本發(fā)明涉及動(dòng)物病原分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測仔豬臍帶血中豬細(xì)小病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒及其用途。

背景技術(shù)：

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)可以引起豬細(xì)小病毒病，該病可以引起母豬尤其是初產(chǎn)母豬產(chǎn)弱仔、死胎及流產(chǎn)等繁殖障礙，也有報(bào)道稱PPV可引起仔豬皮炎、腹瀉及呼吸道疾病。該病分布廣泛，全世界范圍內(nèi)均可發(fā)生。該病一年四季均可發(fā)生，但在每年4～10月母豬產(chǎn)仔、交配的季節(jié)多發(fā)。該病呈地方性流行或者散發(fā)，本病發(fā)生后，豬場可連續(xù)幾年不斷出現(xiàn)繁殖失敗。該病的主要傳染對(duì)象是青年母豬，尤其是頭胎母豬感染性極強(qiáng)，病毒進(jìn)入胎盤可損害胎盤以及胎兒的很多組織器官，導(dǎo)致死胎、木乃伊胎的發(fā)生。

目前，PPV較為成熟的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要以血清學(xué)檢測抗體或可通過抗體反應(yīng)間接檢測病毒，主要包括：(1)血凝(HA)：多用于對(duì)病毒培養(yǎng)物的檢測，依賴于病毒的血凝活性，因此易受病毒傳代、保存時(shí)限的影響。(2)血凝抑制試驗(yàn)(HI)：該方法具有操作簡便，不需要特殊設(shè)備等特點(diǎn)，因此國內(nèi)長期用于抗體的檢測。但該方法使用紅細(xì)胞，需對(duì)檢測樣品做繁雜的處理，雖能進(jìn)行快速、大量的診斷，但靈敏度低、特異性不強(qiáng)，只能做輔助診斷方法。(3)中和試驗(yàn)(SN)：用于中和抗體的檢測，該方法比HI更加敏感，但操作也更為復(fù)雜。(4)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：多用于抗體檢測，Hodals等(1988年)、Westenbrink等(1989年)、邱明建等(1989年)分別建立了ELISA方法用于檢測PPV抗體，該方法靈敏度高，適合PPV的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查。在實(shí)踐中，由于疫苗的使用，很難通過抗體檢測區(qū)分疫苗免疫與野毒感染，需要檢測抗原的ELISA方法。姜永厚(1997年)建立了檢測PPV抗原的ELISA方法，比HA敏感、快速。(5)免疫熒光抗體：Rivera等(1986年)應(yīng)用固相免疫熒光技術(shù)快速檢測PPV感染胎兒的抗原與抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該技術(shù)與ELISA具有一致的高敏感性，免疫熒光技術(shù)具有快速、特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)，但在臨床應(yīng)用過程中常受到試驗(yàn)條件的限制。但是血清學(xué)檢測技術(shù)存在以下缺點(diǎn)：(1)對(duì)豬群中存在的免疫耐受現(xiàn)象評(píng)估較難，相對(duì)不能更加有效、直觀和高精準(zhǔn)反映豬群的抗體水平。(2)血樣及組織樣本采集需要多人協(xié)助，且需要特殊設(shè)備，采集過程相對(duì)比較費(fèi)時(shí)。而血清學(xué)檢測技術(shù)存在上述缺點(diǎn)的原因在于：①血清學(xué)檢測方法是抗原和抗體反應(yīng)，僅檢測1次無法準(zhǔn)確判斷豬群的感染狀況和排毒狀況；②血清學(xué)檢測抗體，檢測的抗體水平高低無法精確定量檢測分析，血清學(xué)僅能評(píng)價(jià)機(jī)體體液免疫產(chǎn)生的水平，很難直接評(píng)價(jià)病原情況；③血清學(xué)評(píng)估豬群健康度、對(duì)無癥狀帶毒和免疫耐受的豬群評(píng)估存在技術(shù)上的瓶頸；④血清學(xué)需要采集前腔靜脈血，血樣采集相對(duì)費(fèi)力、費(fèi)時(shí)、且需要特殊設(shè)備輔助，多人協(xié)助。

