plant tissues)。

本發(fā)明的一株具有分泌IAA能力的內(nèi)生細(xì)菌它為L(zhǎng)ysinibacillus endophyticus C9，即下面所述的菌株C9^T。特征描述如下：

菌株C9^T革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體成桿狀，好氧，球狀芽孢，有周生鞭毛；在TSA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)2d，菌落呈圓形，中間稍凸起，表面光滑，不透明，淺黃色；菌落在NA和LA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。菌株C9^T的生長(zhǎng)溫度范圍為20-50℃，最適生長(zhǎng)溫度為30℃；在0-4.5％(w/v)的NaCl范圍內(nèi)生長(zhǎng)；pH生長(zhǎng)范圍為5-8，最適生長(zhǎng)pH為7.0。檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)包括：氧化酶、過氧化氫酶、硝酸鹽還原、產(chǎn)H₂S、產(chǎn)吲哚乙酸、Tween 40、Tween 60和明膠液化；檢測(cè)呈陰性反應(yīng)包括：亞硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用、Voges-Proskauer試驗(yàn)、七葉樹素水解、酪蛋白水解、淀粉水解、纖維素水解、脲酶水解、Tween 20和Tween 80。在API 50CHB試劑條上無糖發(fā)酵現(xiàn)象產(chǎn)生。利用API ZYM試劑條檢測(cè)酶活呈陽(yáng)性的包括：酯酶(C4)、類脂酯酶(C8)、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶；呈陰性的項(xiàng)目包括：堿性磷酸鹽酶、類脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶、纈氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、α-半乳糖甙酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖甙酶和β-巖藻糖甙酶。脂肪酸組成主要包括(＞10％)：iso-C_15:0，anteiso-C_15:0和anteiso-C_17:0；呼吸醌只為MK-7；磷酸類脂組成包括雙磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、2種未鑒定結(jié)構(gòu)磷脂(PL)和一種未鑒定的極性脂；細(xì)胞含內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(meso-diaminopimelic acid,meso-Dpm)為特征的氨基酸；G+C含量為37.9mol％。

菌株C9^T屬于賴氨酸芽孢桿菌屬的一個(gè)新種，命名為L(zhǎng)ysinibacillus endophyticus，典型菌株為C9^T，在中國(guó)普通微生物菌種保藏中心(CGMCC 1.15291)保藏。GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)為KP334990。

本發(fā)明包含以下有益效果：

本發(fā)明采用可培養(yǎng)方法，根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、大小和生長(zhǎng)時(shí)間等特征，在1/10NA上分離獲得內(nèi)生細(xì)菌菌株，利用改良Salkowski比色法測(cè)定內(nèi)生細(xì)菌分泌IAA能力，獲得具有促生能力菌株，選取分泌IAA能力＞10mg·mL^-1菌株進(jìn)行16S rRNA基因鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析和多相分類學(xué)鑒定。

得到內(nèi)生細(xì)菌菌株C9^T分泌生長(zhǎng)素能力為10.2μg·mL^-1。對(duì)C9^T進(jìn)一步進(jìn)行促生能力評(píng)價(jià)的結(jié)果表明該菌對(duì)大豆和小麥幼苗生長(zhǎng)均具有促生作用，表現(xiàn)為提高大豆株高3.6％，地下根表面積23.6％，地下根體積14.9％；提高小麥株高7.3％，地下根表面積88.9％，地下根體積120.5％。

附圖說明

圖1為菌株C9^T于30℃在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d的菌落形態(tài)圖：

圖2為菌株C9^T于30℃在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d的透射電鏡圖；

圖3為菌株C9^T的磷酸類脂薄層層析分析圖。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式的一株具有分泌IAA能力的內(nèi)生細(xì)菌，它為L(zhǎng)ysinibacillus endophyticus C9，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2016年10月26日，保藏號(hào)CGMCC No.1.15291。

本實(shí)施方式的具有分泌IAA能力的內(nèi)生細(xì)菌Lysinibacillus endophyticus C9獲取方式如下：

將1g表面徹底滅菌的玉米根部樣品(Zea mays cv.新墾5號(hào))剪成1-2cm小段，于無菌研缽中充分研磨，研磨過程可加入少量滅菌的石英砂和無菌水，然后用無菌水依次稀釋成濃度為10^-1、10^-2和10^-3的菌懸液；再分別取1mL上述稀釋的菌懸液涂布于1/10NA平板上，每個(gè)稀釋度3次重復(fù)，30℃培養(yǎng)7d；選取3次重復(fù)中菌落數(shù)較多的平板，根據(jù)形態(tài)、顏色、菌落大小等特征，挑取不同菌株，在NA平板上分離純化，將純化后的根內(nèi)生細(xì)菌接種NA斜面培養(yǎng)基，4℃保藏。

1、對(duì)上述篩選后保藏的菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列鑒定：

選擇分泌IAA能力＞10mg·mL^-1菌株為鑒定對(duì)象，采用菌落PCR鑒定方法，用接種環(huán)挑取待鑒定內(nèi)生細(xì)菌斜面保存菌株于15μL無菌水中，12000rpm離心5min，棄上清，再用15μL無菌水懸浮，重復(fù)一次，95℃水浴5min，置于冰上，以處理后菌懸液為PCR鑒定模板，用細(xì)菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGCTACCTTGTTACGACT T-3')擴(kuò)增得到目的基因片段。

