本發(fā)明屬于環(huán)境微生物及廢水處理領(lǐng)域，具體涉及一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

據(jù)報(bào)道苯酚、苯胺等的生產(chǎn)量和使用量占芳烴總量的90％以上，其中作為化工行業(yè)中最重要中間體之一的苯胺，應(yīng)用十分廣泛：染料工業(yè)中可用于制造酸性嫩黃、直接橙S、直接桃紅、靛藍(lán)、分散黃棕、陽(yáng)離子桃紅FG和活性艷紅X-SB等染料，還可用于制造金光紅、大紅粉、酚菁紅、油溶黑等有機(jī)顏料；橡膠制造工業(yè)中是橡膠助劑的重要原料，可用于制造防老劑、促進(jìn)劑、抗氧劑、穩(wěn)定劑等；醫(yī)藥行業(yè)可作為磺胺藥的原料；也是農(nóng)藥行業(yè)的重要中間體，可制造殺菌劑、殺蟲(chóng)劑和除草劑；苯胺在其他行業(yè)也具有重要作用，如可作為生產(chǎn)香料、塑料、清漆、膠片等的中間體；還可作為炸藥中的穩(wěn)定劑、汽油中的防爆劑。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，對(duì)苯胺的需求量也快速增長(zhǎng)，苯胺產(chǎn)量由2005年的49萬(wàn)噸增長(zhǎng)到2015年的178萬(wàn)噸。近年隨著以苯胺為主要原料的MDI的需求量快速增長(zhǎng)，也極大的拉動(dòng)了苯胺的需求量。

苯胺因其毒性大、難降解、具有致癌、致畸、致突變的“三致”特性，已被美國(guó)EPA列為優(yōu)先控制的129種污染物之一，同時(shí)也屬于我國(guó)水中優(yōu)先控制污染物黑名單中的一種有機(jī)污染物。工業(yè)上應(yīng)用十分廣泛的苯胺會(huì)隨著工業(yè)廢水進(jìn)入自然環(huán)境及地下水中，因苯胺亦屬于高毒高殘留物質(zhì)，極易危害生物健康。苯胺可與動(dòng)物體內(nèi)血紅蛋白結(jié)合成高鐵血紅蛋白而引起高鐵血紅蛋白血癥，還會(huì)引起肝臟、腎臟、心血管等臟器損害；每年大約有30 000t苯胺被排放到環(huán)境中，該物質(zhì)可通過(guò)生物富集、皮膚接觸等途徑進(jìn)入人體，嚴(yán)重威脅環(huán)境安全及人類健康。生物降解相比于傳統(tǒng)的物理吸附法和化學(xué)處理法，具有高效、成本低、不會(huì)產(chǎn)生二次污染等優(yōu)勢(shì)，已成為降解苯胺的最佳方法。特別是微生物具有來(lái)源廣、易培養(yǎng)、繁殖速度快等優(yōu)勢(shì)，已引起人們的廣泛關(guān)注。目前還沒(méi)有一種利用鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)菌株降解苯胺廢水的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌及其應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌，鞘氨醇桿菌的16SrDNA鑒定屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，申請(qǐng)人將其編號(hào)為BA-4；已保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心，郵政編碼：100101，保藏編號(hào)：CGMCC No.：13428；它為短桿狀，屬于革蘭氏陰性菌；在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上形成圓形的淡黃色菌落，表面濕潤(rùn)，邊緣整齊，易挑取。

本發(fā)明所述的具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌來(lái)源于山東省曲阜市某污水溝污泥，經(jīng)苯胺馴化、分離、純化獲得，并可利用苯胺作為其生長(zhǎng)的唯一碳源和氮源。本發(fā)明所述的鞘氨醇桿菌經(jīng)16SrDNA鑒定屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，在NCBI上經(jīng)BLAST比對(duì)后，與菌株Sphingobacterium sp.F159(登錄號(hào)為KJ848476.1)的同源性達(dá)到99％。

一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌在降解苯胺的應(yīng)用。

所述的，降解苯胺的具體方法為：將鞘氨醇桿菌懸浮于含苯胺水中，在溫度為28-38℃、pH為6-9條件下?lián)u床培養(yǎng)72h。

所述的，鞘氨醇桿菌的接種量為2％。

優(yōu)選的，降解苯胺的具體方法為：將鞘氨醇桿菌懸浮于含苯胺水中，在溫度為30℃、pH為7條件下?lián)u床培養(yǎng)72h。

所述的，含苯胺水中苯胺的初始濃度不大于350mg/L。

優(yōu)選的，含苯胺水中苯胺的初始濃度為350mg/L。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的鞘氨醇桿菌Sphingobacterium sp.BA-4用于污水體系中苯胺的降解，不僅具有很高的降解速率和耐受濃度，且無(wú)二次污染，使用安全，具有廣闊的應(yīng)用前景。

菌種保藏信息

保藏時(shí)間：2016年12月07日，

保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，

保藏編號(hào)：CGMCC No.13428，

保藏單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101

分類命名：鞘氨醇桿菌Sphingobacterium sp.

