本發(fā)明涉及單克隆抗體的純化技術(shù)，更具體地說涉及單克隆抗體下游純化過程中有效去除宿主蛋白的方法。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)階段單克隆抗體下游工藝平臺(tái)一般主要包括發(fā)酵液澄清、捕獲步驟、精純步驟、病毒滅活與過濾、超濾濃縮。隨著CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平得到了很大的提高，但伴隨培養(yǎng)過程中外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的大量添加和細(xì)胞密度的呈數(shù)量級(jí)的增加，所以細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物中的成分越來越復(fù)雜。宿主蛋白HCP(HostCellProtein)就是其中一種復(fù)雜的污染物，宿主蛋白HCP的復(fù)雜性和異質(zhì)性取決于表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)胞株或者細(xì)胞培養(yǎng)條件。不同細(xì)胞株或者相同細(xì)胞株不同的上游細(xì)胞培養(yǎng)條件均會(huì)對(duì)宿主蛋白HCP污染物的種類和含量有較大影響。宿主蛋白HCP污染物的清除在生物制藥工藝開發(fā)中是需要非常關(guān)注的，其在藥物開發(fā)中的危險(xiǎn)性在于其可以引起免疫原反應(yīng)，為了保證病人用藥的安全性這些過程相關(guān)的雜質(zhì)需要被清除到一個(gè)低的水平，無論是在小試還是在放大階段都是需要特別注意的，建立有效的去除宿主蛋白HCP的下游工藝條件并且在每一步工藝后有效的監(jiān)控宿主蛋白HCP的去除效率，最終使其含量符合標(biāo)準(zhǔn)也是非常必要的。對(duì)于單克隆抗體工藝平臺(tái)中HCP的去除方法主要包括深層過濾和層析方法。深層過濾：發(fā)酵液澄清深層過濾來完成培養(yǎng)液中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片的去除。發(fā)酵料液的雜質(zhì)主要包含完整細(xì)胞、死亡細(xì)胞產(chǎn)生的碎片、宿主蛋白HCP、DNA和可溶性小分子。深層過濾膜采用了疏松多空的纖維素骨架結(jié)構(gòu)，并填充了硅藻土成分，進(jìn)樣端的表面孔徑成漏斗狀，這些結(jié)構(gòu)擯棄了傳統(tǒng)微濾表面截留結(jié)構(gòu)易造成阻塞、過濾效率低的缺點(diǎn)，又具備了離心機(jī)所沒有的截留小體積細(xì)胞碎片的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)依靠硅藻土的吸附作用，能截留高達(dá)50％的DNA和15％的宿主蛋白HCP，這一點(diǎn)是其他處理方式所不具備的。層析方法包括粗純步驟中的ProteinA親和層析和精純步驟中的離子層析(陰離子交換層析和陽離子交換層析)，ProteinA親和層析由于其對(duì)單克隆抗體和Fc融合蛋白吸附的特異性其他雜質(zhì)較難與ProteinA色譜相結(jié)合，可以清除很大比例的收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液中雜質(zhì)。已有數(shù)據(jù)表明ProteinA親和色譜層析可以有效的去除大于90％的宿主蛋白HCP，大多數(shù)的宿主蛋白HCP污染物經(jīng)ProteinA親和色譜時(shí)不與色譜結(jié)合而直接流穿。精純步驟中的陰和陽離子交換層析可以去除其他仍然殘留的微量雜質(zhì)包括殘留的工藝相關(guān)的雜質(zhì)如：宿主蛋白HCP，DNA，內(nèi)毒素，脫落蛋白A(leachedProteinA)和培養(yǎng)基添加物，和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)如：高分子量聚體(Aggregate)，低分子量碎片。通常單克隆抗體經(jīng)過粗純步驟后各種雜質(zhì)含量均已降低，但為了用藥安全，還需精純步驟進(jìn)一步將雜質(zhì)含量去除到原液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以下。傳統(tǒng)的單克隆抗體工藝平臺(tái)中深層過濾、ProteinA親和層析、一步或者兩步精純層析等幾種下游純化工藝均需要對(duì)HCP進(jìn)行有效去除的去除，才能逐步將HCP含量降至可接受標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)，但是HCP的含量很難被降低到10ppm，尤其是1ppm以下。