分子診斷技術(shù)近年來用于檢測動(dòng)物病原，極大的提高診斷的敏感性與特異性，主要包括：(1)核酸探針：核酸探針技術(shù)是一種分子水平的檢測技術(shù),特別適用于疾病的早期診斷。核酸探針技術(shù)檢測的技術(shù)含量高，僅適合在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。(2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)：PPV屬于小細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，基因組為單鏈線狀負(fù)鏈DNA的分子，是自主復(fù)制性的DNA病毒，因此可用PCR的方法來擴(kuò)增并檢測病毒核酸。國內(nèi)外已有很多PPV的PCR檢測方法研究報(bào)道，這些方法雖然應(yīng)用比較廣泛，但技術(shù)含量要求高或未能形成產(chǎn)品化，只能在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，不適合大面積臨床診斷和現(xiàn)場應(yīng)用。分子診斷技術(shù)存在以下缺點(diǎn)：(1)需要復(fù)雜的儀器設(shè)備：核酸提取儀器、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)和分析軟件。(2)操作復(fù)雜操作時(shí)間長：需要提取核酸、PCR試劑配置、PCR反應(yīng)、電泳、凝集成像、分析結(jié)果等，做一次病原檢測需要近一天時(shí)間。(3)結(jié)果相對(duì)不可靠：非常容易污染，即使是國內(nèi)權(quán)威的實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果都存在假陽性結(jié)果。(4)技術(shù)操作要求高：很難在基層推廣，豬場配備了設(shè)備但是沒有人和時(shí)間使用。(5)質(zhì)量控制不到位，難以標(biāo)準(zhǔn)化。分子診斷技術(shù)存在上述缺點(diǎn)的原因在于：①普通PCR本身操作較復(fù)雜操作時(shí)間較長；②普通PCR所用試劑相對(duì)成本較低所導(dǎo)致。同時(shí)上述檢測方法實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用較多，臨床應(yīng)用較少。

目前的檢測多是在規(guī)?；i場出現(xiàn)疑似豬細(xì)小病毒病的疫情后，送檢患病豬的病料(包括流產(chǎn)或死產(chǎn)胎兒的腦、肺、肝、腎和母豬胎盤)，利用常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，結(jié)合該豬場其他情況給出診斷報(bào)告并制定疫病防控計(jì)劃。一方面由于這種“事后”檢測導(dǎo)致診斷結(jié)果對(duì)豬場疫病防控的指導(dǎo)意義有一定的局限性，無法做到未雨綢繆。另一方面，常規(guī)PCR方法操作時(shí)間較長，操作過程中容易發(fā)生污染。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種較新的核酸檢測技術(shù)，具備靈敏度高、快速便捷、抗污染能力強(qiáng)、安全系數(shù)好、結(jié)果可視化等優(yōu)點(diǎn)。通過對(duì)探針的巧妙設(shè)計(jì)，可以檢測區(qū)分單個(gè)的核苷酸堿基差異，因此能很好的用于不同類型毒株的差異化檢測。

豬屬于上皮絨毛胎盤，豬胎盤生理正常的結(jié)構(gòu)即血胎屏障，胎盤屏障的存在使正常的臍帶血內(nèi)不存在任何病原和抗體等大分子物質(zhì)，但在如某些病毒單獨(dú)或協(xié)同感染的情況下，屏障通透性變化導(dǎo)致病原從母體垂直傳播至新生個(gè)體。PPV病毒顆粒小，且主要引起繁殖障礙相關(guān)癥狀，且鑒于豬的多病毒混合感染非常嚴(yán)重，因此采用從仔豬臍帶血中檢測PPV來評(píng)價(jià)及預(yù)警豬細(xì)小病毒病的發(fā)病情況，這種尋找“源頭”的檢測方法更加科學(xué)、直接、有效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提出一種檢測仔豬臍帶血中豬細(xì)小病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒。該試劑盒具有靈敏度高、特異性好、重復(fù)性優(yōu)、檢測結(jié)果快速客觀準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能同時(shí)反映母、仔豬PPV帶毒狀況，評(píng)估母豬疫苗的免疫效果，有益于對(duì)豬群PPV感染和免疫情況的早期預(yù)警評(píng)判，進(jìn)一步有助于豬場做好該疾病的防控工作。

基于上述目的，本發(fā)明提供了一種檢測仔豬臍帶血中豬細(xì)小病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，包括擴(kuò)增引物和特異性熒光探針，所述擴(kuò)增引物和特異性熒光探針的序列如下所示：

上游擴(kuò)增引物PPV-f：5’-GAACAAGAAATATTCAATGTAGTA-3’，其為SEQ ID NO:1序列；

下游擴(kuò)增引物PPV-r：5’-TGTGTTATTGGTGTCTAGT-3’，其為SEQ IDNO:2序列；

特異性熒光探針PPV-p：FAM-5’-CAGCAACCTCACCACCAACC-3’-TAMRA，其為SEQ ID NO:3序列，其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，TAMRA為熒光淬滅基團(tuán)。

合理的引物和熒光探針設(shè)計(jì)是成功應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的關(guān)鍵。引物和探針的特異性對(duì)反應(yīng)有很大影響，如果引物和探針特異性不高，可能在擴(kuò)增構(gòu)成中產(chǎn)生非靶標(biāo)條帶，影響檢測結(jié)果的判定。

