本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及可特異結(jié)合CD30蛋白的單克隆抗體UMAB256、產(chǎn)生所述單克隆抗體的細(xì)胞株及應(yīng)用該抗體用于診斷的方法和用途。

背景技術(shù)：

CD30是腫瘤壞死因子受體超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF)成員之一，雙名TNFRSF8，是一種分子量為120kDa的細(xì)胞表面I型跨膜糖蛋白。CD30廣泛分布于活化T細(xì)胞、B細(xì)胞、傳染性單核細(xì)胞癥的異型淋巴細(xì)胞、未分化大細(xì)胞等，參與細(xì)胞活化和分化。通過(guò)參與NF-κB等活化信號(hào)的傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫的激活過(guò)程中。CD30可與CD153(CD30L)結(jié)合，限制自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞增殖，保護(hù)機(jī)體免遭自身免疫。

在多項(xiàng)淋巴瘤發(fā)病過(guò)程的研究中發(fā)現(xiàn)，CD30的表達(dá)可顯著升高于霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)和間變性大細(xì)胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphomas，ALCL)，而低表達(dá)于非病理狀態(tài)下活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞表面。正常細(xì)胞不表達(dá)白細(xì)胞分化抗原30(CD30)。近年來(lái)針對(duì)CD30的靶向治療已成為一個(gè)潛在的治療措施，研究較多的是CD30抗體及其相關(guān)藥物的開(kāi)發(fā)。使其成為一個(gè)頗具潛力的淋巴細(xì)胞惡性腫瘤免疫治療的分子靶點(diǎn)。目前臨床上常用免疫組織化學(xué)(IHC)病理實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中蛋白的表達(dá)狀況，然而IHC實(shí)驗(yàn)的核心為特異性結(jié)合蛋白的單克隆抗體，其性能的優(yōu)劣直接決定著整個(gè)檢測(cè)的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結(jié)合特異性較高的針對(duì)CD30蛋白的單克隆抗體對(duì)IHC檢測(cè)CD30表達(dá)水平具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)合特異性較高的CD30蛋白的單克隆抗體，及其在制備用于檢測(cè)CD30蛋白的免疫檢測(cè)工具中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞株，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱為CGMCC)，保藏日期為2016年11月22日，保藏編號(hào)為CGMCC No.13287。

本發(fā)明還提供了一種特異性結(jié)合CD30蛋白的單克隆抗體UMAB256，由上述雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。

本發(fā)明所述單克隆抗體的制備方法如下：

(1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)CD30ORF核苷酸序列(CD30ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，1788bp；CD30氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)

設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增CD30ORF第1222bp位到第1785bp位序列，基因兩側(cè)分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)SgfI和MluI，插入表達(dá)載體pET23a-N-His，構(gòu)建CD30氨基酸序列第408位到第595位的重組表達(dá)質(zhì)粒pET23a-N-His-rCD30；上游擴(kuò)增引物序列，SEQ ID NO.3:CACGCGATCGCCCACCGGAGGGCCTGCAGG下游擴(kuò)增引物序列SEQ ID NO.4:ACCGACGCGTCTACTTTCCAGAGGCAGCTGT

(2)CD30重組蛋白的表達(dá)與純化：將CD30重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli細(xì)胞，裂解離心獲得上清，鎳柱親和層析柱純化，獲得純化的CD30重組蛋白；

(3)單克隆抗體的篩選與制備：采用上述純化的CD30重組蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，有限稀釋法獲得單克隆，ELISA法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，獲得能分泌抗CD30特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為UMAB256，亞型鑒定為IgG1；通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)基制備抗體，通過(guò)親和層析柱純化獲得CD30單克隆抗體UMAB256。分別通過(guò)Western Blot、免疫組化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該單克隆抗體的靈敏度和特異性。

進(jìn)一步采用OriGene高密度蛋白芯片對(duì)上述單克隆抗體的特異性進(jìn)行驗(yàn)證：OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000個(gè)HEK293T細(xì)胞蛋白過(guò)表達(dá)裂解物，每種蛋白裂解液在芯片上具有兩個(gè)拷貝的重復(fù)。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘蛋白裂解液的定位可以通過(guò)Excel文件進(jìn)行準(zhǔn)確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個(gè)亞矩陣，每個(gè)亞矩陣上有一些參照，通過(guò)參照，可以定量每個(gè)芯片點(diǎn)上蛋白的含量，監(jiān)控每次免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)的重復(fù)性，以及定位陽(yáng)性信號(hào)的方向。