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題而提供一種單克隆抗體下游純化過程中有效去除宿主蛋白的方法。本發(fā)明一方面提供了一種單克隆抗體下游純化過程中有效去除宿主蛋白的方法，該方法包括以下步驟：(1)深層過濾細(xì)胞培養(yǎng)液，收集濾出液；(2)對(duì)步驟(1)得到的濾出液進(jìn)行ProteinA親和層析；(3)對(duì)步驟(2)得到的樣品進(jìn)行病毒滅活，并對(duì)病毒滅活后的樣品進(jìn)行深層過濾，由此有效地去除包含單克隆抗體的樣品中的宿主蛋白。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，所述細(xì)胞培養(yǎng)液是CHO細(xì)胞培養(yǎng)液。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(2)中ProteinA親和層析利用ProteinADiamond作為親和層析的填料。在本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選例中，ProteinA親和層析所用的淋洗液為25mMTris-HCl，50mMNaCl，pH7.4±0.2。在本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選例中，ProteinA親和層析所用的洗脫液為100mM乙酸-乙酸鈉pH3.6±0.2。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(3)深層過濾使用X0HC深層過濾膜。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，病毒滅活為S/D病毒滅活。在本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選例中，S/D病毒滅活使用磷酸三丁酯(TnBP)作為助溶劑，使用聚山梨酯80作為表面活性劑。在本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選例中，S/D病毒滅活中所用磷酸三丁酯的重量濃度為0.3％，所用聚山梨酯80的重量濃度為1％，在本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選例中，S/D病毒滅活過程為將步驟(2)得到的樣品的pH值調(diào)節(jié)至5.2±0.2，加入S/D至終濃度為0.3％TnBP+1％聚山梨酯80，室溫孵育0.8-1.2小時(shí)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(3)得到的樣品中宿主蛋白的含量為2.3ppm。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括依次用陰離子交換層析和陽離子交換層析處理步驟(3)所得的樣品。本發(fā)明再一方面提供了一種含有低含量宿主蛋白的單克隆抗體制品，所述單克隆抗體制品按照以下方法制備：(1)深層過濾細(xì)胞培養(yǎng)液，收集濾出液；(2)對(duì)步驟(1)所得的濾出液進(jìn)行ProteinA親和層析；(3)對(duì)步驟(2)所得的樣品進(jìn)行病毒滅活，并對(duì)病毒滅活后的樣品進(jìn)行深層過濾；(4)對(duì)步驟(3)所得的樣品進(jìn)行陰離子交換層析；(5)對(duì)步驟(4)所得的樣品進(jìn)行陽離子交換層析；(6)對(duì)步驟(5)所得的樣品進(jìn)行超濾濃縮。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，本發(fā)明提供的單克隆抗體制品中宿主蛋白不高于0.3ppm。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，單克隆抗體制品中宿主蛋白為0.3ppm。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，單克隆抗體制品中宿主蛋白為0.2ppm。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選例中，單克隆抗體制品中宿主蛋白為0.1ppm。具體實(shí)施方式針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中單克隆抗體下游純化過程中宿主蛋白去除方面存在的缺陷，本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，將病毒滅活后的樣品用深層過濾處理，進(jìn)一步優(yōu)化了ProteinA親和層析的條件和病毒滅活后的深層過濾條件。