本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種尼羅羅非魚耐鹽相關分子標記ssr450及其應用。
背景技術：
羅非魚(tilapia)原產(chǎn)于非洲大陸和中東地區(qū)咸淡水域，因形似鯽魚故又稱非洲鯽魚，隸屬于鱸形目(perciformes)、麗魚科(cichlidae)、羅非魚屬tilapia。羅非魚具有食性雜，生長快繁殖強，味道鮮美且肌間刺少等優(yōu)勢，是世界水產(chǎn)業(yè)重點科研培養(yǎng)的淡水養(yǎng)殖魚類，也是聯(lián)合國糧農(nóng)組織(fao)推廣的重要養(yǎng)殖品種。目前，我國羅非魚養(yǎng)殖年產(chǎn)量世界第一，占世界羅非魚產(chǎn)量的60％左右，主要有莫桑比克羅非魚、尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚、吉富羅非魚等養(yǎng)殖品種。其中，尼羅羅非魚因體型相對較大、質(zhì)嫩刺少、生長快等優(yōu)勢，現(xiàn)已成為世界性的主要養(yǎng)殖魚類品種之一，產(chǎn)量也在逐年遞增。但其耐鹽性不強，不能在海水中養(yǎng)殖，只能局限在淡水中養(yǎng)殖。隨著我國對內(nèi)陸淡水環(huán)境的保護加強，淡水養(yǎng)殖可利用水域面積短缺，尼羅羅非魚的淡水養(yǎng)殖業(yè)將受到很大程度的制約。與此同時，我國還存在大量未被利用的鹽堿水域。這些鹽堿水域具有高鹽、高堿、高ph和復雜離子組成等特點，不利于羅非魚的養(yǎng)殖，從而大大限制了這些水域的開發(fā)和利用。因此，培養(yǎng)一種適合在咸海水中養(yǎng)殖的耐鹽性品種對于這些水域的開發(fā)和漁業(yè)持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種特異性的區(qū)分出耐鹽和不耐鹽尼羅羅非魚個體的尼羅羅非魚耐鹽相關分子標記ssr450。
本發(fā)明的尼羅羅非魚耐鹽相關分子標記ssr450，其特征在于，其核苷酸序列如seqidno.1所示。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種尼羅羅非魚耐鹽相關分子標記ssr450的pcr引物，其特征在于，包括：
上游引物：5’-gccgcagtgcttttaccattag-3’；
下游引物：5’-catttccactcgtctcatctgtcc-3’。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種篩選尼羅羅非魚耐鹽個體的篩選方法，其特征在于，提取待測尼羅羅非魚的基因組dna，以上述尼羅羅非魚耐鹽相關分子標記ssr450的pcr引物進行pcr反應，然后對pcr產(chǎn)物進行基因分型，判斷待測尼羅羅非魚是否為耐鹽個體。
所述的pcr反應為以20μl計算：
所述的pcr反應條件為：95℃,3min；然后95℃,40s,61℃,30s，72℃,1min,34個循環(huán)；72℃，10min。
本發(fā)明的第四個目的是提供上述尼羅羅非魚耐鹽相關分子標記ssr450的pcr引物在尼羅羅非魚耐鹽個體的快速篩選和選育中的應用。
相比于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的優(yōu)點和效果：
我國咸海水養(yǎng)殖面積充足，而尼羅羅非魚具有生長速度快，肉質(zhì)細膩但是不耐鹽的特點。為了充分利用我國廣闊的咸海水域，大面積養(yǎng)殖尼羅羅非魚，提高經(jīng)濟效益，解決尼羅羅非魚不耐鹽缺陷變得至關重要。本發(fā)明開發(fā)的尼羅羅非魚耐鹽相關分子標記ssr450，其特異性強，能較好地區(qū)分出耐鹽和不耐鹽個體。因此，該分子標記可用于尼羅羅非魚耐鹽個體的快速篩選和選育，提高生產(chǎn)效益。
附圖說明
圖1是急性高鹽處理條件下各30個極端個體的分子標記ssr450的page電泳、銀染條帶。
具體實施方式
以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
實施例1
一、全同胞家系的構建及實驗樣品的獲取
2015在廣州市五龍崗水產(chǎn)發(fā)展有限公司挑選優(yōu)質(zhì)尼羅羅非魚親魚1對成功構建了1個全同胞家系(n＝400)。尼羅羅非魚實驗魚在廣州市五龍崗水產(chǎn)發(fā)展有限公司進行淡水養(yǎng)殖，運回中山大學東校區(qū)魚類養(yǎng)殖實驗室進行急性耐鹽處理。
