本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種窄分布羥乙基淀粉及其應(yīng)用，該窄分布羥乙基淀粉尤其可在醫(yī)藥領(lǐng)域中應(yīng)用。

背景技術(shù)：

羥乙基淀粉由支鏈淀粉衍生化反應(yīng)而得，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與機(jī)體內(nèi)的多糖及肝糖相似，副作用比阿拉伯膠、海藻酸鈉等血漿代用品小。而且，由于羥乙基基團(tuán)的存在，一方面，降低了體內(nèi)淀粉酶對(duì)羥乙基淀粉的降解速度，使其具有一定的抗休克療效；另一方面，極大地增加羥乙基淀粉在水中的溶解度，以便配成一定濃度的溶液，供臨床使用。因此，羥乙基淀粉溶液是目前臨床常用的血漿代用品。羥乙基淀粉的容量擴(kuò)充效應(yīng)和血液稀釋效應(yīng)，取決于分子量大小、取代度、取代方式和藥物濃度，以及給藥劑量和輸注速度。

羥乙基淀粉按分子量大小和羥乙基取代度的不同，可分為：重均分子量Mw范圍為2,000～100,000的低分子量高取代羥乙基淀粉(如：羥乙基淀粉20/0.8，羥乙基淀粉40/0.8)、重均分子量MW范圍為100,000～300,000的中分子量低取代羥乙基淀粉(如：羥乙基淀粉130/0.4，羥乙基淀粉200/0.5)與重均分子量Mw范圍為300,000～900,000的高分子量高取代羥乙基淀粉(如:羥乙基淀粉480/0.7)等。

傳統(tǒng)常用的樣本密度分離液為Ficoll(聚蔗糖400)-泛影酸鈉分離液和右旋糖酐-泛影葡胺分離液等，F(xiàn)icoll(聚蔗糖400)-泛影酸鈉分離液其主要成分是一種合成的蔗糖聚合物，簡(jiǎn)稱聚蔗糖，但在向保存液中加入Ficoll分離液后，在保存液與樣本密度分離液分層處的未被保存液完全裂解的紅細(xì)胞會(huì)與聚蔗糖接觸而凝集成串錢狀而沉積于管底與下沉的具有診斷學(xué)意義的細(xì)胞(上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞)混合，影響后續(xù)制片后對(duì)樣品的觀察。右旋糖酐-泛影葡胺分離液，由于葡聚糖是由葡萄糖經(jīng)過(guò)菌種發(fā)酵而得，因此其內(nèi)毒素水平較高，會(huì)影響淋巴細(xì)胞的表面蛋白活性，且分離液中含不通透的離子diatrizoate(泛影葡胺)，會(huì)影響離子通透膜的Gibbs-Donnan平衡(吉布斯一道南膜平衡)。所以，傳統(tǒng)的細(xì)胞分離液對(duì)細(xì)胞有毒性，分得細(xì)胞狀態(tài)不好，影響細(xì)胞活性，不利于所提取細(xì)胞的后續(xù)培養(yǎng)及臨床治療的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明的目的在于提供一種窄分布羥乙基淀粉及其應(yīng)用，其中通過(guò)對(duì)羥乙基淀粉關(guān)鍵的分子量分布，如重均分子量Mw、摩爾取代度MS、以及C2/C6比等進(jìn)行改進(jìn)，與現(xiàn)有技術(shù)相比由于使得羥乙基淀粉能夠作為動(dòng)物組織或人體組織密度分離的新型介質(zhì)，從而可以有效解決細(xì)胞分離液對(duì)細(xì)胞有毒性、影響細(xì)胞活性等問(wèn)題，該窄分布羥乙基淀粉可替代聚蔗糖或右旋糖酐，用于制備樣本密度分離液，分離各種細(xì)胞，其生物安全性高，無(wú)細(xì)胞毒性，內(nèi)毒素含量低，分離的淋巴細(xì)胞狀態(tài)好，活力高。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種窄分布的羥乙基淀粉，其特征在于，該羥乙基淀粉的重均分子量Mw為250000～400000，摩爾取代度MS為0.3～0.7，C2/C6比為4～12。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述羥乙基淀粉的重均分子量Mw為280000～380000。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，對(duì)于所述羥乙基淀粉，10％小分子部分重均分子量不小于該羥乙基淀粉重均分子量Mw的20％。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，對(duì)于所述羥乙基淀粉，10％大分子部分重均分子量不大于該羥乙基淀粉重均分子量Mw的220％。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述羥乙基淀粉的摩爾取代度MS為0.4～0.6。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述羥乙基淀粉的C2/C6比為5～10。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述羥乙基淀粉是由包括馬鈴薯淀粉、玉米淀粉中至少一種在內(nèi)的原料制得的；優(yōu)選的，所述玉米淀粉為蠟質(zhì)玉米淀粉。

