本發(fā)明涉及hiv治療與研究領(lǐng)域，更特別地，涉及一種hiv-1可感染的宿主細胞及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)是一種感染人類免疫系統(tǒng)細胞、導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合癥(acquiredimmunodeficiencysyndrome,aids)的慢病毒。hiv分為1型和2型，1型是目前全球流行的主要毒株，用hiv-1表示。hiv-1對宿主細胞具有高度選擇性，僅能感染人類和少數(shù)靈長類動物(如猩猩、長臂猿等)。常見的猴類如恒河猴、獼猴等動物在正常狀態(tài)下是無法感染hiv-1。

目前，hiv-1的感染研究模型，主要有細胞模型和動物模型兩種。細胞模型主要是一些cd4陽性細胞，如t4淋巴細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等。這些細胞表面帶有cd4分子(也就是hiv-1受體)，hiv-1的囊膜蛋白gp120能與這些cd4分子結(jié)合，使得gp41暴露出來；暴露后的gp41與細胞上的協(xié)同受體cxcr4或ccr5結(jié)合而介導(dǎo)hiv-1進入這些細胞內(nèi)實現(xiàn)感染；通過研究hiv-1在宿主細胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄和復(fù)制情況，進而進行抗hiv-1病毒藥物等研究。然而，t4淋巴細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等cd4陽性細胞在人體存在的數(shù)量較少，且分離困難。動物模型也是基于hiv-1細胞模型的基礎(chǔ)而實現(xiàn)，主要有非人靈長類動物模型、嵌合體鼠感染hiv-1動物模型等。

針對人類組織來源的hiv-1宿主細胞研究，可以在人類來源組織細胞的表面加載cd4分子及協(xié)同受體cxcr4或ccr5分子來建立hiv-1感染的細胞模型，如tzm-bl細胞系，就是基于人宮頸癌hela細胞，通過植入cd4和ccr5基因，使細胞膜表面高強度的表達cd4和ccr5分子，改造成的tzm-bl細胞對不同群簇的hiv-1具有高度易感染性。另外，可以通過對人類cd4陽性t白血病細胞系的篩選等工作，目前已發(fā)現(xiàn)cem、jurkat、hut78、以及htlv-1感染的mt-2和mt-4等細胞系，可以被hiv-1分離株病毒感染，被應(yīng)用于hiv-1的病理機制、抗病毒藥物的體外篩選、疫苗研究等。

然而，非人源的hiv-1宿主細胞，特別是小型動物來源的細胞，因為hiv-1對物種的特異性，進展上一直存在很大的障礙，例如gm95細胞，一種基于鼠黑色素瘤細胞，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒整合cd4、cxcr4和ccr5基因后進行轉(zhuǎn)錄，使其細胞膜上表達cd4、cxcr4和ccr5分子，可以實現(xiàn)hiv-1的感染，卻難于維續(xù)病毒的完整復(fù)制，僅僅可以應(yīng)用于hiv-1的入胞感染研究。研究一種小型動物來源細胞的hiv-1宿主細胞，對于hiv-1易感小型動物模型研究具有現(xiàn)實性意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

l1210細胞是一種小鼠白血病細胞，由我國中國科學(xué)院血液病研究所在20世紀60、70年代通過小鼠白血病病毒誘導(dǎo)而建立的一株網(wǎng)織細胞型白血病細胞模型。l1210細胞作為一種鼠類血細胞的未分化細胞，在細胞培養(yǎng)上簡便成熟，當(dāng)l1210細胞進行鼠類動物移植時，不管是應(yīng)用尾靜脈注射、皮下注射、還是腹腔注射，均可以在血液中達到一個理想的l1210細胞穩(wěn)定含量，常常用于復(fù)制白血病的鼠類動物模型。

