本發(fā)明涉及分子生物技術領域，具體來說是一種精確測量人群端粒長度的方法。

背景技術：

端粒，是特殊的核蛋白復合物，由進化上保守的串聯重復DNA序列TTAGGG組成，位于真核生物染色體末端，在真核細胞生物學中起到重要作用。端粒的縮短起到有絲分裂計數器和壽命限制的作用，能在細胞水平反應器官的衰老。端粒長度的研究，對端粒及端粒相關疾病甚至腫瘤的研究方面極其重要。端粒長度測量是研究端粒生物學及端粒功能失調對退行性疾病影響的重要手段。臨床上，端粒長度測量被廣泛運用于診斷端粒相關疾病，包括心血管疾病、進行性肝硬化、風濕性關節(jié)炎等。精確可靠的端粒長度測量對端粒臨床意義的研究極其需要。

目前，常用的測量端粒長度方法還沒有一種能做到精確、容易和快速，且目前所采用的端粒測量方法操作復雜，要求較高，或需要大量DNA樣本，很難進行人群端粒長度的精確測量及比較。末端限制性片段(Terminal Restriction Fragment，TRF)分析法是首次用于檢測端粒長度的方法，被認為是端粒測量的黃金標準法(gold standard)，但TRF分析需要大量的DNA(0.5～5μg，≥10⁶個細胞)，同時，它對基因組的完整性及DNA樣本純度要求較高。熒光原位雜交定量法(Quantitative-fluorescence in situ hybridization，Q-FISH)要求每個樣本中至少有15～20個處于分裂中期的細胞，才能獲得可靠的端粒長度測量。結合流式細胞術(flow cytometry)的熒光原位雜交(Flow-FISH)也用于測量端粒長度，但整個過程較為費時，技術昂貴，且操作要求苛刻。

實時定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)法測量端粒長度的主要原理是用特異的引物來擴增端粒，通過收集熒光估算出端粒的總長度(T)，用單拷貝基因的引物擴增單拷貝基因，來估算基因組拷貝數(S)，根據T/S比率，估算出每個二倍體基因組中端粒的平均長度。而RT-qPCR最主要的局限在于樣本之間可變性較大，移液過程中誤差大，此外，這個方法還需要進行假設，包括各DNA樣本完整性一致，都為二倍體，核型穩(wěn)定等。對于結果而言，不同RT-qPCR實驗所測出的端粒長度也很難進行比較。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是針對背景技術存在的問題，提供一種精確測量人群端粒長度的方法。

為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是：一種精確測量人群端粒長度的方法，其特征在于，該測量方法單拷貝基因選用編碼酸性核糖體磷蛋白質P0的36B4基因，步驟包括：

(1)人基因組DNA提?。红o脈穿刺取血150～200μl，用血液基因組提取試劑盒提取樣本基因組DNA，同時計算其濃度和純度；

(2)設計標準物和引物并合成；

(3)設計端粒和36B4標準曲線：

①端粒標準曲線設計，根據引物合成報告書中的分子質量MW＝26667.2μg/μmole，阿伏伽德羅常數Avogadro’s number＝6.02×10²³，端粒標準品的質量MW/Avogadro’s number＝0.44×10^-19g，計算出最高濃度的標準物Standard A相當于有1.14×10¹²kb端粒，稀釋六個端粒標準物A～F(10¹²～10⁷)，最低濃度的標準物相當于含1.14×10⁷kb端粒，端粒標準曲線對樣品的端?？傞L度進行度量，得出具體數值；②根據引物合成報告書中的分子質量MW＝23268.15μg/μmole，單拷貝基因標準品的質量MW/Avogadro’s number＝0.38×10-¹⁹，計算出最高濃度的標準物Standard A含20pg的36B4合成物，相當于2.63×10⁸個基因組拷貝，稀釋六個36B4標準物A～F(10⁸～10³)，最低濃度的標準物相當于有2630個基因組拷貝，通過單拷貝基因標準曲線對樣品的基因組數量進行度量；

(4)RT-qPCR法測量人群端粒長度：樣品體系和標準品體系按Power SYBR Green mastermix(2×)10μl、引物-F 1μl、引物-R1μl、雙蒸水4μl、DNA 4μl，20μl體系；按95℃10min，95℃15s、60℃1min、×40，進行PCR反應；

(5)數據分析：樣本的端?？傞L度和基因組拷貝數，二者的比率就是樣本的端粒絕對長度。

進一步的，步驟(2)中，所述標準物包括端粒標準物和36B4標準物，所述端粒標準物序列如SEQ ID No.1所示，所述36B4標準物序列如SEQ ID No.2所示。