按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種藥劑，其特征在于，包括上述窄分布的羥乙基淀粉；優(yōu)選的，所述藥劑為水溶液或膠體水溶液；所述窄分布的羥乙基淀粉在該藥劑中的濃度為7～15％(w/v)。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選，所述藥劑是用作動(dòng)物組織或人體組織密度分離的介質(zhì)；優(yōu)選的，所述人體組織為血液。

按照本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了上述窄分布的羥乙基淀粉在制備用于動(dòng)物組織或人體組織密度分離的介質(zhì)上的應(yīng)用。

通過(guò)本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，由于對(duì)羥乙基淀粉中的分子量分布進(jìn)行控制，使得羥乙基淀粉能夠作為動(dòng)物組織或人體組織密度分離的新型介質(zhì)。本發(fā)明中的窄分布羥乙基淀粉，其重均分子質(zhì)量Mw為250,000～400,000；優(yōu)選的，最低10％處重均分子量不小于該窄分布羥乙基淀粉重均分子量的20％，最高10％處重均分子量不大于該窄分布羥乙基淀粉重均分子量的220％；摩爾取代的MS優(yōu)選為0.3～0.7；C2/C6比優(yōu)選為4～12。該窄分布羥乙基淀粉可替代聚蔗糖或右旋糖酐，用于制備樣本密度分離液等細(xì)胞分離液藥劑，可用于分離各種細(xì)胞(如各種動(dòng)物組織及人體組織)，其生物安全性高，無(wú)細(xì)胞毒性，內(nèi)毒素含量低，分離的淋巴細(xì)胞狀態(tài)好，活力高，操作中也可縮短分離時(shí)間，提高分離效率。例如，含有本發(fā)明窄分布羥乙基淀粉的藥劑，可作為細(xì)胞分離液，尤其可通過(guò)密度分離作用，將血液樣本中不同成分分離。包含本發(fā)明中窄分布羥乙基淀粉的藥劑(該藥劑尤其可以采用水溶液或膠體水溶液的形式)除應(yīng)用于科學(xué)研究外還可應(yīng)用于臨床診斷，具有良好市場(chǎng)前景。

目前在售的羥乙基淀粉有羥乙基淀粉130/0.4，羥乙基淀粉200/0.5，主要用作代血漿產(chǎn)品，如羥乙基淀粉200/0.5，要求最低10％處重均分子量(即，10％小分子部分的重均分子量)不得小于15,000，即相應(yīng)重均分子量的10％，最高10％處重均分子量(即，10％大分子部分的重均分子量)不得大于600,000，即相應(yīng)重均分子量的300％，分子量分布較寬，作為細(xì)胞分離液不能滿足要求，無(wú)法作為細(xì)胞分離液。另外，羥乙基淀粉的分子量大小也影響其分離細(xì)胞的效果，若羥乙基淀粉的分子量太小，無(wú)法達(dá)到細(xì)胞分離液所需的密度梯度，使得分離效果不好，若羥乙基淀粉分子量過(guò)大，則容易造成細(xì)胞凝集，且易在體內(nèi)積蓄；本發(fā)明通過(guò)控將羥乙基淀粉的重均分子量Mw控制為250000～400000(優(yōu)選為280000～380000)，能夠有效實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離液所需的密度梯度，確保分離效果，并避免細(xì)胞凝集等不利影響。

本發(fā)明中窄分布羥乙基淀粉是由優(yōu)選蠟質(zhì)玉米淀粉，經(jīng)水解、分子量分級(jí)、羥乙基化、精制制得。窄分布羥乙基淀粉制備的難點(diǎn)在于特定分子量的分級(jí)篩選。本發(fā)明可以先將淀粉原料與去離子水混合配制濃度為10％～30％(w/v)的淀粉懸濁液，然后將淀粉懸濁液在90～100℃下糊化25～35分鐘得到淀粉糊化物，接著在酸性條件下對(duì)淀粉糊化物進(jìn)行水解得到淀粉水解液；然后，對(duì)淀粉水解液進(jìn)行分子量篩選得到篩選后的淀粉水解液；接著，在保護(hù)性氣體的氛圍下將篩選后的淀粉水解液與羥乙基取代劑(如氯乙醇或環(huán)氧乙烷)在氫氧化鈉催化的條件下進(jìn)行羥乙基取代反應(yīng)得到反應(yīng)液，羥乙基取代反應(yīng)的反應(yīng)溫度30～40℃，反應(yīng)時(shí)間8～12小時(shí)；然后，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行活性炭脫色處理、過(guò)濾處理、以及干燥處理，即得到窄分布羥乙基淀粉。其中，在酸性條件下對(duì)淀粉糊化物進(jìn)行水解得到淀粉水解液，可以是先用鹽酸調(diào)節(jié)淀粉糊化物的酸度至0.3～0.7mol/L，然后在40～70℃的溫度下進(jìn)行水解反應(yīng)，即得到淀粉水解液；優(yōu)選的，以水解反應(yīng)得到的淀粉水解液進(jìn)行凝膠滲透色譜檢測(cè)時(shí)，該淀粉水解液中的水解產(chǎn)物在色譜柱中的保留時(shí)間為15～17分鐘；優(yōu)選的，水解反應(yīng)的時(shí)間為2～5小時(shí)。分子量篩選是利用膜分離法，膜分離法是采用超濾膜，該超濾膜的截留分子量為30,000～100,000Da，優(yōu)選為40,000～60,000Da；超濾膜的材料為聚氯乙烯(PVC)、聚偏氟乙烯(PVDF)、或聚醚砜(PES)，優(yōu)選為聚醚砜(PES)。