PPV基因組為單鏈線狀DNA分子，主要有2個(gè)開放閱讀框(ORF)，5’端的ORF編碼3種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2、NS3，3’端ORF編碼2種結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2，VP3是VP2的水解產(chǎn)物。本發(fā)明對(duì)GenBank中公布的PPV和其它宿主的細(xì)小病毒毒株基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，篩選出PPV病毒基因組中VP2基因的一段基因片段，該基因片段在豬細(xì)小病毒中高度保守，大小為123bp，作為本發(fā)明設(shè)計(jì)引物的靶片段。發(fā)明人針對(duì)該保守片段設(shè)計(jì)了多對(duì)引物和探針，最終根據(jù)擴(kuò)增效果(擴(kuò)增效率、靈敏度等)篩選出本發(fā)明的引物和探針。該引物為只針對(duì)PPV的通用上下游擴(kuò)增引物，且匹配性和特異性良好。同時(shí)在該上下游引物擴(kuò)增區(qū)123bp片段間設(shè)計(jì)了高度保守的特異性熒光探針，該特異性熒光探針能與PPV病毒核酸特異性結(jié)合，引物進(jìn)行擴(kuò)增過程中，探針發(fā)生酶解，致熒光積累被儀器檢測到。該組引物與探針擴(kuò)增效率較好，能特異性擴(kuò)增PPV核酸，同其它宿主細(xì)小病毒無交叉。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴(kuò)增引物PPV-f、所述下游擴(kuò)增引物PPV-r和所述特異性熒光探針PPV-p的摩爾比為2:2:1。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴(kuò)增引物PPV-f、所述下游擴(kuò)增引物PPV-r在所述試劑盒中的終濃度為0.3～0.6μM，所述特異性熒光探針PPV-p在所述試劑盒中的終濃度為0.15～0.3μM。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、熒光PCR反應(yīng)液(含酶)、病毒裂解液及說明書。

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光PCR反應(yīng)液，該反應(yīng)液中含有UNG酶系統(tǒng)，在擴(kuò)增環(huán)節(jié)可以有效解決擴(kuò)增污染現(xiàn)象，抗污染能力強(qiáng)等。本發(fā)明的熒光PCR反應(yīng)液中還含有dNTPs、TaqDNA聚合酶和一些增強(qiáng)成分(MgCl₂、DMSO或甲酰胺)的混合物，具體的增強(qiáng)成分根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行添加。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述陰性對(duì)照為無DNA酶的ddH₂O，所述陽性對(duì)照為含有豬細(xì)小病毒VP2基因序列的克隆質(zhì)粒pEASY-VP2，克隆質(zhì)粒pEASY-VP2的終濃度為1.0×10⁵copies/μL～1.0×10⁷copies/μL；所述病毒裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS 0.1-0.2％；③吐溫20 1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40 1-2％。

在本發(fā)明中，所述豬細(xì)小病毒VP2基因123bp目的片段的核苷酸序列如下所示：

GAACAAGAAATATTCAATGTAGTACTTAAAACAATTACAGAATCAGCAACCTCACCACCAACCAAAATATATAATAATGATCTAACTGCAAGCTTAATGGTCGCACTAGACACCAATAACACA，其為SEQ ID NO:4序列。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述克隆質(zhì)粒pEASY-VP2采用以下方法制備得到：提取豬細(xì)小病毒DNA，利用引物PPV-f和PPV-r擴(kuò)增得到豬細(xì)小病毒VP2基因序列，通過TA克隆將該豬細(xì)小病毒VP2基因序列連接至pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆，測序正確的克隆質(zhì)粒命名為pEASY-VP2。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種所述的檢測仔豬臍帶血中豬細(xì)小病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(1)使用所述的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)體系以20μL計(jì)為：

熒光PCR反應(yīng)液(含酶)：15μL；

10μM SEQ ID NO:1所示的上游擴(kuò)增引物PPV-f：0.6～1.2μL；

10μM SEQ ID NO:2所示的下游擴(kuò)增引物PPV-r：0.6～1.2μL；

10μM SEQ ID NO:3所示的特異性熒光探針PPV-p：0.3～0.6μL；

DNA模板：2～4μL；

ddH₂O：補(bǔ)足至20μL；

(2)實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件為：50℃UNG酶激活2min；95℃預(yù)變性5min；95℃變性15Sec，60℃退火30Sec并收集熒光，共40個(gè)循環(huán)；結(jié)束反應(yīng)；

(3)結(jié)果分析：

質(zhì)量控制：陰性對(duì)照FAM通道檢測無Ct值；陽性對(duì)照FAM通道檢測Ct值≤30；上述條件同時(shí)滿足，檢測結(jié)果有效；

結(jié)果判定：FAM通道檢測Ct值≤40，則判定樣品為豬細(xì)小病毒感染陽性；FAM通道檢測無Ct值，則判定樣品為豬細(xì)小病毒感染陰性。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述DNA模板采用以下方法制備得到：

