本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及豬Delta冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒的檢測(cè)，具體涉及豬Delta冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬Delta冠狀病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是一種新型豬冠狀病毒，屬于冠狀病毒科、冠狀病毒屬成員，是具有囊膜的單股正鏈RNA病毒。2012年，香港學(xué)者Woo首次報(bào)道在豬糞便中檢測(cè)到PDCoV，同時(shí)在其他哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類上也檢測(cè)到該病毒。至2014年初，美國(guó)俄亥俄州仔豬腹瀉病料中也檢測(cè)到PDCoV。PDCoV患病豬臨床癥狀為嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水、仔豬致死率高剖檢變化可見(jiàn)小腸上皮細(xì)胞有損傷。隨后在加拿大、韓國(guó)、越南、老撾等國(guó)家也報(bào)道檢測(cè)到PDCoV，其陽(yáng)性檢出率高達(dá)25％。2015年對(duì)我國(guó)華東地區(qū)豬場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)，也發(fā)現(xiàn)該病毒，說(shuō)明我國(guó)大陸豬群中也存在PDCoV的感染。在隨后的報(bào)道中，安徽、廣西、河北、江蘇等地區(qū)病料檢測(cè)結(jié)果顯示PDCoV已在我國(guó)至少存在了11年。

豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的豬腹瀉類疾病，各種年齡段、各個(gè)品種的豬均可感染此病。1971年首次在英國(guó)發(fā)現(xiàn)PED；我國(guó)于1976年首次報(bào)道了該病，在1980年第一次證實(shí)分離到PEDV，到2000年該病已經(jīng)在全國(guó)范圍內(nèi)開(kāi)始流行。特別是從2010年起，PED在我國(guó)的豬群中呈暴發(fā)性流行，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)損失；2013年春PED在美國(guó)首次暴發(fā)，哺乳仔豬的發(fā)病率高達(dá)90％；隨后，PEDV也在加拿大和墨西哥等地流行。目前PED給世界范圍內(nèi)各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)不可計(jì)數(shù)的經(jīng)濟(jì)損失，PEDV已成為危害全球養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要病原。本實(shí)驗(yàn)室從2014年10月起，對(duì)來(lái)自河南省不同地區(qū)的仔豬、母豬的疑似樣品進(jìn)行PDCoV和PEDV病原檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)部分豬場(chǎng)PDCoV和PEDV混合感染且情況嚴(yán)重。臨床上PDCoV感染的仔豬主要表現(xiàn)為水樣腹瀉、嘔吐和脫水等癥狀，和PED的臨床癥狀非常相似，單靠臨床癥狀和剖檢病理變化很難區(qū)分這兩種疾病。因此建立快速檢測(cè)PEDV和PDCoV的方法對(duì)確診這兩種疫病顯得尤為重要。

目前，針對(duì)PEDV的診斷方法很多，如病毒的分離鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、單克隆抗體技術(shù)、SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法、常規(guī)PCR方法以及核酸探針技術(shù)等。但是，這些診斷方法存在或敏感性、特異性，或操作技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，且診斷結(jié)果滯后，如病毒分離鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力耗時(shí)長(zhǎng)、血清學(xué)方法敏感性低不能早期檢測(cè)、普通PCR技術(shù)不能對(duì)病毒定量等缺點(diǎn)。新發(fā)的PDCoV檢測(cè)方法還比較少見(jiàn)，2015年Anil Thachil等建立了間接ELISA方法用于血清中PDCoV的追溯性檢測(cè)，結(jié)果顯示PDCoV早在2014年就在美國(guó)豬群中存在。逢鳳嬌等建立的PDCoV常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法，最低檢測(cè)限為4.05×10³拷貝/μL。然而不能滿足臨床上PEDV和PDCoV混合感染的快速檢測(cè)。