本發(fā)明將所述單克隆抗體UMAB256與上述芯片雜交并確定陽(yáng)性信號(hào)位點(diǎn)，結(jié)果顯示本發(fā)明所述單克隆抗體UMAB256特異性結(jié)合CD30蛋白，而與其他蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。

本發(fā)明還提供了單克隆抗體UMAB256在制備用于檢測(cè)CD30蛋白的免疫檢測(cè)工具中的應(yīng)用。

具體地，所述免疫檢測(cè)工具為試劑盒、芯片或試紙。

在具體的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種免疫組化檢測(cè)試劑盒，包括上述單克隆抗體UMAB256，可檢測(cè)組織細(xì)胞中CD30的表達(dá)狀況。

本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體在制備用于標(biāo)記腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用。其中所述腫瘤具體是指腫瘤細(xì)胞的增殖與CD30的表達(dá)密切相關(guān)的腫瘤，包括但不限于間變性大細(xì)胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞株(保藏編號(hào)為CGMCC No.13287)，以及由此雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體UMAB256。本發(fā)明還提供了單克隆抗體UMAB256在制備用于檢測(cè)CD30蛋白的免疫檢測(cè)工具中的應(yīng)用，含單克隆抗體UMAB256的免疫組化試劑盒，以及單克隆抗體UMAB256在制備用于標(biāo)記腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明所述單克隆抗體可與CD30蛋白特異性結(jié)合，而與細(xì)胞內(nèi)其他蛋白無(wú)交叉反應(yīng)，顯著提高了CD30蛋白免疫檢測(cè)的特異性、準(zhǔn)確性和可靠性，真實(shí)反映腫瘤組織中CD30蛋白表達(dá)水平，可應(yīng)用于間變性大細(xì)胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。

保藏信息

用于保藏的雜交瘤細(xì)胞株UMAB256的分類命名為：CD30鼠單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；

保藏單位全稱：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；

保藏單位簡(jiǎn)稱：CGMCC；

保藏單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；

保藏日期：2016年11月22日；

保藏編號(hào)：CGMCC No.13287。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。

圖1示實(shí)施例1克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)如圖，其中底紋部分為ORF區(qū)；

圖2示實(shí)施例2重組CD30蛋白Western blot檢測(cè)結(jié)果圖，以anti-HIS檢測(cè)重組CD30蛋白在E.coli細(xì)胞中的表達(dá)，其中左側(cè)泳道為轉(zhuǎn)染空載體的E.Coli細(xì)胞裂解液為抗原的檢測(cè)結(jié)果、右側(cè)泳道為轉(zhuǎn)染pET23a-N-His-rCD30質(zhì)粒的E.coli細(xì)胞裂解液抗原的檢測(cè)結(jié)果；

圖3示實(shí)施例2重組CD30蛋白SDS-PAGE結(jié)果圖，用鎳柱親和層析柱純化重組CD30蛋白，純化后的蛋白通過(guò)SDS-PAGE膠電脈、考馬斯亮藍(lán)染色；

圖4示實(shí)施例3以單克隆抗體UMAB256識(shí)別完整的CD30(Full length CD30,CD30-FL)蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果圖。泳道1為轉(zhuǎn)染pCMV6-Entry的細(xì)胞裂解液；泳道2為轉(zhuǎn)染pCMV6-CD30-FL的細(xì)胞裂解液；

圖5示實(shí)施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人淋巴瘤組織免疫組化結(jié)果圖(一抗為CD30單克隆抗體UMAB256)；

圖6示實(shí)施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的正常人扁桃體組織免疫組化結(jié)果圖(一抗為CD30單克隆抗體UMAB256)；

圖7示實(shí)施例5OriGene蛋白芯片鑒定結(jié)果圖(一抗為CD30單抗UMAB256，1:100；二抗為DyLight649-conjugated AffiniPure Fragment Goat-anti-Mouse IgG，1:400)。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1、CD30重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以從美國(guó)傲銳東源生物科技有限公司獲得的質(zhì)粒RC219819(含CD30 ORF 1788bp)為模板，設(shè)計(jì)兩條引物并分別引入酶切位點(diǎn)SgfI和MluI，克隆入表達(dá)載體pET23a-N-His，建立CD30重組表達(dá)質(zhì)粒。克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)如圖1所示。