然而，l1210細胞卻不能作為hiv-1感染的宿主細胞，因為其細胞膜上不僅缺乏hiv-1感染的受體與輔助受體分子，還缺乏hiv-1病毒復(fù)制的基本條件。

然而，出乎意料的是，當(dāng)發(fā)明人將人源的cd4、ccr5和cyclint1基因植入l1210細胞并使這些基因在其中表達后，發(fā)現(xiàn)所得到遺傳改造的細胞具有可被hiv-1病毒感染的特性，并且hiv-1病毒在該細胞中具備完整的病毒復(fù)制的特性，由此制備出一種能夠跨物種感染hiv-1的鼠類宿主細胞模型。

基于以上工作，本發(fā)明提供了小鼠白血病細胞l1210在制備hiv-1可感染的宿主細胞中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種hiv-1可感染的宿主細胞，其為細胞表面上表達有cd4和ccr5并且細胞內(nèi)表達有cyclint1的小鼠白血病細胞l1210。

優(yōu)選地，通過向所述小鼠白血病細胞l1210中導(dǎo)入帶有cd4基因表達框、ccr5基因表達框和cyclint1基因表達框的重組載體，然后篩選所述cd4基因、ccr5基因和cyclint1基因都表達的細胞即得到所述hiv-1可感染的宿主細胞。

本發(fā)明還提供了一種制備上述hiv-1可感染的宿主細胞的方法，其特征在于，包括將帶有cd4基因表達框、ccr5基因表達框和cyclint1基因表達框的重組表達載體導(dǎo)入所述小鼠白血病細胞l1210中的步驟。

優(yōu)選地，所述cd4基因表達框、ccr5基因表達框和cyclint1基因表達框位于同一重組表達載體上，所述重組表達載體為慢病毒質(zhì)粒載體。

優(yōu)選地，所述重組表達載體通過將序列如seqidno:1所示的cmv-cd4-t2a-cyclint1-ires/ccr5插入到慢病毒質(zhì)粒骨架中得到。

優(yōu)選地，所述cd4基因、ccr5基因和cyclint1基因表達的篩選通過rt-pcr、免疫印跡法進行。

本發(fā)明還提供了所述hiv-1可感染的宿主細胞在研究hiv-1發(fā)病機制中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述hiv-1可感染的宿主細胞在抗hiv-1藥物研制中的應(yīng)用。

本發(fā)明得到的hiv-1可感染的宿主細胞可被hiv-1高效地感染，并且受感染的細胞中所復(fù)制的病毒顆粒具有感染活性，受感染的細胞可向細胞外分泌有活性的hiv-1病毒。因此，本發(fā)明的hiv-1可感染的宿主細胞可助于hiv-1感染的治療和研究，以及抗hiv-1藥物研制。

附圖說明

圖1為帶有hcd4/ccr5/cyclint1表達框的慢病毒質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為hcd4/ccr5的mrna的實時熒光定量pcr統(tǒng)計圖；

圖3為hcd4/ccr5mrna凝膠電泳照片；

圖4為cyclint1mrna實時熒光定量pcr統(tǒng)計圖；

圖5為hcd4/ccr5蛋白免疫印跡照片；

圖6為hcd4/ccr5分子免疫成像檢測結(jié)果；

圖7為hcd4/ccr5/cyclint1轉(zhuǎn)染l1210細胞于hiv-1感染后細胞內(nèi)hiv-1rna的pcr結(jié)果統(tǒng)計圖；

圖8為hcd4/ccr5/cyclint1轉(zhuǎn)染l1210細胞于hiv-1感染后培養(yǎng)上清中hiv-1rna的pcr結(jié)果統(tǒng)計圖；

圖9為l1210細胞于hiv-1感染后培養(yǎng)上清液對cem細胞感染性的hiv-1rna的pcr檢測結(jié)果統(tǒng)計圖。

具體實施方式

以下結(jié)合實例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.hiv-1可感染的宿主細胞的制備