(1)臍帶血全血、病料組織可使用商品化DNA提純?cè)噭┖羞M(jìn)行提取，提取方法參照所使用試劑盒說明書；或者

(2)臍帶血分離血漿或血清使用本發(fā)明試劑盒中所提供的病毒裂解液進(jìn)行DNA釋放；具體為：微量取血漿或血清1-2μL置PCR反應(yīng)管中，加入等體積的病毒裂解液，混勻室溫靜置5min，加入熒光PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增；

病毒裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-0.2％；③吐溫20，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-2％。

本發(fā)明在核酸提取環(huán)節(jié)中，直接使用鹽酸胍、SDS、吐溫20、NP40對(duì)微量樣本中的病毒進(jìn)行高效裂解，DNA經(jīng)釋放后可穩(wěn)定存在，直接用于后續(xù)PCR反應(yīng)。為避免溶血對(duì)PCR的影響，建議溶血嚴(yán)重樣本使用商品化DNA提純?cè)噭┖羞M(jìn)行提取。

在本發(fā)明中，為了使同一樣本獲得最大的擴(kuò)增效率和最小的Ct值，對(duì)待檢臍帶血中提取的DNA模板濃度、引物濃度和特異性熒光探針的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，尤其是探針的濃度。引物濃度過低會(huì)影響擴(kuò)增效率，引物濃度過高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)，同樣特異性熒光探針濃度過低會(huì)引起特異性的熒光信號(hào)變?nèi)?，而濃度過高則會(huì)引起探針與模板發(fā)生非特異性結(jié)合，產(chǎn)生非特異性熒光信號(hào)從而干擾特異性熒光信號(hào)，待檢臍帶血中提取的DNA模板濃度會(huì)影響PCR擴(kuò)增的效率，應(yīng)根據(jù)目的基因的大小選擇合適的DNA模板濃度。本發(fā)明經(jīng)過一系列優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定本發(fā)明的熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，采用本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測豬細(xì)小病毒的擴(kuò)增效率達(dá)到90％以上，并可獲得最小的Ct值。

更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了所述的試劑盒在制備檢測仔豬臍帶血中豬細(xì)小病毒試劑中的用途。

本發(fā)明將豬細(xì)小病毒的VP2基因和TaqMan探針相結(jié)合，在豬細(xì)小病毒的VP2基因選取保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和特異性探針，通過對(duì)待檢臍帶血中提取的DNA模板濃度、引物濃度以及特異性熒光探針濃度等進(jìn)行優(yōu)化，建立了仔豬臍帶血中豬細(xì)小病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的檢測范圍為10⁸-10²copies/μL，可以從豬細(xì)小病毒感染臍帶血中檢測到最低100copies的豬細(xì)小病毒核酸，靈敏度是常規(guī)PCR方法的300倍。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)豬藍(lán)耳經(jīng)典株，豬圓環(huán)病毒，豬輪狀病毒，豬傳染性胃腸炎病毒，豬偽狂犬病毒，豬流行性腹瀉病毒，乙型腦炎病毒，豬瘟病毒，犬細(xì)小病毒等的細(xì)胞培養(yǎng)物及正常細(xì)胞均無非特異性反應(yīng)，說明該方法特異性和可靠性強(qiáng)。準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于陽性對(duì)照與陰性對(duì)照的檢測，該方法與常規(guī)PCR方法檢測結(jié)果100％符合；對(duì)于臨床樣品的檢測，該方法檢測豬細(xì)小病毒陽性6/67，常規(guī)PCR方法檢測豬細(xì)小病毒陽性5/67，且后者檢測的5份樣品使用該方法檢測均為陽性，說明該方法比常規(guī)PCR方法更敏感，準(zhǔn)確性高。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)不同核酸濃度(10⁶、10⁵、10⁴copies/μL)的陽性對(duì)照pEASY-VP2克隆質(zhì)粒檢測變異系數(shù)(CV)均小于2％，具有較好的重復(fù)性。

本發(fā)明利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法代替常規(guī)PCR方法，并制備成試劑盒，主要通過檢測豬臍帶血中是否含有PPV，評(píng)估及預(yù)警豬群PPV感染狀況，及時(shí)制定防控計(jì)劃。同時(shí)，本發(fā)明的方法亦可用于對(duì)發(fā)病豬病料組織的檢測，檢測更準(zhǔn)確、快速。

綜上所述，本發(fā)明建立的檢測仔豬臍帶血中豬細(xì)小病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR方法和基于該方法建立的試劑盒具有準(zhǔn)確度高，靈敏度高，特異性強(qiáng)和重復(fù)性優(yōu)的特點(diǎn)，可以用于豬細(xì)小病毒感染的病原學(xué)研究、早期診斷，對(duì)豬細(xì)小病毒的快速診斷、綜合防控、病原凈化和早期治療具有重要意義。