實(shí)施例2、CD30重組蛋白的表達(dá)與純化

1、轉(zhuǎn)化E.coli細(xì)胞：將100ul感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化后加入質(zhì)粒DNA輕混勻，冰浴30min后42℃熱激90s，然后將其繼續(xù)冰浴1-2min。在超凈臺(tái)內(nèi)加入500ul新鮮無(wú)抗LB培養(yǎng)基，于37℃搖床孵育45min后取適量菌液均勻涂布于含抗生素的平板上，將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。

2、裂解細(xì)胞：挑取單克隆于新鮮培養(yǎng)基中，37℃、200rpm培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.4～0.6時(shí)加入IPTG(終濃度1mM)誘導(dǎo)培養(yǎng)7h。離心收集菌體，然后用裂解緩沖液重懸菌體，超聲破碎20min后于4℃下12000rpm離心20min，收集上清。取少量上清蛋白用anti-His抗體做WB鑒定，見(jiàn)圖2。

3、鎳柱親和層析柱純化：用緩沖液平衡鎳柱，將上清用0.45μm濾膜過(guò)濾后上樣并收集流出，用緩沖液淋洗去除未結(jié)合的蛋白，最后用含不同濃度咪唑的洗脫液洗脫，分別收集后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，將符合要求的洗脫蛋白合并并加入10％甘油，純化后的重組CD30蛋白用SDS-PAGE鑒定，見(jiàn)圖3。

由圖2結(jié)果可見(jiàn)，轉(zhuǎn)染pET23a-N-His-rCD30質(zhì)粒的E.coli細(xì)胞裂解液中WB檢測(cè)后在～25kD處有明顯的特異條帶，與CD30蛋白氨基酸第408到595位的實(shí)際分子量基本相符。表明細(xì)胞中重組CD30蛋白特異表達(dá)。

由圖3結(jié)果可見(jiàn)，純化的蛋白在PAGE膠～25kD處有明顯的特異條帶，與CD30蛋白氨基酸第408到595位的實(shí)際分子量基本相符。表明已獲得了純度較好的CD30重組蛋白。

實(shí)施例3、CD30單克隆抗體的制備與篩選

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用重組產(chǎn)生的純化的CD30蛋白片段用于對(duì)Balb/c小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)進(jìn)行免疫。具體方法如下：

1、動(dòng)物免疫：經(jīng)過(guò)純化的CD30抗原以完全弗氏佐劑乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周齡Balb/c小鼠，免疫劑量為50μg/只，間隔兩周后進(jìn)行第二次免疫，以不完全弗氏佐劑乳化，免疫劑量為50μg/只。免疫兩次后取尾血以ELISA法梯度稀釋測(cè)定血清效價(jià)；根據(jù)結(jié)果確定是否加強(qiáng)免疫，選取抗體效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

2、細(xì)胞融合：骨髓瘤細(xì)胞采用Balb/c來(lái)源的sp2/0，融合時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；取已免疫小鼠脾臟，制成淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液；小鼠脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％PEG(PH 8.0)1mL，加入不完全培養(yǎng)基及其余終止液，離心棄上清后加入HAT培養(yǎng)基懸浮混勻，MC定容到50mL，分裝到3.5cm培養(yǎng)皿中，放于濕盒中，置于37℃、5％CO₂恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

3、篩選和克?。喝诤?-10天內(nèi)挑選細(xì)胞克隆，使用CD30純化重組蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)試。標(biāo)記細(xì)胞株號(hào)。對(duì)陽(yáng)性孔細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋，每次有限稀釋后5-6天測(cè)定ELISA值，挑取OD280陽(yáng)性值較高的單克隆孔進(jìn)行有限稀釋，直至ELISA測(cè)定96孔板全板結(jié)果為陽(yáng)性。挑取陽(yáng)性值高的單克隆定株。其對(duì)應(yīng)融合板細(xì)胞株為UMAB256。