1)慢病毒表達載體的構(gòu)建

目的基因分別為hcd4(genbank序列號：nm_000616.4)、hccr5(genbank序列號：nm_000579.3)和humancyclint1(genbank序列號：nm_001240.3)構(gòu)建成雙啟動子慢病毒過表達載體，從國際標準基因庫調(diào)取，采用雙順反子載體(bicistronic)的表達方式，制備慢病毒包裝載體。本慢病毒載體的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。

采用gateway技術(shù)，首先構(gòu)建pdown-cd4-t2a-cyclint1、pup-cmv、ptail-ires/ccr5；小量提取質(zhì)粒pdown-cd4-t2a-cyclint1和骨架載體，25℃，lr反應(yīng)3h，反應(yīng)體系為pup-cmv12.89ng，pdown-cd4-t2a-cyclint110.42ng，ptail-ires/ccr513.03ng，骨架載體60.28ng，lrclonase1μl，加tebuffer將體系補充至5μl。加入蛋白酶k終止反應(yīng)10min。轉(zhuǎn)化lr反應(yīng)產(chǎn)物到stbl3，菌落pcr篩選陽性克隆，挑取陽性克隆質(zhì)粒，送交陽性克隆測序，得到重組慢病毒表達質(zhì)粒pla.exbi.p/puro-cmv-cd4-t2a-cyclint1-ires-ccr5。cmv-cd4-t2a-cyclint1-ires-ccr5的序列如seqidno:1所示。

2)慢病毒包裝產(chǎn)生假性病毒

取狀態(tài)良好并且處于對數(shù)生長期的293ft細胞，細胞計數(shù)后，按照每個10cm的培養(yǎng)皿5×10⁶個細胞數(shù)接種于培養(yǎng)皿中，37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；第二天轉(zhuǎn)染前去除舊的培養(yǎng)液，加入5ml新鮮的含10％血清dmem培養(yǎng)液。

準備1支5ml離心管，先加入1.5ml無血清i培養(yǎng)基，再加入plv/helper-sl3、plv/helper-sl4、plv/helper-sl5、pla.exbi.p/puro-cmv-cd4-t2a-cyclint1-ires-ccr5各4μg，輕輕顛倒混勻。另取1支5ml離心管，加入1.5ml無血清i培養(yǎng)液和40μl的lipofectamine2000，輕輕顛倒混勻。室溫孵育5min。將已稀釋的dna加入到含有l(wèi)ipofectamine2000的無血清i培養(yǎng)液中，輕輕顛倒混勻。室溫孵育20min，制備獲得dna-lipofectamine2000復(fù)合物。

將dna-lipofectamine2000復(fù)合物逐滴添加到293ft細胞中，輕輕搖晃混勻后放置37℃、5％co2飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染后24h更換10ml新鮮的含10％血清dmem培養(yǎng)液；轉(zhuǎn)染后48h，收集培養(yǎng)上清液進行濃縮；換10ml新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后72h再次收集上清液濃縮。濃縮方法為3000r/min低速離心15min，上清用0.45μl濾器進行過濾，以徹底去除細胞碎片；每個離心管裝20ml濾液，50000×g高速離心90min沉淀病毒顆粒，棄去上清；每管沉淀用200μl培養(yǎng)液重懸病毒沉淀，分裝進2個0.5ml進口axygen管中，每管100μl。分裝好的慢病毒載體放置-80℃冰箱內(nèi)保存。

3)慢病毒感染小鼠白血病細胞l1210

l1210細胞株來自于atcc庫(number:ccl-219^tm)，應(yīng)用含胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃、5％co2)進行細胞培養(yǎng)。當(dāng)l1210細胞的融合率約為50％左右時，進行慢病毒過表達載體感染：

a、吸取準確體積的病毒液加入準備好的培養(yǎng)基(聚凝胺濃度為8μg/ml)；

b、應(yīng)用空載病毒進行篩選，獲得最佳的moi；

c、根據(jù)最佳moi，在目的細胞和對照細胞中分別加入相應(yīng)慢病毒過表達載體液的培養(yǎng)基各2ml；

d、混勻后放于二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃、5％co2)孵育24h，換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，隔一天換一次液直至細胞長滿，傳代。