PCR反應(yīng)體系采用10μL體系，體系如下：27F和1492R引物(50pmol)各0.1μL，待測(cè)菌懸液0.3μL，dNTP(2.5mM TaKaRa)1μL，rTaq buffer(TaKaRa)1μL，rTaq聚合酶(5U·μL^-1，TaKaRa)0.3μL，無菌水7.2μL，以不加菌懸液為對(duì)照。

擴(kuò)增條件為：94℃3min，94℃1min，55℃1min，72℃1min(28個(gè)循環(huán))，72℃5min。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，膠回收試劑盒(QIAEXⅡ Gel Extraction Kit(150)QIAGEN)純化PCR產(chǎn)物后，與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，LB平板37℃培養(yǎng)16-17h后，用含X-gal平板篩選含有插入DNA片段的白色轉(zhuǎn)化子，用滅菌牙簽挑白色單菌落于15μL無菌水中為克隆鑒定模板，以大腸桿菌質(zhì)粒引物M13-47(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)和RV-M(5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)為鑒定引物，擴(kuò)增條件同上，鑒定為陽(yáng)性克隆后，送測(cè)序公司雙向測(cè)序。

其中對(duì)菌株C9^T進(jìn)行的16S rRNA基因測(cè)序，得到長(zhǎng)度為1510bp的基因序列，將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為KP334990。再將得到的序列應(yīng)用EzBioCloud網(wǎng)站與已發(fā)表的典型菌株進(jìn)行在線分析，其同源性最高的菌株為L(zhǎng)ysinibacillus chungkukjangi NBRC 108948^T(相似度為98.1％)和Lysinibacillus sinduriensis DSM 27595^T(相似度為98.0％)，其余典型菌株的相似度均＜98.0％。采用鄰位連接法將菌株C9^T與同源性比對(duì)＞95％的典型菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，顯示菌株C9^T與賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)的各成員聚在一起，采用最大簡(jiǎn)約法和最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹獲得相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，因此，該菌可能是賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)的一個(gè)新種。

2、分子學(xué)分析

2.1(G+C)mol％測(cè)定

采用熔解溫度(Tm)法測(cè)定(G+C)mol％含量，測(cè)定E.coli JM109和菌株C9^T的Tm值分別為77.8℃和71.9℃，根據(jù)公式計(jì)算得到菌株C9^T的G+C含量為37.9mol％。

2.2菌株C9^T與相似菌株DNA同源性分析

在系統(tǒng)分類學(xué)上最相近的2株菌L.chungkukjangi NBRC 108948^T和L.sinduriensis DSM 27595^T與菌株C9^T的16S rRNA基因相似性＞98％，為了進(jìn)一步區(qū)分，進(jìn)行菌株C9^T與2株相似菌的DNA-DNA雜交試驗(yàn)，雜交結(jié)果顯示菌株C9^T與L.chungkukjangi NBRC 108948^T和L.sinduriensis DSM 27595^T同源性分別為52.0±0.7％和46.1±1.1％，均＜70％。

通過16S rRNA基因比對(duì)，形態(tài)學(xué)觀察和生理生化等特征分析，菌株屬于賴氨酸芽孢桿菌屬，并在菌落形態(tài)、化學(xué)分類特征等方面與該屬其他典型菌株存在差異(表1)，且與2株相似典型菌株的DNA同源性均低于70％，因此，確定確定菌株C9^T屬于賴氨酸芽孢桿菌屬的一個(gè)新種，命名為L(zhǎng)ysinibacillus endophyticus，典型菌株為C9^T，并將其保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2016年10月26日，保藏號(hào)CGMCC No.1.15291。

所述的C9^T菌株形態(tài)學(xué)觀察主要包括培養(yǎng)特征觀察、光學(xué)顯微鏡觀察和透射電鏡觀察。

菌株C9^T革蘭氏染色陽(yáng)性；菌體成桿狀，長(zhǎng)約1.1-1.4μm，寬約0.5-0.8μm；好氧；球狀芽孢；有周生鞭毛；在TSA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)2d，菌落呈圓形，中間稍凸起，表面光滑，不透明，淺黃色(如圖1和圖2)。菌落在NA和LA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。