PDCoV和PEDV都是目前引起仔豬腹瀉的主要病原，都能夠引起仔豬不同程度的腹瀉，在豬群中具有傳播快、感染率高、流行范圍廣等特點(diǎn)，每年給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。特別是PEDV和PDCoV混合感染情況比較普遍，通過(guò)觀察臨床癥狀和病理變化很難區(qū)分這兩種病原，給臨床檢測(cè)和控制這兩種疾病造成了很大的困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決快速檢測(cè)PEDV和PDCoV這兩種疫病混合感染的技術(shù)難題，根據(jù)GenBank中收錄的PDCoV毒株HKU15-155(JQ065043)M基因和PEDV毒株CHLY-09(KF476053)ORF3基因序列設(shè)計(jì)了特異性引物，在此基礎(chǔ)上建立并完善了能同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)PDCoV和PEDV的雙重SYBR Green I熒光RT-PCR檢測(cè)方法，公開(kāi)了豬Delta冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)難題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

豬Delta冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：

(1)豬Delta冠狀病毒上、下游引物和豬流行性腹瀉病毒上、下游引物的設(shè)計(jì)；

(2)雙重實(shí)時(shí)熒光體系的準(zhǔn)備；

(3)雙重實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法的實(shí)施。

所述步驟(1)中，豬Delta冠狀病毒的上游引物如SEQ ID NO：1所示，豬Delta冠狀病毒的下游引物如SEQ ID NO：2所示；豬流行性腹瀉病毒的上游引物如SEQ ID NO：3所示，豬流行性腹瀉病毒的下游引物如SEQ ID NO：4所示。

所述步驟(2)中，雙重實(shí)時(shí)熒光體系為Premix Ex Taq^TM I 13μL，25pmol/μL的豬Delta冠狀病毒的上游引物、25pmol/μL的豬Delta冠狀病毒的下游引物各0.5μL，25pmol/μL的豬流行性腹瀉病毒的上游引物、25pmol/μL的豬流行性腹瀉病毒的下游引物各0.5μL，樣品模板2μL，用ddH₂O補(bǔ)足25μL體系。

所述步驟(3)中雙重實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法為，將步驟(2)中的雙重實(shí)時(shí)熒光體系，置于熒光定量PCR儀中，設(shè)定PCR程序?yàn)?5℃30s，94℃5s，55℃40s，72℃40s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，通過(guò)溶解曲線確定豬Delta冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒的檢測(cè)結(jié)果。

豬Delta冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法，作為同時(shí)檢測(cè)豬Delta冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明利用雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法，對(duì)采集于河南不同豬場(chǎng)的198份腹瀉仔豬樣品進(jìn)行檢測(cè)，大致掌握豬流行性腹瀉和新發(fā)豬冠狀病毒病在河南地區(qū)的感染情況。為檢測(cè)PEDV和PDCoV提供了一種新的方法，同時(shí)為規(guī)?；i場(chǎng)凈化PEDV和PDCoV這兩種病毒提供了方法，也為PEDV和PDCoV分子流行病學(xué)調(diào)查、早期診斷、診斷試劑盒的研制與開(kāi)發(fā)奠定了理論依據(jù)和技術(shù)支持。本發(fā)明的公開(kāi)為臨床診斷和防治PEDV和PDCoV提供了有力的技術(shù)支持，也為該類疫病的分子流行病學(xué)和防控研究奠定了基礎(chǔ)。

2、本發(fā)明成功的建立了PDCoV和PEDV雙重SYBR Green I熒光RT-PCR檢測(cè)方法，能夠同時(shí)快速、特異性的檢測(cè)到PEDV和PDCoV這兩種病毒，該方法具有良好的特異性、重復(fù)性和敏感性，運(yùn)用該方法對(duì)臨床198份仔豬腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與單重?zé)晒舛縍T-PCR方法對(duì)PEDV和PDCoV的檢出率一致，符合率為100％。