使用本發(fā)明的方法，可有效地將單克隆抗體制品中的宿主蛋白去除。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。因此本發(fā)明提供了一種單克隆抗體下游純化過程中有效去除宿主蛋白的方法，該方法包括(1)深層過濾細(xì)胞培養(yǎng)液，收集濾出液；(2)對(duì)步驟(1)得到的濾出液進(jìn)行ProteinA親和層析；(3)對(duì)步驟(2)得到的樣品進(jìn)行病毒滅活，并對(duì)病毒滅活后的樣品進(jìn)行深層過濾，由此有效地去除包含單克隆抗體的樣品中的宿主蛋白。本發(fā)明的方法中，單克隆抗體沒有特別的限制，其可以是任何類型的單克隆抗體，例如IgG、IgA、IgE、IgD、IgM等類型。本發(fā)明的方法中，單克隆抗體是體外發(fā)酵生產(chǎn)的，使用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不局限與目前通過的各種雜交瘤細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)。優(yōu)選的是CHO細(xì)胞。本發(fā)明的方法中，通過深層過濾細(xì)胞培養(yǎng)液收集濾出液過程中對(duì)深層過濾沒有特別的要求，所用的深層過濾膜和過濾條件只要能夠使得到的濾出液可用于下一步的ProteinA親和層析都是可以接受的。該步驟中所用深層過濾膜可以使用與病毒滅活后深層過濾步驟相同的過濾膜，也可以使用不相同的過濾膜。該步驟用于除去發(fā)酵料液的部分雜質(zhì)，包含完整細(xì)胞、死亡細(xì)胞產(chǎn)生的碎片、宿主蛋白HCP、DNA和可溶性小分子。本發(fā)明的方法中，ProteinA親和層析用于清除很大比例的細(xì)胞培養(yǎng)液中的雜質(zhì)，尤其是宿主蛋白HCP，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的宿主蛋白HCP污染物經(jīng)ProteinA親和色譜時(shí)不與色譜結(jié)合而直接流穿。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，ProteinA親和層析使用ProteinADiamond(博格隆)作為柱填料，使用該填料時(shí)優(yōu)選淋洗緩沖液25mMTris-HCl，50mMNaCl，pH7.4±0.2。本發(fā)明的方法中，病毒滅活可以采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，只要所述技術(shù)對(duì)單克隆抗體分子不構(gòu)成破壞，并且不影響其后續(xù)處理。本發(fā)明針對(duì)重組抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)人源化單克隆抗體，優(yōu)選的病毒滅活采用S/D(溶劑/去污劑)處理，更優(yōu)選地使用助溶劑為0.3％磷酸三丁酯，表面活性劑為1％聚山梨酯80。本發(fā)明的方法中，病毒滅活后再次引入深層過濾用于除去在滅活的過程中產(chǎn)生的一些不溶性雜質(zhì)，降低溶液濁度，同時(shí)可以去除其他不溶性雜質(zhì)例如：宿主蛋白HCP，聚體，脂類蛋白，DNA等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，病毒滅活后深層過濾選擇深層過濾膜X0HC能夠有效地去除上述雜質(zhì)。本發(fā)明的方法通過將深層過濾應(yīng)用于病毒滅活后的樣品的過濾，同時(shí)對(duì)ProteinA親和層析和病毒滅活后的深層過濾工藝進(jìn)行優(yōu)化選擇。深層過濾細(xì)胞培養(yǎng)液收集到的濾出液通過ProteinA親和層析和病毒滅活后深層過濾兩個(gè)純化步驟就可以將宿主蛋白HCP的含量降至2.3ppm。病毒滅活后深層過濾得到的樣品經(jīng)過進(jìn)一步的陰離子交換層析和陽離子交換層析可將宿主蛋白HCP的含量降至0.4ppm，再經(jīng)過進(jìn)一步的超濾濃縮制備的單克隆抗體原液中宿主蛋白HCP的含量可降至0.3ppm。同時(shí)本發(fā)明的方法清除了對(duì)宿主蛋白HCP檢測(cè)存在干擾的導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不成線性的某種特定HCP的品種，最終制備的單克隆抗體制品中宿主蛋白HCP檢測(cè)結(jié)果呈線性。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比按重量計(jì)算?？