4)陽性表達hcd4/ccr5/cyclint1白血病細胞的鑒定

細胞株感染慢病毒過表達載體培養(yǎng)7-10d后，進行相關(guān)基因表達的鑒定。

a、rt-pcr和凝膠電泳檢測cd4和ccr5基因的rna轉(zhuǎn)錄，引物如下：

hcd4上游引物為：5’-tgcctcagtatgctggctct-3’(seqidno:2)

下游引物為：5’-gagacctttgcctccttgttc-3’(seqidno:3)

hccr5的上游引物為:5’-gctggtcatcctcatcctgataa-3’(seqidno:4)

下游引物為:5’-atggccaggttgagcaggta-3’(seqidno:5)

提取細胞總rna，分別進行實時熒光定量pcr檢測和凝膠電泳檢測。實時熒光定量pcr結(jié)果如圖2所示，在感染慢病毒載體后第7-14天hcd4和hccr5mrna的強陽性結(jié)果(p<0.001)，表明經(jīng)感染慢病毒載體后，l1210細胞存在hcd4和hccr5mrna的轉(zhuǎn)錄，而轉(zhuǎn)染空載慢病毒載體(n-t)的結(jié)果為陰性。凝膠電泳的檢測結(jié)果如圖3所示，特異性的193bp的cd4基因和75bp的ccr5基因片斷，而空載對照組(n-t)為陰性。

b、rt-pcr檢測cyclint1基因的rna轉(zhuǎn)錄

提取細胞總rna，逆轉(zhuǎn)錄合成crna，以逆轉(zhuǎn)錄所得的cdna為模板，進行pcr，實驗過程以空白細胞、轉(zhuǎn)染慢病毒空載體細胞陰性對照，以gadph做為內(nèi)參對照，在abi7500實時熒光定量pcr儀上進行檢測，結(jié)果如圖4所示，在感染慢病毒載體后第3-14天cyclint1mrna的強陽性結(jié)果(p<0.001)，表明經(jīng)感染慢病毒載體后，l1210細胞存在cyclint1mrna的轉(zhuǎn)錄，而轉(zhuǎn)染空載慢病毒載體(n-t)的結(jié)果為陰性。

c、免疫印跡檢測cd4和ccr5蛋白的表達

提取細胞總蛋白；配置10％的聚丙烯凝膠、上樣、跑電泳、轉(zhuǎn)膜、染膜、裁膜、脫脂牛奶封閉1h、4℃一抗孵育過夜、用tbst洗滌一抗20min×5次、二抗孵育1h、用tbst洗滌二抗5min×5，發(fā)光成像。

免疫印跡法檢測結(jié)果如圖5所示，轉(zhuǎn)染慢病毒hcd4/ccr5過表達載體后，可見55kd的cd4蛋白和40.6kd的ccr5電泳印跡陽性帶，而n-t空載對照組及空白對照組顯示為陰性。

d、免疫熒光法檢測cd4和ccr5蛋白的表達

應(yīng)用細胞涂片法進行檢測；pbs洗2次，每次5min，以清除細胞培養(yǎng)液；4％的多聚甲醛室溫固定20-30min；pbs洗3次，每次5min；4％bsa室溫封閉30min；按說明書上的比例稀釋一抗后，4℃孵育過夜(16h)；pbs洗3次，每次10min；按說明書上的比例稀釋二抗后，避光孵育1h；pbs洗3次，每次5min；1ug/mldapi避光染核5min；pbs洗3次，每次5min；熒光顯微鏡下觀察。

結(jié)果見圖6所示，根據(jù)cd4和ccr5分子的熒光顯微成像結(jié)果可見，結(jié)果證實l1210經(jīng)包裝hcd4/ccr5/cyclint1的慢病毒過表達載體感染后，細胞具有cd4和ccr5分子的表達，具備了hiv-1病毒入胞感染的受體及輔助受體。