目前，羥乙基淀粉系列產(chǎn)品(如羥乙基淀粉130/0.4、羥乙基淀粉200/0.5等)報(bào)道的工藝中，對(duì)于分子量的篩選多是在水解步驟完成，水解方式主要有酸水解和酶解兩種方式。但這兩種水解方式選擇性較差，其水解產(chǎn)物的分子量分布范圍較寬，無(wú)法達(dá)到窄分布羥乙基淀粉的分子量分布要求。本發(fā)明可以采用水解與膜分離相結(jié)合的方式，首先在酸水解步驟將水解產(chǎn)物分子量控制到一定范圍，然后采用特定截留分子量的膜分離系統(tǒng)對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行截留，去除不在分子量分布范圍內(nèi)的片段，最終得到具備窄分布分子量的羥乙基淀粉。該工藝沒(méi)有使用有機(jī)溶劑，避免了溶劑回收的工藝步驟，且生產(chǎn)設(shè)備常見(jiàn)，利于工業(yè)化生產(chǎn)。

據(jù)記載，羥乙基淀粉是血漿擴(kuò)容劑，具備較好的血液流變學(xué)特性，適用于臨床使用，可使促凝血酶原激酶時(shí)間快速降低，使血小板功能降低，對(duì)紅細(xì)胞集聚性沉降率有影響，有抑制紅細(xì)胞集聚作用，能增加細(xì)胞膜負(fù)電荷，使已集聚細(xì)胞解聚的作用，現(xiàn)有的細(xì)胞分離液中也常加入羥乙基淀粉以加速紅細(xì)胞沉降。

本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，特定重均分子量的羥乙基淀粉在細(xì)胞分離過(guò)程中的效果顯著，并且分子量分布越窄，效果越好，如具備本發(fā)明所載的重均分子量Mw為250000～400000(優(yōu)選為280000～380000，且10％小分子部分重均分子量不小于該羥乙基淀粉重均分子量Mw的20％，10％大分子部分重均分子量不大于該羥乙基淀粉重均分子量Mw的220％)的窄分布羥乙基淀粉，較其他羥乙基淀粉(如羥乙基淀粉480/0.7、羥乙基淀粉550)，分離效果顯著提高。

本發(fā)明制備所得窄分布羥乙基淀粉，與聚蔗糖和右旋糖酐使用效果比較，結(jié)果表明：使用以上三種化合物為主要成分的藥劑作為密度分離介質(zhì)，經(jīng)過(guò)密度梯度離心，均可使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，達(dá)到將各種血細(xì)胞分離的目的。以窄分布羥乙基淀粉為主要成分的藥劑分離血細(xì)胞生物安全性高，無(wú)細(xì)胞毒性，內(nèi)毒素含量低，分離的淋巴細(xì)胞狀態(tài)好，活力高，且使用中耗時(shí)短，分離效率高，用于細(xì)胞治療領(lǐng)域中過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率低。

附圖說(shuō)明

圖1是窄分布羥乙基淀粉的重均分子量及分子量分布圖；

圖2是樣本密度分離液分離圖示例。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。

本發(fā)明中窄分布羥乙基淀粉的制備方法，概括來(lái)說(shuō)，包括以下步驟：使懸浮于水中的淀粉，優(yōu)選蠟質(zhì)玉米淀粉，通過(guò)糊化、水解、分子量分級(jí)、羥乙基化、脫色、精制和干燥等步驟獲得。