4、腹水單抗的制備與純化：10-12周齡的雄性Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1mL注射器腹腔注射經(jīng)PBS洗滌重懸的單克隆細(xì)胞懸液，細(xì)胞用量為5×10⁶/只，每株抗體打2只小鼠。待小鼠腹水積聚后收集腹水，離心取上清，親和層析法進(jìn)行腹水純化，根據(jù)抗體亞型選擇相應(yīng)柱料，細(xì)胞株UMAB256產(chǎn)生的單抗為IgG1，采用protein G進(jìn)行純化。純化后的單抗?jié)舛葴y(cè)定、WB檢測(cè)、分裝、凍存在-20℃。其中WB檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4結(jié)果可見(jiàn)，泳道2在分子量約100kD處有特異的條帶，表明單克隆抗體UMAB256能特異地Western blot檢測(cè)完整的全長(zhǎng)CD30蛋白。

實(shí)施例4、單克隆抗體UMAB256為一抗的免疫組化檢測(cè)

(1)、實(shí)驗(yàn)方法：

1、取福爾馬林固定的人淋巴瘤組織和正常人的扁桃體組織塊進(jìn)行石蠟包埋，使用Finesse組織切片機(jī)進(jìn)行切片，組織厚度為6μm。

2、脫蠟與水化：分析純二甲苯3×10min，無(wú)水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去離子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修復(fù)液(0.01M，pH6.0枸櫞酸鈉緩沖液)高壓鍋高壓熱修復(fù)3min，待高壓鍋溫度降至約90℃時(shí)，打開(kāi)高壓鍋，取出標(biāo)本，然后自然冷卻至室溫。去離子水浸泡3min×3次。

4、使用3％過(guò)氧化氫滅活組織內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫靜置10min。去離子水浸泡5min×3次。

5、加上封閉液(PBS+5％脫脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封閉液，勿沖洗，加入CD30單抗(UMAB256)，稀釋比：1:150，使用封閉液進(jìn)行稀釋。置于濕盒中，37℃孵育60min。PBST(0.1％Tween-20)洗滌2次，每次洗滌5min。PBST(0.02％Tween-20)洗滌1次，每次洗滌5min。

7、滴加Polink-試劑盒2(Catlog No.D37-15)試劑1，37℃孵育10-20分鐘。使用PBS洗滌3次，每次5min。滴加Polink-2試劑盒(Catlog No.D37-15)試劑2，37℃孵育10-20分鐘，使用PBS洗滌3次，每次5min。

8、應(yīng)用DAB溶液(中杉金橋ZLI-9019)顯色，顯色3～10min。蒸餾水洗滌。

9、蘇木精復(fù)染細(xì)胞核2min，蒸餾水漂洗，1％鹽酸分化。蒸餾水漂洗3次，室溫靜置1min。

10、脫水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5min x 3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性樹(shù)膠封片。

11、鏡檢，見(jiàn)圖5-6。

(2)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由圖5-6結(jié)果可見(jiàn)，在人淋巴瘤組織和正常人的扁桃體組織中可見(jiàn)到特異性膜染色。結(jié)果與CD30在細(xì)胞內(nèi)的定位及組織表達(dá)特異性一致，表明單克隆抗體UMAB256可用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD30蛋白的水平。

實(shí)施例5、單克隆抗體UMAB256的特異性檢測(cè)

OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000個(gè)HEK293T細(xì)胞蛋白過(guò)表達(dá)裂解物，每種蛋白裂解液在芯片上具有兩個(gè)拷貝的重復(fù)。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘蛋白裂解液的定位可以通過(guò)Excel文件進(jìn)行準(zhǔn)確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個(gè)亞矩陣，每個(gè)亞矩陣上有一些參照，通過(guò)參照，可以定量每個(gè)芯片點(diǎn)上蛋白的含量，監(jiān)控每次免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)的重復(fù)性，以及定位陽(yáng)性信號(hào)的方向。以下為使用OriGene蛋白(OriGene Cat PA100001)芯片進(jìn)行UMAB256抗體鑒定實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法：

1、將一張蛋白芯片放在50mL離心管中，使用40mL去離子水浸潤(rùn)芯片，置于搖床上，室溫混合30分鐘。棄掉去離子水，使用10mLPBST平衡芯片。室溫處理10分鐘。

2、向50mL離心管中加入40mL5％脫脂牛奶(用PBST進(jìn)行稀釋)置于搖床上，室溫封閉30分鐘。

3、使用封閉液(5％脫脂牛奶)稀釋一抗UMAB256，稀釋比列為1:100。

4、將潔凈的封口膜粘貼到實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，滴加250-300μL一抗在封口膜上。