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的鞘氨醇桿菌Sphingobacterium sp.BA-4的照片；

其中：a為菌落照片，b為革蘭氏染色顯微鏡照片；

圖2為本發(fā)明鞘氨醇桿菌Sphingobacterium sp.BA-4的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖；

圖3為不同苯胺濃度下本發(fā)明的鞘氨醇桿菌Sphingobacterium sp.BA-4對(duì)苯胺的降解曲線。

具體實(shí)施方式

下面列舉具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不因此而限制本發(fā)明的內(nèi)容。

實(shí)施例1

一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌，鞘氨醇桿菌的16SrDNA鑒定屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，申請(qǐng)人將其編號(hào)為BA-4；已保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心，郵政編碼：100101，保藏編號(hào)：CGMCC No.：13428；它為短桿狀，屬于革蘭氏陰性菌；在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上形成圓形的淡黃色菌落，表面濕潤(rùn)，邊緣整齊，易挑取。

本發(fā)明所述的具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌來(lái)源于山東省曲阜市某污水溝污泥，經(jīng)苯胺馴化、分離、純化獲得，并可利用苯胺作為其生長(zhǎng)的唯一碳源和氮源。本發(fā)明所述的鞘氨醇桿菌經(jīng)16SrDNA鑒定屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，在NCBI上經(jīng)BLAST比對(duì)后，與菌株Sphingobacterium sp.F159(登錄號(hào)為KJ848476.1)的同源性達(dá)到99％。

一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌在降解苯胺的應(yīng)用。

所述的，降解苯胺的具體方法為：將鞘氨醇桿菌懸浮于含苯胺水中，在溫度為38℃、pH為6條件下?lián)u床培養(yǎng)72h。

所述的，鞘氨醇桿菌的接種量為2％。

所述的，含苯胺水中苯胺的初始濃度為300mg/L。

實(shí)施例2

一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌，鞘氨醇桿菌的16SrDNA鑒定屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，申請(qǐng)人將其編號(hào)為BA-4；已保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心，郵政編碼：100101，保藏編號(hào)：CGMCC No.：13428；它為短桿狀，屬于革蘭氏陰性菌；在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上形成圓形的淡黃色菌落，表面濕潤(rùn)，邊緣整齊，易挑取。

本發(fā)明所述的具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌來(lái)源于山東省曲阜市某污水溝污泥，經(jīng)苯胺馴化、分離、純化獲得，并可利用苯胺作為其生長(zhǎng)的唯一碳源和氮源。本發(fā)明所述的鞘氨醇桿菌經(jīng)16SrDNA鑒定屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，在NCBI上經(jīng)BLAST比對(duì)后，與菌株Sphingobacterium sp.F159(登錄號(hào)為KJ848476.1)的同源性達(dá)到99％。

一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌在降解苯胺的應(yīng)用。

所述的，降解苯胺的具體方法為：將鞘氨醇桿菌懸浮于含苯胺水中，在溫度為30℃、pH為7條件下?lián)u床培養(yǎng)72h。

所述的，鞘氨醇桿菌的接種量為2％。

所述的，含苯胺水中苯胺的初始濃度為350mg/L。

實(shí)施例3

一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌，鞘氨醇桿菌的16SrDNA鑒定屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，申請(qǐng)人將其編號(hào)為BA-4；已保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心，郵政編碼：100101，保藏編號(hào)：CGMCC No.：13428；它為短桿狀，屬于革蘭氏陰性菌；在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上形成圓形的淡黃色菌落，表面濕潤(rùn)，邊緣整齊，易挑取。

本發(fā)明所述的具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌來(lái)源于山東省曲阜市某污水溝污泥，經(jīng)苯胺馴化、分離、純化獲得，并可利用苯胺作為其生長(zhǎng)的唯一碳源和氮源。本發(fā)明所述的鞘氨醇桿菌經(jīng)16SrDNA鑒定屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，在NCBI上經(jīng)BLAST比對(duì)后，與菌株Sphingobacterium sp.F159(登錄號(hào)為KJ848476.1)的同源性達(dá)到99％。