2.hiv-1對hcd4/ccr5/cyclint1鼠白血病細胞l1210細胞的感染性檢測

將hcd4/ccr5/cyclint1鼠白血病細胞l1210，培養(yǎng)于含胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基中，于二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃、5％co2)下進行培養(yǎng)，進行hiv-1感染的細胞模型驗證；

l1210細胞感染前用2％dmso預(yù)處理，加入20％hiv-1陽性血清(1×10⁷cps/ml的血清樣品)的培養(yǎng)基37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱孵育12小時以感染細胞；無血清的培養(yǎng)基或pbs清洗2遍，加正常的完全培養(yǎng)基，留取此時的部分培養(yǎng)上清作本底對照。

細胞繼續(xù)培養(yǎng)，收集l1210感染第2、4、6、8天的細胞，取細胞總rna2μg(5.5μl)，按thermoscientific公司的revertaidreversetranscriptase說明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cdna，反應(yīng)條件為42℃1h，75℃5min。稀釋10倍后，以gapdh為內(nèi)參基因，取等量cdna(2μl)進行染料法rt-pcr反應(yīng)。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性1min；95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)；溶解曲線95℃15s，60℃30s，95℃15s。用目的基因/管家基因拷貝數(shù)的比值作為hiv-1rna相對量的結(jié)果。同樣的方法，于第4、6、8天分別收集細胞培養(yǎng)的上清液，進行hiv-1rna的檢測。

結(jié)果見圖7，結(jié)果顯示于感染hiv-1后，l1210細胞第4-6天可見hiv-1rna對數(shù)值結(jié)果的明顯增加，這顯示本研制的l1210細胞可以實現(xiàn)hiv-1的感染并存在hiv-1rna的復(fù)制。

經(jīng)hcd4/ccr5/cyclint1轉(zhuǎn)染后的l1210培養(yǎng)細胞的上清液中hiv-1rna表達水平結(jié)果見圖8，結(jié)果顯示于第6天后，細胞培養(yǎng)上清液中存在顯著性hiv-1rna表達，而陰性對照組則呈陰性結(jié)果，這表明，本研制的l1210細胞可以實現(xiàn)hiv-1的感染外，還可以實現(xiàn)病毒復(fù)制后向細胞外分泌的特點。

為證實本研制的l1210細胞感染hiv-1后所復(fù)制的病毒顆粒具有活性，我們進一步將上清液感染cem×174細胞進行測試。實驗中應(yīng)用不含hiv-1的細胞培養(yǎng)上清液和20％hiv-1陽性血清(1×10⁷cps/ml載量的血清樣品)分別進行陰性與陽性對照，于實驗后第2、3天收集細胞上清液，依前法進行hiv-1rna的檢測。

結(jié)果見如圖9所示，第2-3天可見l1210細胞感染hiv-1的培養(yǎng)上清液和陽性對照組顯示hiv-1rna的顯著性升高。這表明，本發(fā)明的l1210細胞在hiv-1的感染后分泌于培養(yǎng)上清液中的病毒顆粒具有活性，也就是說能夠復(fù)制完整的病毒。

簡而言之，本申請中基于小鼠白病細胞l1210細胞的hiv-1宿主細胞對hiv-1具有易感性，并能實現(xiàn)hiv-1完整病毒的復(fù)制，為hiv-1的病理機制、抗病毒藥物、疫苗研制行制備了一個新的、跨種族的鼠類細胞來源的細胞模型。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110>深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院

<120>一種基于鼠源細胞l1210的hiv-1可感染的宿主細胞

<130>1

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>5899

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccg60

cgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccatt120

gacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtca180

atgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgcc240

aagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagta300

catgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattac360

catggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacgggg420

atttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacg480

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ggatacagtggaactgacctgtacagcttcccagaagaagagcatacaattccactggaa780

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gtcatccagcaacttaaccagtgtggagatgttgccgggcaagcgttggctgtcctccca3060

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