5、將蛋白芯片從封閉液中抽出，將蛋白芯片NC膜的一面朝下，從芯片的一邊接觸抗體，慢慢滑下，依靠液體表面張力，抗體將慢慢浸潤(rùn)芯片NC膜，直至整張NC膜浸潤(rùn)在一抗溶液中。整個(gè)操作過(guò)程避免產(chǎn)生氣泡。將芯片移到4℃環(huán)境下，靜置，一抗孵育過(guò)夜。在芯片上加蓋培養(yǎng)皿蓋，其上黏附一張濕紙巾，以防止長(zhǎng)時(shí)間孵育導(dǎo)致抗體蒸發(fā)。

6、第二天將芯片移至50mL離心管中，使用PBST漂洗芯片兩次，去除多余的抗體。使用40mL PBST(0.1％Tween-20)洗滌芯片，置于搖床上混合均勻，洗滌三次，每次洗滌5min。

7、使用封閉液(5％脫脂牛奶)稀釋二抗DyLight649-conjugated AffiniPure Fragment Goat-anti-Mouse IgG，稀釋比例為1:400。

8、按照上述步驟4，步驟5進(jìn)行二抗孵育操作。室溫孵育1小時(shí)。在芯片上方用鋁箔紙遮蓋，以防止發(fā)生信號(hào)漂白。

9、按照上述步驟6，使用PBST洗滌芯片。

10、使用去離子水沖洗芯片，以去除殘余的鹽分和變性劑。

11、室溫干燥芯片，確保芯片完全干燥。

12、使用芯片掃描儀讀取熒光信號(hào)。

13、根據(jù)BSA-Cy3以及BSA-Cy5確定芯片方向以及陽(yáng)性信號(hào)的位點(diǎn)。

14、根據(jù)陽(yáng)性信號(hào)位點(diǎn)找出對(duì)應(yīng)蛋白裂解液ID，根據(jù)裂解液數(shù)據(jù)庫(kù)信息，查找到對(duì)應(yīng)蛋白名稱，NCBI錄入號(hào)(accession number)，蛋白ID，蛋白大小等信息。