一種具有降解苯胺能力的鞘氨醇桿菌在降解苯胺的應(yīng)用。

所述的，降解苯胺的具體方法為：將鞘氨醇桿菌懸浮于含苯胺水中，在溫度為28℃、pH為9條件下?lián)u床培養(yǎng)72h。

所述的，鞘氨醇桿菌的接種量為2％。

所述的，含苯胺水中苯胺的初始濃度為200mg/L。

Sphingobacterium sp.BA-4的分離、純化和鑒定

Sphingobacterium sp.BA-4是從山東省曲阜市某污水溝污泥取樣，經(jīng)初篩和復(fù)篩得到的一株革蘭氏陰性菌。具體步驟如下：

一、初篩

(1)富集培養(yǎng)：從山東省曲阜市某污水溝采集的污泥5g接種于45ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(內(nèi)含數(shù)粒小玻璃珠)，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)24h。

(2)分離純化：在無(wú)菌環(huán)境下，用移液槍取步驟(1)獲得的菌液0.5ml加至4.5ml無(wú)菌水中，充分混勻，制備成10^-1的菌液；再吸取該稀釋菌液0.5ml加入到4.5ml無(wú)菌水中，充分混勻，制備成10^-2的菌液；同樣的方法依次制備成梯度為10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌液；分別取稀釋梯度為10^-4、10^-5、10^-6的菌液200μl，涂布于苯胺濃度為50mg/L的固體篩選培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)上，倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；培養(yǎng)完成，挑取平板上形態(tài)、大小不同的單菌落劃線于純化培養(yǎng)基(其配方為蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2)，倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；多次重復(fù)上一步驟，直至獲得純菌落，接種于斜面培養(yǎng)基(其配方為蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2)，于4℃冰箱中保存。

二、復(fù)篩

(1)菌株活化：在無(wú)菌環(huán)境下，挑取初篩步驟(2)獲得的純菌落一環(huán)，接種于活化培養(yǎng)基(其配方為蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2)，倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

(2)種子培養(yǎng)：在無(wú)菌環(huán)境下，將菌株活化步驟獲得的活化菌株以2％(V/V)接種量接種于種子培養(yǎng)基(其配方為蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)24h。

(3)發(fā)酵降解：將步驟(2)種子培養(yǎng)獲得的種子液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為50mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h。

(4)離心：將步驟(3)發(fā)酵降解獲得的發(fā)酵液用12000r/min離心10min，獲得上清液。

(5)苯胺濃度檢測(cè)：取步驟(4)離心獲得的上清液1ml，參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》第四版中N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測(cè)定發(fā)酵液中苯胺濃度含量。分別計(jì)算各菌株發(fā)酵液中的苯胺濃度，根據(jù)苯胺降解率復(fù)篩得出具有降解苯胺能力的Sphingobacterium sp.BA-4。Sphingobacterium sp.BA-4的照片如圖1所示。

Sphingobacterium sp.BA-4的16SrDNA鑒定

通過(guò)16SrDNA序列分析，確定BA-4菌屬于鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)，具體步驟如下：

一、提取基因組DNA

(1)菌株活化：在無(wú)菌環(huán)境下，挑取復(fù)篩步驟獲得的具有降解苯胺能力的純菌落一環(huán)，接種于5ml活化培養(yǎng)基(其配方為蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、蒸餾水1000ml，pH7.2±0.2)，置于30℃、150r/min搖床中震蕩培養(yǎng)24h。

(2)提取基因組DNA：使用北京索萊寶科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，提取活化后的苯胺降解菌BA-4的基因組DNA。

(3)檢驗(yàn)基因組DNA片段：將步驟(2)獲得的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以檢驗(yàn)是否提取出目的基因組DNA。瓊脂糖凝膠配方為：瓊脂糖0.25mg、1×TAE 25ml、Gelred2.5μl。電泳條件為：120V、20min。

二、PCR產(chǎn)物純化

(1)PCR擴(kuò)增：使用細(xì)菌通用引物27F、1492R，50μl PCR體系對(duì)目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。50μl PCR體系和PCR反應(yīng)條件分別如表1和表2所示。

細(xì)菌通用引物27F、1492R序列如下：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

表1 50μl PCR體系

表2 PCR反應(yīng)條件

(2)檢驗(yàn)PCR產(chǎn)物：將步驟(1)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以檢驗(yàn)獲得的PCR產(chǎn)物的純度。瓊脂糖凝膠配方為：瓊脂糖0.25mg、1×TAE 25ml、Gelred 2.5μl。電泳條件為：120V、20min。

(3)純化PCR產(chǎn)物：使用康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司的AxyPrep PCR產(chǎn)物純化試劑盒，純化步驟(1)獲得的PCR產(chǎn)物。

三、測(cè)序比對(duì)

(1)測(cè)序：將PCR產(chǎn)物純化步驟(3)獲得的PCR純化產(chǎn)物寄送至山東省濟(jì)南市力戈科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

(2)序列比對(duì)：將步驟(1)獲得的菌株序列在NCBI上進(jìn)行核苷酸序列BLAST比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)與菌株Sphingobacterium sp.F159(登錄號(hào)為KJ848476.1)的同源性達(dá)到99％，圖2為該菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖，故該苯胺降解菌屬于鞘氨醇桿菌屬，將該菌命名為Sphingobacterium sp.BA-4。