實驗在2.0×1.5×1.2魚池中進行，先將有疾病表征的尼羅羅非魚撈出，以免影響實驗。實驗前饑餓一天，處理期間不投餌，不換水。從上午10點開始，每隔15分鐘往魚池中倒入一包海鹽(1斤/包)，逐漸增加魚池內(nèi)鹽濃度，用鹽度計隨時檢測鹽濃度，并用撈網(wǎng)攪拌擴散，防止局部鹽度過高。
中午12點17分，開始有尼羅羅非魚死亡，停止倒入海鹽，馬上打撈出死亡的尼羅羅非魚，進行稱重，記錄下尼羅羅非魚死亡時間與重量。接下來的兩小時內(nèi)，陸續(xù)有尼羅羅非魚死亡。撈出剛死亡的尼羅羅非魚后，剪下魚左腮，保存于無水乙醇中，以尼羅羅非魚死亡先后為順序編號，備用。耐鹽性指標為尼羅羅非魚死亡時間，先死的尼羅羅非魚對鹽敏感，耐鹽性低，后死的對鹽不敏感，耐鹽性高。
二、基因組dna的來源和提取
親代和子代dna的提取
樣品：實施例1中實驗獲得的400條尼羅羅非魚的魚鰓，耐鹽和不耐鹽的各200條。實驗中僅對兩個極端共281條魚進行了基因分型。
dna提取步驟：
使用東盛基因組dna快速提取試劑盒提取親本dna，提取的dna稀釋到10ng/μl后于-20℃保存?zhèn)溆?。子一代dna使用96孔板進行提取，步驟如下：
1、取一1.5ml的96孔板，置于冰上，每孔加入300μl的setbuffer(10mmtrisph8.0，50mmedtaph8.0，200mmnacl，0.5％sds)，50μl蛋白酶k(20mg/ml)；
2、用滅過菌的剪刀剪下3*3mm2大小的魚鰓樣品，放在濾紙上，將樣品上殘留的無水乙醇吸干，放到裂解液中；
3、簡短離心后放入搖床中，將溫度設置為55℃，轉(zhuǎn)速80rpm，消化過夜；
4、取硅膠柱(96孔)，下面用96孔板承接濾液，每孔加240ul6m現(xiàn)配的nai，再加入80μl的裂解液，2000g離心1min，倒去濾液；
5、每孔加入240μl的washbuffer(10mmtrisph7.5，1mmedtaph7.5，100mmnacl，50％乙醇)，2000g離心3min后，靜置干燥5min；
6、每孔加入120μl的純水，在室溫下靜置2min后，2000g離心2min得到dna樣品；
7、1％瓊脂糖凝膠電泳，120v電泳30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。提取的dna稀釋5倍后放入-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
三、微衛(wèi)星引物的獲得
1、微衛(wèi)星引物的多態(tài)性篩選
登錄ucsc網(wǎng)站(https://genome.ucsc.edu/)，找到尼羅羅非魚lg18連鎖群qtl區(qū)間(21-25mb)，在該區(qū)間近中間位置的轉(zhuǎn)錄本lg18.1114(chrlg18:23,031,649-23,051,010)內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在含(ca)n堿基重復的ssr序列。下載該基因的序列，用editseq軟件進行序列的剪切，將剪切后的序列(如seqidno.1所示，即為分子標記ssr450)用primerselect軟件進行引物設計，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，引物的上游引物：5’-gccgcagtgcttttaccattag-3’，下游引物：5’-catttccactcgtctcatctgtcc-3’。
即分子標記ssr450的擴增引物：
上游引物：5’-gccgcagtgcttttaccattag-3’；
下游引物：5’-catttccactcgtctcatctgtcc-3’。
2、pcr反應反應體系為：pcrdsmix10μl，上下游引物(上游引物：5’-gccgcagtgcttttaccattag-3’，下游引物：5’-catttccactcgtctcatctgtcc-3’)各0.8μl，模板dna2μl，補充水6.4μl至總體積20μl，反應條件設為95℃,3min；然后95℃,40s,61℃,30s，72℃,1min,34個循環(huán)；72℃,10min，得到pcr產(chǎn)物。
四、聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測