贵w本發(fā)明實(shí)施例所用抗體是重組抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)人源化單克隆抗體，下文以GB222代替，在體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)酵表達(dá)而得到，動(dòng)物細(xì)胞為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，單克隆抗體為IgG1類型，其氨基酸序列與原研藥阿瓦斯汀(Avastin)相同。細(xì)胞培養(yǎng)CHO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)工藝進(jìn)行種子細(xì)胞培養(yǎng)，種子細(xì)胞培養(yǎng)4天，細(xì)胞密度達(dá)到3～8×106cells/mL時(shí)，按1:4無菌接種到含有CDFortiCHOTMMedium基礎(chǔ)培養(yǎng)基的細(xì)胞反應(yīng)器中培養(yǎng)。細(xì)胞的起始接種密度在0.6～1.5×106cells/mL范圍內(nèi)，活率大于90％。初始培養(yǎng)參數(shù)，溫度：37℃，轉(zhuǎn)速：60rpm，pH：6.8～7.2，溶氧(pO2)：50％。培養(yǎng)第5天，7天，9天和11天補(bǔ)加4.5％(V/V)的CDEfficientFeedTMCAGTTM流加培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第8天時(shí)，將培養(yǎng)溫度降低至32℃，其它培養(yǎng)條件不變，直至細(xì)胞培養(yǎng)14天結(jié)束。此時(shí)細(xì)胞密度10-20×106個(gè)/毫升，細(xì)胞活力80-95％，表達(dá)量：0.6-1.2mg/ml。收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清將深層過濾膜(D0HC(貨號(hào)MD0HC10FS1，廠家：默克))連接于蠕動(dòng)泵后(蠕動(dòng)泵選擇方面只要能符合流速需求即可)，用超純水沖洗深層過濾膜，沖洗體積為10CV。然后深層過濾緩沖液25mMTris-HCl+100mMNaCl，pH7.4±0.2沖洗深層過濾膜，沖洗體積為1CV，沖洗流速為100–300LMH。過濾細(xì)胞培養(yǎng)液并立即開始收集濾出液，過濾流速為100–300LMH。上樣結(jié)束后，用深層過濾緩沖液25mMTris-HCl+100mMNaCl，pH7.4±0.2頂洗過濾膜并收集濾出液，沖洗體積為2CV，過程中控制膜前壓力不超過2bar。以下的實(shí)例工藝一為現(xiàn)有工藝，實(shí)例工藝二為本發(fā)明優(yōu)化后的工藝。實(shí)例工藝一：粗純工藝：ProteinA親和層析+低pH值病毒滅活ProteinA親和層析填料為JWT203(生產(chǎn)廠商：JSR)。深層過濾得到的上清液上樣，流速為300cm/h，層析柱載量保證小于35mg/ml填料。上樣完畢后切換至淋洗液25mMTris-HCl，50mMNaClpH7.4以300cm/h流速?zèng)_洗層析柱5CV。之后進(jìn)行洗脫操作，洗脫液為100mM乙酸-乙酸鈉(pH3.6±0.2,導(dǎo)電率0.9±0.2mS/cm)，流速為300cm/h。UV280進(jìn)行檢測(cè)，UV280讀數(shù)升至0.5AU開始收集洗脫峰，再次降至0.5AU值時(shí)停止收集。樣品于室溫調(diào)節(jié)pH值至3.5-3.7，1-2小時(shí)進(jìn)行低pH病毒滅活工序。精純和超濾工藝：陰離子交換層析、陽離子交換層析和超濾精純工藝包括陰離子交換層析和陽離子交換層析。粗純后的樣品經(jīng)過精純層析后制備原液。陰離子交換層析選取CaptoQ填料(生產(chǎn)廠商：GEhealthcare)。預(yù)平衡液(50mMTris-HCl+1MNaCl,pH8.0)平衡層析柱2CV，之后用平衡液(50mMTris-HCl,pH8.0)平衡層析柱3CV，樣品上樣，流速為240cm/h。收集流穿UV280讀數(shù)升至0.1AU開始收集洗脫峰。層析柱載量保證小于40mg/ml填料。上樣完畢后切換至平衡液240cm/h流速?zèng)_洗層析柱3CV。UV280降至0.1AU停止收集。收集樣品進(jìn)入下一步陽離子交換層析，陽離子交換層析選取FractogelEMDCOO-(M)(生產(chǎn)廠商：默克)。平衡液(50mM乙酸-乙酸鈉,pH5.2)平衡層析柱3CV，將GB222樣品上樣，流速為180cm/h，層析柱載量保證小于45mg/ml填料。上樣完畢后切換至平衡液180cm/h流速?zèng)_洗層析柱5CV。之后進(jìn)行洗脫操作，洗脫液為：50mM乙酸-乙酸鈉和300mM氯化鈉，pH5.2，平衡液和洗脫液0-100％梯度洗脫10CV，流速為180cm/h，洗脫過程中收集洗脫樣品。