Sphingobacterium sp.BA-4菌株馴化

(1)菌株活化：在無(wú)菌環(huán)境下，分別挑取復(fù)篩步驟獲得的苯胺降解菌BA-4純菌落一環(huán)，接種于5ml活化培養(yǎng)基(其配方為蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、蒸餾水1000ml，pH7.2±0.2)，置于30℃、150r/min搖床中震蕩培養(yǎng)24h，得活化種子液；

(2)將活化種子液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為50mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測(cè)定上清液中苯胺濃度含量；

(3)將步驟(2)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為100mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測(cè)定上清液中苯胺濃度含量；

(4)將步驟(3)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為150mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測(cè)定上清液中苯胺濃度含量；

(5)將步驟(4)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為200mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測(cè)定上清液中苯胺濃度含量；

(6)將步驟(5)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為250mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測(cè)定上清液中苯胺濃度含量；

(7)將步驟(6)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為300mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測(cè)定上清液中苯胺濃度含量；

(8)將步驟(7)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為350mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測(cè)定上清液中苯胺濃度含量；

(9)將步驟(8)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為400mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測(cè)定上清液中苯胺濃度含量；

(10)將步驟(9)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為450mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；取該馴化菌液10ml用12000r/min離心10min后，取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測(cè)定上清液中苯胺濃度含量。

由馴化和圖3發(fā)現(xiàn)：Sphingobacterium sp.BA-4能高效降解濃度小于350mg/L的苯胺，可在72h完全降解濃度為350mg/L的苯胺。之后隨著苯胺濃度的增大，其降解效果逐漸降低。

溫度對(duì)Sphingobacterium sp.BA-4降解苯胺的影響

選用Sphingobacterium sp.BA-4能完全降解苯胺的最大濃度350mg/L為初始苯胺濃度，在培養(yǎng)基pH 7.0的條件下，研究溫度對(duì)Sphingobacterium sp.BA-4降解苯胺的影響。

(1)種子液制備：將Sphingobacterium sp.BA-4菌株馴化步驟(8)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為350mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.0，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h，作為種子液備用；

(2)將步驟(1)獲得的種子液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為350mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方同步驟(1))中，分別置于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃的150r/min搖床中培養(yǎng)72h；分別取不同溫度條件下培養(yǎng)的菌液10ml用12000r/min離心10min后，分別取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測(cè)定上清液中苯胺濃度含量。

當(dāng)苯胺初始濃度為350mg/L、培養(yǎng)基pH 7.0的條件下，苯胺降解菌BA-4能在28-38℃范圍內(nèi)對(duì)苯胺進(jìn)行有效降解，在30℃時(shí)可將苯胺完全降解。溫度大于或小于30℃時(shí)，該菌株對(duì)苯胺的降解率均有不同程度的下降。

酸堿度對(duì)Sphingobacterium sp.BA-4降解苯胺的影響

選用Sphingobacterium sp.BA-4能完全降解苯胺的最大濃度350mg/L為初始苯胺濃度，在培養(yǎng)溫度為30℃的條件下，研究酸堿度對(duì)Sphingobacterium sp.BA-4降解苯胺的影響。

(1)種子液制備：將Sphingobacterium sp.BA-4菌株馴化步驟(8)獲得的馴化菌液以2％(V/V)接種量接種于40ml苯胺濃度為350mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基(其配方為K₂HPO₄·3H₂O 4g、NaH₂PO₄·2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄·H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.0，)中，于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h，作為種子液備用；

(2)按步驟(1)中發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基后，分別以2mol/L的NaOH溶液、1mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的酸堿度，分別配置成pH＝5、pH＝6、pH＝7、pH＝8、pH＝9、pH＝10的發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃滅菌20min待用；

(3)分別將步驟(1)獲得的種子液以2％(V/V)接種量接種于酸堿度不同(步驟(2)所示)的40ml苯胺濃度為350mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于30℃、150r/min搖床中培養(yǎng)72h；分別取不同酸堿度條件下培養(yǎng)的菌液10ml用12000r/min離心10min后，分別取上清液1ml，使用N-(1-萘基)乙二胺偶氮光度法測(cè)定上清液中苯胺濃度含量。

當(dāng)苯胺初始濃度為350mg/L、培養(yǎng)溫度為30℃的條件下，苯胺降解菌BA-4能在pH＝6-9范圍內(nèi)對(duì)苯胺進(jìn)行有效降解，在pH＝7時(shí)可將苯胺完全降解。當(dāng)酸堿度大于或小于pH＝7時(shí)，該菌株對(duì)苯胺的降解率均有不同程度的下降。