本發(fā)明試劑盒檢測快速、準(zhǔn)確、敏感，更適用于臍帶血中微量的PPV檢測。本發(fā)明應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測仔豬臍帶血中豬細(xì)小病毒的工作原理：豬屬于上皮絨毛胎盤，豬胎盤生理正常的結(jié)構(gòu)即血胎屏障，胎盤屏障的存在使正常的臍帶血內(nèi)不存在任何病原和抗體等大分子物質(zhì)，但在如某些病毒單獨(dú)或協(xié)同感染的情況下，屏障通透性變化導(dǎo)致病原從母體垂直傳播至新生個(gè)體。PPV病毒顆粒小，且主要引起繁殖障礙相關(guān)癥狀，且鑒于豬的多病毒混合感染非常嚴(yán)重，因此采用從仔豬臍帶血中檢測PPV來評(píng)價(jià)及預(yù)警豬細(xì)小病毒病的發(fā)病情況，這種尋找“源頭”的檢測方法更加科學(xué)、直接、有效?；谀殠а臋z測步驟為：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)DNA提取；(4)實(shí)時(shí)熒光PCR：利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物和探針進(jìn)行；(5)判定結(jié)果。

本發(fā)明還提供了一種臍帶血的采集方法，具體步驟如下：

(1)取干凈的青霉素瓶和瓶塞，清洗干凈，煮沸滅菌30分鐘，烘干后收集備用；

(2)當(dāng)仔豬出生時(shí)，將每頭母豬分娩的所有仔豬的“臍帶血”都擠到一個(gè)干凈的青霉素瓶中，每頭仔豬3-5滴即可；若母豬分娩出現(xiàn)木乃伊、死胎時(shí)，同窩仔豬臍帶血重點(diǎn)檢測；弱仔的臍帶血可以另外單獨(dú)再收集一份，重點(diǎn)檢測；

(3)臍帶血收集完后蓋好瓶塞，用標(biāo)簽紙或者醫(yī)用白膠布在青霉素瓶做好標(biāo)記，注明采集時(shí)間、母豬耳號(hào)、胎次等信息；

(4)將收集的臍帶血的青霉素瓶放至-20℃冰箱冷凍保存，送至實(shí)驗(yàn)室檢測，并附上采集臍帶血樣品的數(shù)量、母豬耳號(hào)、需要檢測項(xiàng)目的清單。

本發(fā)明臍帶血的采集方法克服現(xiàn)有常規(guī)采血技術(shù)的耗時(shí)長、采血困難、對(duì)豬只應(yīng)激大等問題，臍帶血采集簡單、方便、快捷和無應(yīng)激。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的試劑盒具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明的檢測方法克服了常規(guī)檢測技術(shù)耗時(shí)長、敏感度低、安全系數(shù)低、抗污染能力差和不能準(zhǔn)確定量等問題，檢測快速高效，不會(huì)造成樣品交叉污染。

(2)本發(fā)明的檢測方法準(zhǔn)確度高，靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性優(yōu)，可以實(shí)現(xiàn)較大通量樣品的檢測。

(3)本發(fā)明的檢測方法不僅適用于檢測臍帶血檢測，還適用于待檢豬的脾臟、淋巴結(jié)、血清及血漿等樣品，可用于任何實(shí)驗(yàn)室和基層各級(jí)防控單位、獸醫(yī)站及大中小型養(yǎng)殖場等。

(4)在日常豬細(xì)小病毒檢測及疾病凈化過程中，需進(jìn)行活體采樣，對(duì)豬群的應(yīng)激較大，難度也高，而臍帶血避免了這些問題，臍帶血雖然含毒量相對(duì)于組織而言要低，在實(shí)際應(yīng)用中也對(duì)組織及對(duì)應(yīng)臍帶血進(jìn)行了相互印證，確保本發(fā)明檢測方法的特異性及敏感性。

(5)本發(fā)明操作簡單操作時(shí)間短，做一次病原檢測僅需要2-3小時(shí)，快捷迅速、節(jié)約成本；而且需要儀器設(shè)備相對(duì)簡單，不需要電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)及其分析軟件；結(jié)果相對(duì)可靠，不需要電泳，空氣中氣溶膠相對(duì)較少，不易污染；技術(shù)操作要求低，可以在基層大量推廣；基于該檢測方法制備的試劑盒易于質(zhì)量控制，易于標(biāo)準(zhǔn)化。

附圖說明

圖1為本發(fā)明陽性對(duì)照10倍稀釋的梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖2為本發(fā)明敏感性檢測結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明特異性檢測結(jié)果圖。

圖4為本發(fā)明重復(fù)性檢測結(jié)果圖；

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1檢測仔豬臍帶血中豬細(xì)小病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的組成

(1)熒光PCR反應(yīng)液(含酶)：該反應(yīng)液中含有UNG酶系統(tǒng)，在擴(kuò)增環(huán)節(jié)可以有效解決擴(kuò)增污染現(xiàn)象，抗污染能力強(qiáng)等；