3、本發(fā)明從2015年1月至2016年3月從河南省不同地區(qū)的腹瀉豬群中收集的樣品，應(yīng)用所建立的雙重?zé)晒釶CR方法對(duì)其進(jìn)行PDCoV和PEDV檢測(cè)，PDCoV陽(yáng)性率為20.7％，PEDV陽(yáng)性率為29.8％，PEDV和PDCoV混合感染陽(yáng)性率為8.6％，其檢測(cè)結(jié)果可以反映出河南省部分豬場(chǎng)存在PDCoV和PEDV感染。

附圖說(shuō)明

圖1為PDCoVM基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M:DL2000Maker；1：PDCoV M基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；2：陰性對(duì)照。

圖2為PEDV ORF3基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，其中M:DL2000Maker；1：PEDV ORF3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；2：陰性對(duì)照。

圖3為熒光RT-PCR擴(kuò)增曲線圖。

圖4為雙重SYBR Green I熒光RT-PCR反應(yīng)溶解曲線圖。

圖5為雙重SYBR Green I熒光RT-PCR反應(yīng)特異性試驗(yàn)溶解曲線圖。

圖6為不同濃度重復(fù)性試驗(yàn)溶解曲線圖，其中A為濃度10⁴拷貝/μL的重組質(zhì)粒，B為濃度10⁵拷貝/μL的重組質(zhì)粒，C為濃度10⁶拷貝/μL的重組質(zhì)粒，D為濃度10⁷拷貝/μL的重組質(zhì)粒。

具體實(shí)施方式

豬Delta冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：

(1)豬Delta冠狀病毒上、下游引物和豬流行性腹瀉病毒上、下游引物的設(shè)計(jì)；

(2)雙重實(shí)時(shí)熒光體系的準(zhǔn)備；

(3)雙重實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法的實(shí)施。

所述步驟(1)中，豬Delta冠狀病毒的上游引物如SEQ ID NO：1所示，豬Delta冠狀病毒的下游引物如SEQ ID NO：2所示；豬流行性腹瀉病毒的上游引物如SEQ ID NO：3所示，豬流行性腹瀉病毒的下游引物如SEQ ID NO：4所示。

所述步驟(2)中，雙重實(shí)時(shí)熒光體系為Premix Ex Taq^TM I 13μL，25pmol/μL的豬Delta冠狀病毒的上游引物、25pmol/μL的豬Delta冠狀病毒的下游引物各0.5μL，25pmol/μL的豬流行性腹瀉病毒的上游引物、25pmol/μL的豬流行性腹瀉病毒的下游引物各0.5μL，樣品模板2μL，用ddH₂O補(bǔ)足25μL體系。

所述步驟(3)中雙重實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法為，將步驟(2)中的雙重實(shí)時(shí)熒光體系，置于熒光定量PCR儀中，設(shè)定PCR程序?yàn)?5℃30s，94℃5s，55℃40s，72℃40s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，通過(guò)溶解曲線確定豬Delta冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒的檢測(cè)結(jié)果。

豬Delta冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法，作為同時(shí)檢測(cè)豬Delta冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒的應(yīng)用。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的解釋說(shuō)明：

1材料與方法

1.1病毒株及病料

PDCoV(CH-01株)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV，HN-2012株)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)陽(yáng)性病料、豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)陽(yáng)性病料和豬偽狂犬病毒(PRV)陽(yáng)性病料均由河南省動(dòng)物源性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)疫苗購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)公司；臨床腹瀉樣品于2015年1月至2016年3月采集自河南省不同地區(qū)的腹瀉豬群。