結(jié)果如圖7所示，單抗UMAB256在OriGene蛋白芯片上能特異地識(shí)別CD30蛋白，表明單抗UMAB256的特異性較好。

SEQUENCE LISTING

<110>無(wú)錫傲銳東源生物科技有限公司

<120>抗CD30蛋白單克隆抗體及其用途

<210> 1

<211>1788

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

ORIGIN

//

1 ATGCGCGTCC TCCTCGCCGC GCTGGGACTG CTGTTCCTGG GGGCGCTACG AGCCTTCCCA

61 CAGGATCGAC CCTTCGAGGA CACCTGTCAT GGAAACCCCA GCCACTACTA TGACAAGGCT

121 GTCAGGAGGT GCTGTTACCG CTGCCCCATG GGGCTGTTCC CGACACAGCA GTGCCCACAG

181 AGGCCTACTG ACTGCAGGAA GCAGTGTGAG CCTGACTACT ACCTGGATGA GGCCGACCGC

241 TGTACAGCCT GCGTGACTTG TTCTCGAGAC GACCTCGTGG AGAAGACGCC GTGTGCATGG

301 AACTCCTCCC GTGTCTGCGA ATGTCGACCC GGCATGTTCT GTTCCACGTC TGCCGTCAAC

361 TCCTGTGCCC GCTGCTTCTT CCATTCTGTC TGTCCGGCAG GGATGATTGT CAAGTTCCCA

421 GGCACGGCGC AGAAGAACAC GGTCTGTGAG CCGGCTTCCC CAGGGGTCAG CCCTGCCTGT

481 GCCAGCCCAG AGAACTGCAA GGAACCCTCC AGTGGCACCA TCCCCCAGGC CAAGCCCACC

541 CCGGTGTCCC CAGCAACCTC CAGTGCCAGC ACCATGCCTG TAAGAGGGGG CACCCGCCTC

601 GCCCAGGAAG CTGCTTCTAA ACTGACGAGG GCTCCCGACT CTCCCTCCTC TGTGGGAAGG

661 CCTAGTTCAG ATCCAGGTCT GTCCCCAACA CAGCCATGCC CAGAGGGGTC TGGTGATTGC

721 AGAAAGCAGT GTGAGCCCGA CTACTACCTG GACGAGGCCG GCCGCTGCAC GGCCTGCGTG

781 AGCTGTTCTC GAGATGACCT TGTGGAGAAG ACGCCATGTG CATGGAACTC CTCCCGCACC

841 TGCGAATGTC GACCTGGCAT GATCTGTGCC ACATCAGCCA CCAACTCCTG TGCCCGCTGT

901 GTCCCCTACC CAATCTGTGC AGCAGAGACG GTCACCAAGC CCCAGGATAT GGCTGAGAAG

961 GACACCACCT TTGAGGCGCC ACCCCTGGGG ACCCAGCCGG ACTGCAACCC CACCCCAGAG

1021 AATGGCGAGG CGCCTGCCAG CACCAGCCCC ACTCAGAGCT TGCTGGTGGA CTCCCAGGCC

1081 AGTAAGACGC TGCCCATCCC AACCAGCGCT CCCGTCGCTC TCTCCTCCAC GGGGAAGCCC

1141 GTTCTGGATG CAGGGCCAGT GCTCTTCTGG GTGATCCTGG TGTTGGTTGT GGTGGTCGGC

1201 TCCAGCGCCT TCCTCCTGTG CCACCGGAGG GCCTGCAGGA AGCGAATTCG GCAGAAGCTC

1261 CACCTGTGCT ACCCGGTCCA GACCTCCCAG CCCAAGCTAG AGCTTGTGGA TTCCAGACCC

1321 AGGAGGAGCT CAACGCAGCT GAGGAGTGGT GCGTCGGTGA CAGAACCCGT CGCGGAAGAG

1381 CGAGGGTTAA TGAGCCAGCC ACTGATGGAG ACCTGCCACA GCGTGGGGGC AGCCTACCTG

1441 GAGAGCCTGC CGCTGCAGGA TGCCAGCCCG GCCGGGGGCC CCTCGTCCCC CAGGGACCTT

1501 CCTGAGCCCC GGGTGTCCAC GGAGCACACC AATAACAAGA TTGAGAAAAT CTACATCATG

1561 AAGGCTGACA CCGTGATCGT GGGGACCGTG AAGGCTGAGC TGCCGGAGGG CCGGGGCCTG

1621 GCGGGGCCAG CAGAGCCCGA GTTGGAGGAG GAGCTGGAGG CGGACCATAC CCCCCACTAC

1681 CCCGAGCAGG AGACAGAACC GCCTCTGGGC AGCTGCAGCG ATGTCATGCT CTCAGTGGAA

1741 GAGGAAGGGA AAGAAGACCC CTTGCCCACA GCTGCCTCTG GAAAGTAG

<210> 2

<211>595

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 2

ORIGIN

//

1 MRVLLAALGL LFLGALRAFP QDRPFEDTCH GNPSHYYDKA VRRCCYRCPM GLFPTQQCPQ

61 RPTDCRKQCE PDYYLDEADR CTACVTCSRD DLVEKTPCAW NSSRVCECRP GMFCSTSAVN

121 SCARCFFHSV CPAGMIVKFP GTAQKNTVCE PASPGVSPAC ASPENCKEPS SGTIPQAKPT

181 PVSPATSSAS TMPVRGGTRL AQEAASKLTR APDSPSSVGR PSSDPGLSPT QPCPEGSGDC

241 RKQCEPDYYL DEAGRCTACV SCSRDDLVEK TPCAWNSSRT CECRPGMICA TSATNSCARC

301 VPYPICAAET VTKPQDMAEK DTTFEAPPLG TQPDCNPTPE NGEAPASTSP TQSLLVDSQA

361 SKTLPIPTSA PVALSSTGKP VLDAGPVLFW VILVLVVVVG SSAFLLCHRR ACRKRIRQKL

421 HLCYPVQTSQ PKLELVDSRP RRSSTQLRSG ASVTEPVAEE RGLMSQPLME TCHSVGAAYL

481 ESLPLQDASP AGGPSSPRDL PEPRVSTEHT NNKIEKIYIM KADTVIVGTV KAELPEGRGL

541 AGPAEPELEE ELEADHTPHY PEQETEPPLG SCSDVMLSVE EEGKEDPLPT AASGK