進一步的，步驟(2)中，所述引物序列為：

Telo-F CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT

Telo-R GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT

36B4-F CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC

36B4-R CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA。

本發(fā)明的有益技術效果是：本發(fā)明在RT-qPCR法的基礎上加入端粒標準曲線和單拷貝基因標準曲線對T、S值進行更準確度量，以此獲得更準確的端粒長度，且DNA用量少，僅需60ng，測量速度快，有可比性，能精確的大批量測量出端粒長度，特別適合人群端粒長度測量。

具體實施方式

下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

1、人的基因組DNA提取

靜脈穿刺取血150～200μl，用北京天根血液基因組提取試劑盒進行人樣本基因組DNA提取。

取細胞DNA提取液5μl，加入495μl的三蒸水稀釋500倍，紫外分光光度計測定260nm和280nm波長的OD值，DNA濃度的計算公式如下：

DNA的濃度(μg/μl)＝OD₂₆₀×稀釋倍數×50/1000

DNA的純度為OD260與OD₂₈₀的比值，當OD260/OD280在1.8左右時，說明樣本DNA的純度較高，比值如果大于1.9，說明樣品有RNA污染，比值如果小于1.6，說明樣本有蛋白質等污染。

2、設計標準物和引物并合成；

3、設計端粒和36B4標準曲線：

①端粒標準曲線設計，根據引物合成報告書中的分子質量MW＝26667.2μg/μmole，阿伏伽德羅常數Avogadro’s number＝6.02×10²³，端粒標準品的質量MW/Avogadro’s number＝0.44×10^-19g，計算出最高濃度的標準物Standard A相當于有1.14×10¹²kb端粒，稀釋六個端粒標準物A～F(10¹²～10⁷)，最低濃度的標準物相當于含1.14×10⁷kb端粒，端粒標準曲線對樣品的端?？傞L度進行度量，得出具體數值；②根據引物合成報告書中的分子質量MW＝23268.15μg/μmole，單拷貝基因標準品的質量MW/Avogadro’s number＝0.38×10^-19，計算出最高濃度的標準物Standard A含20pg的36B4合成物，相當于2.63×10⁸個基因組拷貝，稀釋六個36B4標準物A～F(10⁸～10³)，最低濃度的標準物相當于有2630個基因組拷貝，通過單拷貝基因標準曲線對樣品的基因組數量進行度量；

。端粒長度和基因組數的標準曲線，將樣本中的總端粒長度除以樣本中的總基因組數，得到樣本中的每個基因組端粒平均長度。

4、RT-qPCR法測量人群端粒長度

(1)引物及標準物按實驗濃度要求進行溶解和稀釋后，-20℃保存，稀釋引物及標準品4℃?zhèn)溆貌怀^1周。

(2)RT-qPCR反應體系為：

樣本體系：

為確保實驗數據的穩(wěn)定和準確，每個樣本都進行三次平行重復實驗，采用ABI八連管。同時進行的端粒標準曲線反應體系中，只需將DNA樣本換為標準物，此外，還需要在每個標準物小管中加入質粒DNA(E.coli)，以保證標準物小管中的總DNA的量也為20ng。在加樣過程中需要特別小心，避免吸樣和加樣誤差，同時，由于Power SYBR Green含高濃度去垢劑，容易起泡，因此，在取樣和加樣過程中，應避免小泡產生以造成誤差。同時，在加樣到八連管的過程中，也要保證混樣均勻，取量精確，避免實驗誤差的產生。同時，為確保每一板樣本的值有可比性并減少實驗誤差，需要在每一板中加入陽性對照(已知端粒長度的樣本DNA)和空白對照。

(3)在PCR儀上設置標準曲線法并準確設置好每個標準品的值，將空白對照、陽性對照、標準物、樣本放入ABI實時熒光定量PCR儀上，循環(huán)條件為：

95℃10min；95℃15s，60℃1min(40個循環(huán))

5、數據分析

反應結束后，檢查陽性對照擴增及無擴增的陰性對照，觀察標準物和樣品的擴增，確保每個目標樣品都落在標準曲線生成的直線范圍內——任何擴增出這條直線范圍的樣品都應該在接下來的分析中舍棄。單個樣品都一式三份的分析，并且只有Ct值的標準誤﹤1Ct(CV﹥5％)這個數據才能被接受。樣品的標準物要是大于1Ct，那么在接下來的分析中這個數據就應該被丟棄，并且重新分析。

系統依據標準曲線給每個樣品分別生成兩個定量值，即每個目標樣本的端?？傞L度(kb/reaction)和基因組拷貝數(基因組拷貝數/reaction)，二者的比率就是樣本的端粒絕對長度(TL/diploid genome，kb)。

本技術領域技術人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術語(包括技術術語和科學術語)具有與本發(fā)明所屬領域中的普通技術人員的一般理解相同的意義。還應該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術語應該被理解為具有與現有技術的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。

最后所應說明的是：以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術方案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應該理解：依然可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。