1.2主要試劑及儀器

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自QIAGEN生化科技公司(北京)；18-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、Premix Ex Taq^TM I購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；2×Taq DNA MasterMix、2 000bpDNA ladder marker購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司(北京)；96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Roche公司(瑞士)。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Genbank中登錄的PDCoV毒株HKU15-155(JQ065043)、PEDV毒株CHLY-09(KF476053)為參照序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0基因分析軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增PDCoVM基因、PEDV ORF3基因的上游引物和下游引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為353bp和276bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用雙蒸水稀釋為25pmol/μL，-20℃保存。豬Delta冠狀病毒的上游引物如SEQ ID NO：1所示，豬Delta冠狀病毒的下游引物如SEQ ID NO：2所示；豬流行性腹瀉病毒的上游引物如SEQ ID NO：3所示，豬流行性腹瀉病毒的下游引物如SEQ ID NO：4所示。

1.4核酸提取及反轉(zhuǎn)錄

病毒懸液和臨床樣品于-20℃反復(fù)凍融3次后用于病毒核酸的提取。參照TRIzol提取總RNA說(shuō)明書提取PDCoV、PEDV、PRRSV等病毒總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存；按常規(guī)的蛋白酶K法抽提取PRV、PCV2的DNA，-70℃保存。

1.5質(zhì)粒模板標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以PDCoV、PEDV的cDNA為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，目的條帶與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取白色菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒用分光光度儀測(cè)定濃度后進(jìn)行10倍系列稀釋，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的濃度進(jìn)行分析，計(jì)算每微升質(zhì)?；蚩截悢?shù)，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。進(jìn)行雙重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增。

1.6雙重實(shí)時(shí)熒光方法的建立

采用SYBR Premix Ex Taq推薦的反應(yīng)體系，用96型熒光定量PCR儀檢測(cè)。反應(yīng)體系：Premix Ex Taq^TM I 13μL，P1、P2引物各為0.5μL，P3、P4引物各為0.5μL，pMD-18T-PDCoV和pMD-18T-PEDV各為1μL，ddH₂O 8μL，總反應(yīng)體系為25μL。反應(yīng)條件為:反應(yīng)條件：95℃30s，94℃5s，55℃40s，72℃40s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。設(shè)定程序在每個(gè)循環(huán)第2個(gè)步驟采集熒光信號(hào)，最后由軟件自動(dòng)生成擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)后得到樣本的閾值循環(huán)數(shù)(Ct)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中含有的基因拷貝數(shù)。

1.7確定雙重?zé)晒釶CR的最優(yōu)反應(yīng)條件

以制備的PDCoV和PEDV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，分別選用52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃的退火溫度及0.2μL、0.3μL、0.4μL、0.5μL、0.6μL、0.7μL、0.8μL 25pmol/μL的上下游引物濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)比較不同溫度不同濃度的上下游引物組合優(yōu)化實(shí)驗(yàn)體系，最終通過(guò)矩陣法優(yōu)選出最佳工作濃度，另外，對(duì)雙重實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件進(jìn)行摸索，確定最優(yōu)變性溫度和退火溫度。

1.8特異性試驗(yàn)

按照雙重SYBR Green I熒光RT-PCR反應(yīng)體系，分別加入TGEV、PRRSV cDNA 1μL(約20ng)，PCV2、PRV DNA 1μL(約20ng)，PDCoV和PEDV的陽(yáng)性質(zhì)粒1μL(約20ng)，滅菌水作陰性對(duì)照，應(yīng)用所建立的雙重SYBR Green I熒光PCR方法對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。

1.9重復(fù)性試驗(yàn)

以不同濃度的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行雙重SYBR Green I熒光RT-PCR反應(yīng)，每一個(gè)濃度重復(fù)三次；對(duì)PDCoV和PEDV的Cq值和溶解曲線進(jìn)行分析，驗(yàn)證雙重SYBR Green I熒光RT-PCR方法的重復(fù)性。

1.10敏感性試驗(yàn)

用紫外分光光度計(jì)測(cè)量PDCoV和PEDV的重組質(zhì)粒的OD₂₆₀值，計(jì)算每微升的拷貝數(shù)，然后用滅菌水10倍梯度稀釋，以倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行雙重SYBR Green I熒光RT-PCR反應(yīng)，確定雙重SYBR Green I熒光RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)PDCoV和PEDV的敏感性，同時(shí)設(shè)ddH₂O為陰性對(duì)照。