(2)上下游引物組PPV-f和PPV-r：由上海生工生物工程公司合成，用DEPC水配制成濃度為10μM。

上游擴(kuò)增引物PPV-f：5’-GAACAAGAAATATTCAATGTAGTA-3’，其為SEQ ID NO:1序列；

下游擴(kuò)增引物PPV-r：5’-TGTGTTATTGGTGTCTAGT-3’，其為SEQID NO:2序列；

(3)特異性熒光探針PPV-p：由華大基因公司合成，用DEPC水配制成濃度為10μM。

特異性熒光探針PPV-p：FAM-5’-CAGCAACCTCACCACCAACC-3’-TAMRA，其為SEQ ID NO:3序列，其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，TAMRA為熒光淬滅基團(tuán)；

本發(fā)明對(duì)GenBank中公布的PPV和其它宿主的細(xì)小病毒毒株基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，在PPV病毒基因組高度保守的VP2基因上設(shè)計(jì)了只針對(duì)PPV的通用上下游擴(kuò)增引物，且匹配性和特異性良好。同時(shí)在該上下游引物擴(kuò)增區(qū)123bp片段間計(jì)了高度保守的特異性熒光探針，該特異性熒光探針能與PPV病毒核酸特異性結(jié)合，引物進(jìn)行擴(kuò)增過程中，探針發(fā)生酶解，致熒光積累被儀器檢測到。該組引物與探針擴(kuò)增效率較好，能特異性擴(kuò)增PPV核酸，同其它宿主細(xì)小病毒無交叉。

(4)陽性對(duì)照為克隆有豬細(xì)小病毒VP2基因片段的重組質(zhì)粒pEASY-VP2，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，質(zhì)粒在紫外分光光度計(jì)OD260nm測定質(zhì)量濃度，按公式6.02×10²³×(X ng/μL×10^-9)/DNA length×660換算為拷貝數(shù)，配制濃度為1.0×10⁵copies/μL～1.0×10⁷copies/μL；

其中，克隆質(zhì)粒pEASY-VP2的構(gòu)建方法如下：①按照商業(yè)試劑盒操作說明書提取豬細(xì)小病毒核酸；以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作為特異性引物擴(kuò)增VP2基因中123bp目的片段，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1min；95℃變性10Sec，60℃退火30Sec，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min，4℃保溫5min。PCR產(chǎn)物于2％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定；②PCR產(chǎn)物的純化、克隆及序列分析：PCR產(chǎn)物用AXYGEN公司的AxyPrep DNA GelExcraction Kit膠回收試劑盒回收，通過TA克隆將豬細(xì)小病毒VP2基因中123bp目的片段克隆至pEASY-T1載體，然后轉(zhuǎn)化Trans1-T1Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12h-18h。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit 1質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，然后用引物進(jìn)行擴(kuò)增和測序，測序后比對(duì)成功的克隆質(zhì)粒命名pEASY-VP2。

豬細(xì)小病毒VP2基因123bp目的片段的核苷酸序列如下所示：

GAACAAGAAATATTCAATGTAGTACTTAAAACAATTACAGAATCAGCAACCTCACCACCAACCAAAATATATAATAATGATCTAACTGCAAGCTTAATGGTCGCACTAGACACCAATAACACA(SEQ ID NO:4)。

(5)陰性對(duì)照為無DNAase的ddH₂O；

(6)病毒裂解液

病毒裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-0.2％；③吐溫20，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-2％。

本發(fā)明DNA模板根據(jù)不同的樣本情況，采用以下兩種不同的方法制備得到：

(1)臍帶血全血、病料組織可使用商品化DNA提純?cè)噭┖羞M(jìn)行提取，方法參照所使用試劑盒說明書；或者

(2)臍帶血分離血漿或血清使用本發(fā)明試劑盒中所提供的病毒裂解液進(jìn)行DNA釋放；具體為：微量取血漿或血清1-2μL置PCR反應(yīng)管中，加入等體積的病毒裂解液，混勻室溫靜置5min，加入熒光PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增；

本發(fā)明在核酸提取環(huán)節(jié)中，直接使用鹽酸胍、SDS、吐溫20、NP40對(duì)微量樣本中的病毒進(jìn)行高效裂解，DNA經(jīng)釋放后可穩(wěn)定存在，直接用于后續(xù)PCR反應(yīng)。為避免溶血對(duì)PCR的影響，建議溶血嚴(yán)重樣本使用商品化DNA提純?cè)噭┖羞M(jìn)行提取。

(7)使用說明書。

實(shí)施例2檢測仔豬臍帶血中豬細(xì)小病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的使用方法

本發(fā)明試劑盒使用方法具體包括以下步驟：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)DNA提??；(4)實(shí)時(shí)熒光PCR：利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測；(5)判定結(jié)果。