精純后的樣品經(jīng)過超濾換液，步驟為：將型號(hào)為P3C030C05，孔徑為30KD(生產(chǎn)廠家：默克)的超濾膜包清洗干凈并用20mM磷酸鈉pH6.0緩沖液沖洗至膜后端pH為6.0。將陽離子層析樣品用蠕動(dòng)泵泵入超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，控制進(jìn)口端流速為300LMH，跨膜壓力為0.3～0.7bar，初次濃縮至約20mg/ml，之后用20mM磷酸鈉pH6.0緩沖液進(jìn)行10倍等體積換液，結(jié)束后進(jìn)行排空超濾膜回收蛋白，即為原液。各工段的樣品取樣檢測(cè)蛋白濃度和HCP含量，見表1?？贵w濃度測(cè)定方法：1.分光光度計(jì)比色皿沖洗干凈，用超純水作為對(duì)照，于280nm波長(zhǎng)，進(jìn)行調(diào)零；2.用超純水對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，稀釋至濃度為0.1-1.0mg/mL，比色皿中加入稀釋好的樣品，測(cè)定在280nm的吸光值，并按照以下公式計(jì)算供試品濃度：C＝A*N/K，式中：C為樣品濃度，A為樣品280nm的吸光值，N為稀釋倍數(shù)，K為抗體消光系數(shù)1.66。HCP含量測(cè)定方法：1.依次加入約160μL/孔各梯度標(biāo)準(zhǔn)品(0-100ng/mL)和供試品于96孔低吸附板；2.取100μLAnti-CHO:HRP于Anti-CHOcoatedmicrotiterstrips；3.用多道移液器將1微孔板中溶液轉(zhuǎn)移至Anti-CHOcoatedmicrotiterstrips，50μL/孔，并反復(fù)吸、吹打混勻5～10次，每個(gè)樣均平行雙復(fù)孔；4.用封板膜或96孔板蓋封住包被板，置于恒溫孵育器或振蕩器上，轉(zhuǎn)速約200rpm，室溫(24℃±4℃)培養(yǎng)2h±15min；5.快速倒置甩去板內(nèi)溶液，在干凈吸水紙上倒扣停留5-10s，輕拍去殘留溶液，用洗滌液，約400μL/孔，立即甩去板內(nèi)洗液。重復(fù)該步驟共洗6次，最后一遍甩去板內(nèi)洗液后倒扣靜置30s，在干凈吸水紙上輕拍去殘留洗液。6.每孔加入100μLTMB底物顯色液，室溫(24℃±4℃)靜置30±5min；7.每孔加入100μL終止溶液；8.在450/650nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值；9.結(jié)果計(jì)算：用SoftMaxPro軟件分析，以650nm作為參比波長(zhǎng)，減去相應(yīng)吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)品0點(diǎn)校零，按標(biāo)準(zhǔn)品濃度-吸光度平均值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用四參數(shù)擬合，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品濃度，樣品CHOHCP濃度和殘留量計(jì)算公式如下。樣品HCP濃度(ng/mL)＝供試品濃度×稀釋倍數(shù)表1:實(shí)例工藝一中各個(gè)純化步驟之后蛋白濃度和HCP含量上表1檢測(cè)結(jié)果可以看出經(jīng)過現(xiàn)有的粗純工藝、精純工藝和超濾換液得到的樣品(ProteinA親和層析后樣品、陰離子交換層析樣品、陽離子交換層析樣品、原液)的宿主蛋白(HCP)在檢測(cè)過程中含量在不同的稀釋倍數(shù)檢測(cè)結(jié)果均出現(xiàn)差異，不呈線性(檢測(cè)結(jié)果不呈線性時(shí)，較高的稀釋倍數(shù)測(cè)定的HCP含量高于較低的稀釋倍數(shù)，無法判定最終產(chǎn)品質(zhì)量是否合格)，其中原液稀釋5倍時(shí)的檢測(cè)結(jié)果為368.0ppm，稀釋10倍時(shí)的檢測(cè)結(jié)果為622.8ppm，即在不同稀釋倍數(shù)的檢測(cè)結(jié)果存在差異，且經(jīng)過下游層析后的原液樣品宿主蛋白(HCP)的含量仍然較高，高于原液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)100ppm。因此不僅用藥的安全性會(huì)存在風(fēng)險(xiǎn)，檢測(cè)的非線性對(duì)樣品檢測(cè)的放行也帶來一定的問題，需通過優(yōu)化下游粗純工藝即ProteinA親和層析、病毒滅活及過濾，將宿主蛋白(HCP)去除到盡可能低的范圍，且檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)一致性。