1.11臨床仔豬腹瀉樣品的檢測(cè)

采取河南省鶴壁、開(kāi)封、平頂山等不同豬場(chǎng)的198份腹瀉仔豬的小腸內(nèi)容物及糞便，用PBS處理病料后，提取RNA反轉(zhuǎn)錄后分別用建立的雙重?zé)晒釸T-PCR方法、單重?zé)晒舛縍T-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1PDCoV、PEDV陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

用PDCoV和PEDV引物分別對(duì)PDCoV和PEDV cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別擴(kuò)增出PDCoV 353bp、PEDV 276bp左右的片段，與預(yù)計(jì)的片段大小一致(圖1、圖2)，測(cè)序后分別與國(guó)內(nèi)外流行的PDCoV和PEDV毒株的相應(yīng)片段進(jìn)行序列分析，其核苷酸同源性為100％。將所得目的片段與PMD18-T載體連接構(gòu)建成為重組質(zhì)粒，分別命名為pMD-18T-PDCoV和pMD-18T-PEDV。測(cè)得PDCoV的重組質(zhì)粒的濃度為95.5μg/mL，PEDV的重組質(zhì)粒濃度為128.8μg/mL，經(jīng)計(jì)算pMD-18T-PDCoV質(zhì)粒濃度為2.86×10¹⁰拷貝/μL，pMD-18T-PEDV質(zhì)粒濃度為9.96×10¹⁰拷貝/μL。

2.2雙重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)正交法對(duì)不同濃度引物、退火溫度、酶濃度進(jìn)行篩選、比較、優(yōu)化，確定最佳的反應(yīng)體系為：Premix Ex Taq^TMI 15μL，P1、P2引物各為0.5μL，P3、P4引物各為0.5μL，pMD-18T-PDCoV和pMD-18T-PEDV各為1μL，ddH₂O 6μL，總體積為25μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃30s；95℃5s、58℃30s、72℃30s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。PDCoV和PEDV擴(kuò)增曲線均能產(chǎn)生特異性的單一峰值，陰性對(duì)照無(wú)峰值產(chǎn)生；擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線如(圖3)。

2.3雙重SYBR Green I熒光RT-PCR方法溶解曲線及TM值的確定

按照優(yōu)化后的擴(kuò)增條件，以PDCoV和PEDV的重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行雙重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增，經(jīng)96軟件分析后得到溶解曲線(圖4)，從圖中可以看出兩個(gè)特異性的峰值，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)后，最終確定了PDCoV的TM值是85.6℃，PEDV的TM值是81.5℃，陰性對(duì)照無(wú)峰值。

2.4特異性試驗(yàn)結(jié)果

從PDCoV和PEDV雙重SYBR Green I熒光定量RT-PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果(圖5)得出，PDCoV和PEDV雙重?zé)晒釸T-PCR有特異性的雙峰，TM值分別是85.6℃和81.5℃。陰性對(duì)照和TGEV、PRRSV、PCV2、PRV均無(wú)熒光信號(hào)。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

以10⁴～10⁷拷貝/μL重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行雙重SYBR Green I熒光RT-PCR擴(kuò)增，每個(gè)濃度重復(fù)3次，結(jié)果表明PDCoV和PEDV的TM值的變異系數(shù)低于1％，而陰性對(duì)照無(wú)峰值(表1，圖6)，說(shuō)明不同濃度的雙重SYBR Green I熒光RT-PCR方法穩(wěn)定性很好。