1.樣品采集

(1)臍帶血樣品采集

a.取干凈的青霉素瓶和瓶塞，清洗干凈，煮沸滅菌30分鐘，烘干后收集備用；

b.當(dāng)仔豬出生時(shí)，將每頭母豬分娩的所有仔豬的“臍帶血”都擠到一個(gè)干凈的青霉素瓶中，每頭仔豬3-5滴即可，將其“臍帶血”擠到青霉素瓶，密封；

注意事項(xiàng)：①必須要采集同窩母豬產(chǎn)的所有的仔豬，避免同窩母豬所產(chǎn)仔豬的個(gè)體差異造成漏檢；②可以雙人操作，也可以單獨(dú)操作，若仔豬臍帶血不便擠出，可以將臍帶剪成幾段再操作即可；③若母豬分娩出現(xiàn)木乃伊，死胎時(shí)，同窩仔豬臍帶血重點(diǎn)檢測；④弱仔的臍帶血可以另外單獨(dú)再收集一份，重點(diǎn)檢測；

c.臍帶血收集完后蓋好瓶塞，用標(biāo)簽紙或者醫(yī)用白膠布在青霉素瓶做好標(biāo)記，注明采集時(shí)間、母豬耳號(hào)、胎次等信息；

d.將收集的臍帶血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷凍保存，送至實(shí)驗(yàn)室檢測，并附上采集臍帶血樣品的數(shù)量、母豬耳號(hào)、需要檢測項(xiàng)目的清單。

(2)病料樣品(扁桃體、腎臟、肺臟和淋巴結(jié)等)

A、剖解取內(nèi)臟：將患病豬剖解，取出完整的上述內(nèi)臟，放置在同一個(gè)干凈塑料袋內(nèi)。

B、記錄：將裝有內(nèi)臟的塑料袋密封，貼標(biāo)簽并記錄發(fā)病豬的日齡、體重、品種、臨床癥狀等信息。

C、將采集的病料樣品集中送至實(shí)驗(yàn)室，并附上所記錄的信息。

2.DNA提取

(1)使用商業(yè)試劑盒進(jìn)行DNA提純(按商業(yè)試劑盒說明書操作)。

(2)臍帶血分離血漿或血清使用本發(fā)明試劑盒中提供的病毒裂解液進(jìn)行DNA釋放。微量取血漿或血清1-2μL置PCR反應(yīng)管中，加入等體積的病毒裂解液，混勻室溫靜置5min，加入反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。

所述病毒裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-0.2％；③吐溫20，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-2％；

本發(fā)明在核酸提取環(huán)節(jié)中，直接使用鹽酸胍、SDS、吐溫20、NP40對(duì)微量樣本中的病毒進(jìn)行高效裂解，DNA經(jīng)釋放后可穩(wěn)定存在，直接用于后續(xù)PCR反應(yīng)。為避免溶血對(duì)PCR的影響，建議溶血嚴(yán)重樣本使用商品化DNA提純?cè)噭┖羞M(jìn)行提取。

為監(jiān)測提取過程中的污染，建議在提取樣本的同時(shí)提取一管水作為陰性對(duì)照。

3.熒光PCR反應(yīng)

對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化原則為：通過優(yōu)化使同一樣本獲得最大的擴(kuò)增效率和最小的Ct值。經(jīng)過優(yōu)化，實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下所示：

(1)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系以20μL計(jì)為：10μM SEQ ID NO:1所示的上游擴(kuò)增引物PPV-f：0.6～1.2μL；10μM SEQ ID NO:2所示的下游擴(kuò)增引物PPV-r：0.6～1.2μL；10μM SEQ ID NO:3所示的特異性熒光探針PPV-p：0.3～0.6μL；熒光PCR反應(yīng)液(含酶)：15μL；DNA模板：2～4μL；ddH₂O：補(bǔ)足至20μL。

同時(shí)設(shè)有陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽性對(duì)照克隆質(zhì)粒pEASY-VP2：2～4μL，其余組分相同；陰性對(duì)照無DNA酶的ddH₂O：2～4μL，其余組分相同。

(2)實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件為：50℃UNG酶激活2min；95℃預(yù)變性5min；95℃變性15Sec，60℃退火30Sec并收集熒光，共40個(gè)循環(huán)；結(jié)束反應(yīng)。

(3)結(jié)果分析：

質(zhì)量控制：陰性對(duì)照FAM通道檢測無Ct值；陽性對(duì)照FAM通道檢測Ct值≤30；上述條件同時(shí)滿足，檢測結(jié)果有效；

結(jié)果判定：FAM通道檢測Ct值≤40，則判定樣品為豬細(xì)小病毒感染陽性；FAM通道檢測無Ct值，則判定樣品為豬細(xì)小病毒感染陰性。

實(shí)施例3檢測仔豬臍帶血中豬細(xì)小病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的驗(yàn)證