1)制膠
取純水25ml，5×tbe4ml，acr-bis(30％)10.7ml，temed26μl，aps(10％)280μl，用玻璃棒充分攪拌均勻，將配置好的凝膠注入組裝好的兩玻璃板之間，輕輕插入梳子，靜置1-2小時，待其凝固。
2)電泳
膠凝固后，將膠連同玻璃板一起取下，安置在電泳槽中；依次序?qū)⒉襟E三的pcr產(chǎn)物進行點樣，每孔3μl；蓋好上蓋，將電壓調(diào)到200v，電泳10分鐘后，將電壓調(diào)到600v，繼續(xù)電泳1.5小時。
3)銀染
電泳結束后，排出緩沖液，從電泳槽中取下玻璃板，用薄板輕輕撬開兩塊玻璃板，將凝膠放入裝有純水的盤中，使凝膠與玻璃板脫離；倒掉純水，加入500ml的染色液(1％agno3)，染色大約5分鐘后將膠轉(zhuǎn)移到裝有純水的盤中，漂洗5-10秒，倒掉純水，加入顯色液(20gnaoh+0.5gna2co3+4ml甲醛溶液(37％)加入1l純水中，使用前置入冰中預冷，顯色約10-15min，至條帶開始呈現(xiàn)，倒掉顯色液，加入純水浸泡5min，觀察條帶并拍照(圖1)。
五、基因分型
根據(jù)親子代之間的遺傳規(guī)律對圖1的pcr產(chǎn)物凝膠電泳銀染照進行基因型讀取，條帶的讀取原則為：子代的條帶必須一條來自父方，一條來自母方，從而確定子代的基因型。將讀取的基因型用excel進行整理并統(tǒng)計分析，確定該標記的可行性(表1，表1中序號與圖1中的序號相同的為同一樣本，其中a,b,c分別代表三個不同的等位基因，自下而上依次與條帶對應，根據(jù)條帶的位置命名基因型，ac和bc代表兩種不同的基因型。根據(jù)上述的條帶讀取原則即遺傳規(guī)律可知，母本的基因型為ac，父本的基因型為bc，那么子代的基因型肯定一個來自于父本，一個來自于母本。ac型子代的a基因來自母親，c基因則來自于父親，bc型子代的b基因來自于母親，c基因則來自于父親)。
表1
六、用卡方檢驗法驗證標記ssr450的可行性
1)提出假設：
對不耐鹽和耐鹽羅非魚群體基因型是否有差異進行分析，檢驗耐鹽與基因型有無關聯(lián)？
a.h0：耐鹽與基因型無關；ha：耐鹽與基因型有關。
b.給出顯著水平0.01
c.計算統(tǒng)計數(shù)χ2：先計算列聯(lián)表中各項的理論次數(shù)：
2)計算理論值
不耐鹽ac型：
不耐鹽bc型：
耐鹽ac型：
耐鹽bc型：
3)計算自由度：
df＝(r-1)(c-1)＝(2-1)(2-1)＝1
4)計算χ2值
5)統(tǒng)計推斷
查χ2值表，當df＝1時，χ0.012＝6.63，而
6)得出結論：當顯著性水平為0.01時，分子標記ssr450的兩個不同基因型頻率在耐鹽個體和不耐鹽個體間具有顯著差異，從而證明該分子標記對羅非魚的耐鹽性具有非常好的鑒定作用。
七、用mapqtl6對耐鹽和不耐鹽個體基因型的有效性進行評估。
1、通過mapqtl6軟件選擇kruskal-wallis方法對個體基因型與表型的關系進行分析。
2、結果顯示，該分子標記ssr450的k值為159.452，且為極顯著性相關；耐鹽個體bc基因型的均值為6030.6秒，不耐鹽個體ac基因型的均值為1521.77秒。研究顯示具有bc基因型的耐鹽個體在急性高鹽處理下平均能存活6030.6秒，而具有ac基因型的不耐鹽個體平均只能存活1521.77秒，耐鹽個體相比不耐鹽個體平均多存活1.25小時。
序列表
<110>中山大學
<120>一種尼羅羅非魚耐鹽相關分子標記ssr450及其應用
<160>1
<210>1
<211>304
<212>dna
<213>尼羅羅非魚（oreochromisniloticus）
<400>1
gccgcagtgcttttaccattagacacaaagtaatcagggtttcgagcagctgtcaacaga60
aaccacaatgaatagttcgcacagaaacacgcacgcacacaatttgtctccgaagattac120
cgttgtcacacacacacacattctgtgtccacacggcattatctgctgcatcactgggcc180
aacacaaaagacaagacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacaca240
cacagagcagtaataacaacagaggaaactaagagatacaggacagatgagacgagtgga300
aatg304