表1雙重SYBR Green I熒光RT-PCR不同濃度重復(fù)性試驗(yàn)分析

2.6敏感性試驗(yàn)結(jié)果

以相同體積的PDCoV和PEDV的10⁰～10⁴拷貝/μL重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行雙重SYBR Green I熒光RT-PCR擴(kuò)增，每個(gè)濃度重復(fù)3次。結(jié)果表明PDCoV重組質(zhì)粒的最低檢測(cè)到28.6拷貝/μL，PEDV重組質(zhì)粒的最低檢測(cè)到99.6拷貝/μL。

2.7臨床腹瀉樣品檢測(cè)結(jié)果

用雙重?zé)晒釸T-PCR方法和單重?zé)晒舛縍T-PCR方法兩種方法對(duì)198份臨床腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，PDCoV陽(yáng)性樣品41份，陽(yáng)性率為20.7％，PEDV陽(yáng)性樣品59份，陽(yáng)性率為29.8％；同時(shí)檢測(cè)出PEDV和PDCoV的樣品17份，陽(yáng)性率為8.6％。與單重?zé)晒舛縍T-PCR方法對(duì)PEDV和PDCoV的檢出率一樣，符合率100％(表2)。

表2雙重?zé)晒釸T-PCR和單重?zé)晒舛縍T-PCR臨床檢測(cè)結(jié)果

3討論

PDCoV和PEDV都是目前引起仔豬腹瀉的主要病原，都能夠引起仔豬不同程度的腹瀉，在豬群中具有傳播快、感染率高、流行范圍廣等特點(diǎn)，每年給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。特別是PEDV和PDCoV混合感染情況比較普遍，通過(guò)觀察臨床癥狀和病理變化很難區(qū)分這兩種病原，給臨床檢測(cè)和控制這兩種疾病造成了很大的困難。本發(fā)明以PDCoVM基因和PEDV ORF3基因?yàn)槟康男蛄?，建立了能同時(shí)檢測(cè)PDCoV和PEDV的SYBR Green I雙重?zé)晒釸T-PCR方法，并將所建立的雙重?zé)晒夥椒▽?duì)臨床收集的仔豬腹瀉樣品進(jìn)行PEDV和PDCoV檢測(cè)，結(jié)果顯示本研究建立的雙重?zé)晒釸T-PCR方法能同時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)PDCoV和PEDV，這為PDCoV和PEDV的臨床鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查研究奠定了基礎(chǔ)。

目前，針對(duì)PEDV的診斷方法很多，如病毒的分離鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、單克隆抗體技術(shù)、SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法、常規(guī)PCR方法以及核酸探針技術(shù)等。但是，這些診斷方法存在或敏感性、特異性，或操作技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，且診斷結(jié)果滯后，如病毒分離鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力耗時(shí)長(zhǎng)、血清學(xué)方法敏感性低不能早期檢測(cè)、普通PCR技術(shù)不能對(duì)病毒定量等缺點(diǎn)。SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法具有敏感度高，特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，但是單重方法對(duì)于檢測(cè)因多種病毒引起的腹瀉來(lái)說(shuō)，經(jīng)常會(huì)耽誤檢測(cè)時(shí)間，因此建立同時(shí)檢測(cè)兩種疾病的方法對(duì)于臨床具有重要的意義。新發(fā)的PDCoV檢測(cè)方法還比較少見(jiàn)，2015年Anil Thachil等建立了間接ELISA方法用于血清中PDCoV的追溯性檢測(cè)，結(jié)果顯示PDCoV早在2014年就在美國(guó)豬群中存在。逢鳳嬌等建立的PDCoV常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法，最低檢測(cè)限為4.05×10³拷貝/μL。然而不能滿足臨床上PEDV和PDCoV混合感染的快速檢測(cè)。本發(fā)明建立的雙重?zé)晒釶CR方法可以在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)出PEDV和PDCoV，且具有較好的特異性和敏感性，可以應(yīng)用于臨床上這兩種病原的快速檢測(cè)。