1.試劑盒擴(kuò)增效率驗(yàn)證

對(duì)陽性對(duì)照克隆質(zhì)粒pEASY-VP2進(jìn)行10倍梯度稀釋，使其拷貝數(shù)為：10⁸-10¹copies/μL，每個(gè)梯度重復(fù)三次進(jìn)行豬細(xì)小病毒實(shí)時(shí)熒光PCR，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1為本發(fā)明陽性對(duì)照10倍稀釋的梯度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線(FAM通道)，其中該標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)如下：斜率：-3.60，截距：43.10，相關(guān)系數(shù)：1.00，擴(kuò)增效率：0.90。

綜上，說明該試劑盒檢測豬細(xì)小病毒核酸的擴(kuò)增效率均達(dá)到90％以上。

2.靈敏度試驗(yàn)

以10倍梯度稀釋的陽性對(duì)照克隆質(zhì)粒pEASY-VP2作為模板，進(jìn)行本發(fā)明試劑盒的靈敏度檢測，檢測范圍為10⁸-10¹copies/μL。結(jié)果表明，該方法的檢測范圍為10⁸-10²copies/μL，在此范圍的病毒含量可以得到可靠的結(jié)果，即該方法的靈敏度可以檢測到最低100拷貝數(shù)的病毒含量的樣品，檢測結(jié)果見圖2。

3.特異性試驗(yàn)

為了檢測本發(fā)明試劑盒的特異性，利用本發(fā)明的試劑盒檢測豬藍(lán)耳經(jīng)典株，豬圓環(huán)病毒，豬輪狀病毒，豬傳染性胃腸炎病毒，豬偽狂犬病毒，豬流行性腹瀉病毒，乙型腦炎病毒，豬瘟病毒，犬細(xì)小病毒等9種病毒的提取核酸。

檢測結(jié)果表明：本發(fā)明的試劑盒僅對(duì)PPV進(jìn)行擴(kuò)增，表明本發(fā)明試劑盒能特異性擴(kuò)增PPV，而不與其它核酸發(fā)生交叉反應(yīng)，檢測結(jié)果見圖3。

4.重復(fù)性試驗(yàn)

選用陽性對(duì)照pEASY-VP2克隆質(zhì)粒10⁶、10⁵、10⁴copies/μL，對(duì)每個(gè)濃度的樣本做3個(gè)重復(fù)，結(jié)果不同核酸濃度的檢測變異系數(shù)(CV)均小于2％，具有較好的重復(fù)性。檢測結(jié)果見表1和圖4。

表1實(shí)時(shí)熒光PCR檢測豬細(xì)小病毒的重復(fù)性試驗(yàn)

5.準(zhǔn)確性臨床驗(yàn)證

采用本發(fā)明的試劑盒以及普通PCR方法對(duì)67份臍帶血樣品以及5份健康的臍帶血樣品進(jìn)行了PPV檢測，結(jié)果表明，對(duì)于臨床樣品的檢測，該試劑盒方法檢測PPV陽性6/67，常規(guī)PCR方法檢測PPV陽性5/67，且后者檢測的5份樣品使用該試劑盒方法檢測均為陽性，說明該試劑盒方法更敏感，準(zhǔn)確性高；對(duì)于PPV陰性臨床樣品的檢測，該試劑盒方法檢測結(jié)果同常規(guī)PCR方法一致。檢測結(jié)果見表2。

表2采用本發(fā)明試劑盒以及普通PCR對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測結(jié)果的比較

綜上可見，本發(fā)明設(shè)計(jì)的一對(duì)特異性引物和一條特異性熒光探針以及構(gòu)成的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒可以快速鑒定仔豬臍帶血中的豬細(xì)小病毒，而且該檢測方法簡單、快速、特異性好、靈敏度高、可重復(fù)性好，檢測結(jié)果真實(shí)可靠。

所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：以上任何實(shí)施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開的范圍(包括權(quán)利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實(shí)施例或者不同實(shí)施例中的技術(shù)特征之間也可以進(jìn)行組合，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡明它們沒有在細(xì)節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>湖南新南方養(yǎng)殖服務(wù)有限公司

<120>一種檢測仔豬臍帶血中豬細(xì)小病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒及其用途

<130> FI160696-ND

<160> 4

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

gaacaagaaatattcaatgtagta 24

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

tgtgttattggtgtctagt 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

cagcaacctcaccaccaacc 20

<210> 4

<211> 123

<212> DNA

<213> PPV VP2基因序列

<400> 4

gaacaagaaatattcaatgtagtacttaaaacaattacagaatcagcaacctcaccacca 60

accaaaatatataataatgatctaactgcaagcttaatggtcgcactagacaccaataac 120

aca 123