以下為具體實(shí)施例：

實(shí)施例1

配制濃度為15％(w/v)的玉米淀粉懸浮液，95℃糊化30min，用鹽酸調(diào)節(jié)體系酸度0.5mol/L，溫度為60℃，反應(yīng)時(shí)間4小時(shí)，得淀粉水解液；淀粉水解液經(jīng)過(guò)截留分子量為50,000Da的超濾膜分離得到濃縮液；濃縮液在N₂保護(hù)下與環(huán)氧乙烷在氫氧化鈉催化下進(jìn)行羥乙基取代反應(yīng)，其中淀粉水解物:氫氧化鈉:氯乙醇的反應(yīng)摩爾比為1:0.8:0.5，反應(yīng)時(shí)間為10小時(shí)，反應(yīng)溫度為35℃；反應(yīng)液經(jīng)過(guò)活性炭脫色、過(guò)濾后進(jìn)行噴霧干燥，得到窄分布羥乙基淀粉的粉末產(chǎn)品。依據(jù)Ph.Eur.2.2.30and monograph(01/2011:1785)的方法測(cè)定產(chǎn)物的重均分子質(zhì)量Mw為2.883e+5，最低10％處重均分子量為63756.2，最高10％處重均分子量為627466.3，依據(jù)Ph.Eur.2.2.28and monograph(01/2011:1785)的方法測(cè)定產(chǎn)物的摩爾取代的MS為0.58和C2/C6比為5.6。

實(shí)施例2

以市售Ficoll-泛影酸鈉分離液為對(duì)照樣，分別以含有本發(fā)明中窄分布羥乙基淀粉、羥乙基淀粉130/0.4、羥乙基淀粉200/0.5和羥乙基淀粉480/0.7的藥劑為試驗(yàn)樣。

(i)取新鮮抗凝血，按體積1:1小心的加在Ficoll-泛影酸鈉分離液上層，室溫(18-22℃)以500g離心30分鐘，此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分四層，如圖2所示。第一層為血漿層(含血小板)。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞(單核/單個(gè)核細(xì)胞層)。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層(含大量中性粒細(xì)胞)。收集細(xì)胞放入含清洗液10mL的試管中，充分混勻后，以250g，離心10分鐘。沉淀經(jīng)反復(fù)洗2次，棄上清，即得所需細(xì)胞。

(ii)取新鮮抗凝血以基礎(chǔ)培養(yǎng)基1：1混勻，按體積比2-3：1小心的加在含有本發(fā)明中窄分布羥乙基淀粉的藥劑上層，室溫(18-22℃)以1000g離心20分鐘，此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分四層。第一層為血漿層(含血小板)。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞(單核/單個(gè)核細(xì)胞層)。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層(含大量中性粒細(xì)胞)。收集細(xì)胞放入含基礎(chǔ)培養(yǎng)基10mL的試管中，充分混勻后，以600g，離心5分鐘。沉淀經(jīng)反復(fù)洗2次，即得所需細(xì)胞。

(iii)分別采用含有羥乙基淀粉130/0.4、羥乙基淀粉200/0.5和羥乙基淀粉480/0.7的藥劑為密度離心介質(zhì)，照實(shí)驗(yàn)方案(ii)的操作，進(jìn)行細(xì)胞分離。

試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1

上述采用羥乙基淀粉(包括窄分布羥乙基淀粉、以及其他羥乙基淀粉，如羥乙基淀粉130/0.4)的藥劑中，各種羥乙基淀粉的濃度均是9％(w/v)。試驗(yàn)結(jié)果表明，含有窄分布羥乙基淀粉的藥劑作為細(xì)胞分離介質(zhì)效果顯著，優(yōu)于常用的兩種細(xì)胞分離液，對(duì)比不同分子量羥乙基淀粉產(chǎn)品作為細(xì)胞分離介質(zhì)，除含有羥乙基淀粉480/0.7的藥劑對(duì)細(xì)胞分離表現(xiàn)出一定效果外，含有羥乙基淀粉130/0.4和200/0.5的藥劑并沒(méi)有在細(xì)胞分離操作中產(chǎn)生效果。

本發(fā)明中的窄分布的羥乙基淀粉，其制備方法可參考現(xiàn)有的羥乙基淀粉制備方法，除了分子量分級(jí)這一步驟不同外，其他步驟均可參考現(xiàn)有技術(shù)。

本發(fā)明中的窄分布羥乙基淀粉可替代聚蔗糖或右旋糖酐，用于制備樣本密度分離液等藥劑。

本發(fā)明中，針對(duì)羥乙基淀粉，其10％小分子部分重均分子量、以及10％大分子部分重均分子量的具體計(jì)算測(cè)量方法可參考現(xiàn)有技術(shù)，如《歐洲藥典》7.0版等。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。