目前國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)同時(shí)檢測(cè)PDCoV和PEDV的雙重SYBR Green I熒光RT-PCR方法的相關(guān)報(bào)道，因此本發(fā)明根據(jù)PDCoVM基因和PEDV ORF3基因序列分別設(shè)計(jì)了特異性引物，建立了能過(guò)同時(shí)檢測(cè)PEDV和PDCoV的雙重SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法，最低檢測(cè)到PDCoV和PEDV分別28.6拷貝/μL和99.6拷貝/μL的質(zhì)粒濃度，敏感性是普通RT-PCR方法的300倍,檢測(cè)不到其他病毒。試驗(yàn)中利用TM值的不同對(duì)目的核酸進(jìn)行區(qū)分，核酸片段的TM值主要與目的片段的GC含量、序列長(zhǎng)度和序列結(jié)構(gòu)有關(guān)系。在本發(fā)明中所設(shè)計(jì)的PDCoV的目的基因GC含量相對(duì)設(shè)計(jì)的PEDV的GC含量較高，并且兩者目的片段的長(zhǎng)度不同，故PEDV和PDCoV的TM值可以很好的區(qū)分。這兩種病毒的TM值在一定的范圍內(nèi)變動(dòng)，PEDV的TM值變化范圍為81.2～81.9℃，PDCoV的TM值變化范圍為85.4～85.9℃，由此可以利用溶解曲線的兩個(gè)特異峰對(duì)應(yīng)的TM值進(jìn)行這2重的鑒別與診斷。

2010年以來(lái)，PED在我國(guó)多省豬群中以一種新的流行特點(diǎn)暴發(fā)，發(fā)病嚴(yán)重、致死率高2015年3月，在中國(guó)江西仔豬爆發(fā)流行性腹瀉，通過(guò)PCR檢測(cè)到PDCoV。Song等通過(guò)巣式RT-PCR檢測(cè)中國(guó)江西的腹瀉豬，結(jié)果表明PDCoV單獨(dú)感染率為33.71％，PDCoV和PEDV混合感染率為19.66％，證實(shí)在中國(guó)江西爆發(fā)的腹瀉病豬上PDCoV具有很高的檢出率。Dong等對(duì)我國(guó)江蘇、安徽、湖北等地的仔豬腹瀉情況調(diào)查顯示PDCoV陽(yáng)性率可達(dá)6.51％，PEDV陽(yáng)性率可達(dá)51.2％。本次試驗(yàn)中所檢測(cè)的病料是本實(shí)驗(yàn)室從2015年1月至2016年3月從河南省不同地區(qū)的腹瀉豬群中收集的樣品，應(yīng)用所建立的雙重?zé)晒釶CR方法對(duì)其進(jìn)行PDCoV和PEDV檢測(cè)，PDCoV陽(yáng)性率為20.7％，PEDV陽(yáng)性率為29.8％，PEDV和PDCoV混合感染陽(yáng)性率為8.6％，其檢測(cè)結(jié)果可以反映出河南省部分豬場(chǎng)存在PDCoV和PEDV感染。

4結(jié)論

本發(fā)明成功的建立了PDCoV和PEDV雙重SYBR Green I熒光RT-PCR檢測(cè)方法，能夠同時(shí)快速、特異性的檢測(cè)到PEDV和PDCoV這兩種病毒，該方法具有良好的特異性、重復(fù)性和敏感性，運(yùn)用該方法對(duì)臨床198份仔豬腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與單重?zé)晒舛縍T-PCR方法對(duì)PEDV和PDCoV的檢出率一致，符合率為100％。該方法為檢測(cè)PEDV和PDCoV提供了一種新的方法，同時(shí)為規(guī)?；i場(chǎng)凈化PEDV和PDCoV這兩種病毒提供了方法，也為PEDV和PDCoV分子流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)病機(jī)制，早期診斷，診斷試劑盒的研制與開(kāi)發(fā)奠定了理論依據(jù)和技術(shù)支持。

<110> 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 豬Delta冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法及其應(yīng)用

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