C9^T菌株生理生化特征：菌株C9^T的生長(zhǎng)溫度范圍為20-50℃，最適生長(zhǎng)溫度為30℃；pH生長(zhǎng)范圍為5-8，最適生長(zhǎng)pH為7.0；在0-4.5％(w/v)的NaCl范圍內(nèi)生長(zhǎng)。菌株C9^T氧化酶、過氧化氫酶、硝酸鹽還原、產(chǎn)H₂S、產(chǎn)吲哚乙酸、Tween 40、Tween 60和明膠液化檢測(cè)呈陽(yáng)性；亞硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用、Voges-Proskauer試驗(yàn)、七葉樹素水解、酪蛋白水解、淀粉水解、纖維素水解、脲酶水解、Tween 20和Tween 80活性檢測(cè)為陰性。菌株C9^T在API 50CHB試劑條上無糖發(fā)酵現(xiàn)象產(chǎn)生。利用API ZYM試劑條檢測(cè)酶活呈陽(yáng)性的包括：酯酶(C4)、類脂酯酶(C8)、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶；呈陰性的項(xiàng)目包括：堿性磷酸鹽酶、類脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶、纈氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、α-半乳糖甙酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖甙酶和β-巖藻糖甙酶。

表1菌株C9^T與相似菌株的不同表現(xiàn)特征

注：+，陽(yáng)性；－，陰性。

對(duì)本實(shí)施方式篩選得到的進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)組分分析：

1)全細(xì)胞脂肪酸組分析：

菌株C9^T的脂肪酸組成主要包括iso-C_15:0(34.7％)，anteiso-C_15:0(33.6％)，anteiso-C_17:0(10.6％)，iso-C_16:0(6.0％)，C_16:1ω7c alcohol(4.2％)，iso-C_14:0(2.3％)，iso-C_17:0(2.1％)，C_16:1ω11c(2.0％)和summed feature 4(1.8％)，主要脂肪酸成分(＞10％)與Lysinibacillus屬內(nèi)近緣菌株相似，比較見表2。

表2菌株C9^T與Lysinibacillus屬內(nèi)近緣菌株全細(xì)胞脂肪酸含量組成比較

注：“-”表示＜1％或未被檢測(cè)到。

2)呼吸醌類型：

菌株C9^T細(xì)胞主要呼吸醌為MK-7。

3)細(xì)胞壁氨基酸類型和全細(xì)胞水解液糖型：

菌株C9^T的細(xì)胞含內(nèi)消旋-二氨基庚二酸(meso-diaminopimelic acid,meso-Dpm)為特征的氨基酸。目前，發(fā)現(xiàn)的meso-Dpm的肽聚糖類型為A1γ和3種變型的A4γ(A31.1，A31.2和A31.3，www.peptidoglycantypes.info)，而變型的A4γ僅在Brachybacterium，Devriesea和Dermabacter屬中被發(fā)現(xiàn)，而菌株C9^T與Lysinibacillus親緣關(guān)系最近，所以，其細(xì)胞壁氨基酸類型可能為A1γ，鑒定結(jié)果區(qū)別于Lysinibacillus屬的其他典型菌株。

全細(xì)胞水解液糖型主要為核糖、葡萄糖和半乳糖。

4.3.4磷酸類脂分析：

菌株C9^T的磷酸類脂組成包括雙磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、2種未鑒定結(jié)構(gòu)磷脂(PL)和一種未鑒定的極性脂(圖3)。

對(duì)本實(shí)施方式的內(nèi)生細(xì)菌菌株C9^T分泌IAA能力測(cè)定：采用改良Salkowski比色法測(cè)定獲得的內(nèi)生細(xì)菌菌株分泌IAA能力。先用接種環(huán)挑取斜面保存分離菌株于40μL無菌水中，渦旋混勻，即為待測(cè)菌株菌懸液，取待測(cè)菌懸液10μL于含色氨酸NA液體培養(yǎng)基1.5mL的離心管中(100mg·mL^-1色氨酸)，每個(gè)離心管含有1mL培養(yǎng)基，每菌株重復(fù)3次，取1mL無菌水加入色氨酸NA液體培養(yǎng)基中為對(duì)照，置于30℃搖床，180rpm振蕩培養(yǎng)7d。培養(yǎng)后將菌懸液10000rpm離心10min，取上清液100μL加入酶標(biāo)板中，再加入200μL Salkowski比色液，避光靜置反應(yīng)35min，采用雙波長(zhǎng)測(cè)定法(OD₄₉₀/OD₆₄₀)測(cè)定其OD₄₉₀值。利用吸光值線性公式換算各菌株IAA濃度含量。得到內(nèi)生細(xì)菌菌株C9^T分泌生長(zhǎng)素能力為10.2μg·mL^-1。對(duì)內(nèi)生細(xì)菌菌株C9^T進(jìn)一步進(jìn)行促生能力評(píng)價(jià)的結(jié)果表明該菌對(duì)大豆和小麥幼苗生長(zhǎng)均具有促生作用，表現(xiàn)為提高大豆株高3.6％，地下根表面積23.6％，地下根體積14.9％；提高小麥株高7.3％，地下根表面積88.9％，地下根體積120.5％。

序列表

<110> 中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所

<120>一株具有分泌IAA能力的內(nèi)生細(xì)菌及其應(yīng)用

<160>4

<210>1

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>27F引物。

<400> 1

AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 20

<210>2

<211>19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>1492R引物。

<400> 2

GGCTACCTTGTTACGACTT 19

<210>3

<211>24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>M13-47引物。

<400> 3

CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 24

<210>4

<211>24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>RV-M引物。

<400> 4

GAGCGGATAACA ATTTCACACAGG 24