在檢測(cè)過程中，HCP中的某種特定HCP的品種(可能是非可溶的顆粒型)是導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不成線性的原因，病毒滅活過程中HCP等產(chǎn)生了一些不溶性雜質(zhì)，使得蛋白溶液會(huì)出現(xiàn)不同程度的混濁現(xiàn)象(ShuklaAA,HubbardB,TresselT,GuhanS,LowD,(2007)Downstreamprocessingofmonoclonalantibodies-Applicationofplatform.Journalofchromatography.B,Analyticaltechnologiesinthebiomedicalandlifesciences；848(1):28-39)。實(shí)例工藝二小試工藝研究示例粗純工藝：ProteinA親和層析的優(yōu)化、病毒滅活的優(yōu)化和病毒滅活后深層過濾的優(yōu)化在大規(guī)模的抗體的生產(chǎn)中ProteinA親和層析方法是目前最為常用的。其具有極高的選擇性，一步親和層析就可以達(dá)到95％以上的純度。本實(shí)驗(yàn)比較ProteinA親和層析不同填料(ProteinADiamond(博格隆(上海)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)AA0133)和JWT203(JSR，貨號(hào)0208GA)兩種填料)對(duì)HCP的去除效果，層析柱為20ml，柱高為20cm。實(shí)驗(yàn)方法：ProteinA親和層析平衡液(25mMTris-HCl，50mMNaClpH7.4±0.2)平衡層析柱至出口PH不變，將樣品上樣載量為35mg/ml，流速為300cm/h，用相應(yīng)的淋洗液淋洗層析柱5CV，之后進(jìn)行洗脫液(100mM乙酸-乙酸鈉pH3.6±0.2)洗脫，當(dāng)UV280吸收值大于0.5AU時(shí)開始收集洗脫峰，小于0.5AU時(shí)停止收集。洗脫完畢之后0.1M磷酸清洗3CV(保留時(shí)間16min)，之后清洗液(50mMNaOH)沖洗3CV，緩沖液平衡，超純水沖洗2CV，保存液保持層析柱，存放于2-8℃。取樣檢測(cè)上樣樣品和洗脫收集樣品的蛋白濃度和HCP含量，見表2。表2：不同填料和淋洗液的ProteinA親和層析后樣品中蛋白質(zhì)濃度和HCP含量對(duì)比表2比較了兩種ProteinA親和層析填料對(duì)宿主蛋白HCP去除效果的差異，ProteinADiamond上樣宿主蛋白HCP含量578042.2ppm，洗脫宿主蛋白HCP含量1766.8ppm，可效去除327倍。JSRJWT203填料宿主蛋白HCP含量由上樣的672503ppm降至6629.7ppm，可效去除101倍。因此選擇ProteinADiamond做為ProteinA親和層析工藝的填料。ProteinADiamond填料相同時(shí)，淋洗液對(duì)洗脫樣品中HCP含量的含量也有影響，淋洗液25mMTris-HCl，50mMNaCl可有效去除372倍，淋洗液25mMTris-HCl，500mMNaCl可有效去除219倍。淋洗液為25mMTris-HCl，50mMNaCl的條件優(yōu)于25mMTris-HCl，500mMNaCl的條件，ProteinADiamond填料的淋洗液因此選擇25mMTris-HCl，50mMNaCl，pH7.4。病毒滅活的優(yōu)化傳統(tǒng)的病毒滅活和去除技術(shù)包含納米膜過濾、低pH值孵育、巴氏消毒、S/D(溶劑/去污劑)處理、干熱處理和辛酸鹽處理等。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物有潛在的病毒安全性風(fēng)險(xiǎn)，要求純化工藝中有病毒清除的能力，在單抗下游工藝平臺(tái)中多采用低pH值孵育進(jìn)行病毒滅活，選擇S/D(溶劑/去污劑)處理的方法進(jìn)行病毒滅活案例較少。不管采用何種滅活方式，抗體分子在該滅活條件下必須保持穩(wěn)定，否則將對(duì)藥物的安全有效性產(chǎn)生不利影響。本實(shí)施例考察了GB222抗體分子在低pH值和S/D兩種滅活條件下的穩(wěn)定性。S/D為助溶劑/表面活性劑簡(jiǎn)稱，本實(shí)施例中助溶劑為0.3％磷酸三丁酯，表面活性劑為1％聚山梨酯80。低pH值滅活穩(wěn)定性的考察方法為將小試獲得的蛋白A洗脫峰調(diào)節(jié)pH值3.0和3.3，室溫放置，分別在1、2、4h取樣，取樣后立即滴加2M三羥基氨基甲烷調(diào)節(jié)pH值5.0左右，待檢。另外，取一份蛋白A洗脫峰直接調(diào)節(jié)pH值至5.0左右作為0點(diǎn)對(duì)照，待檢。S/D滅活穩(wěn)定性的考察方法為將小試獲得的蛋白A洗脫峰調(diào)節(jié)pH值至5.0左右，加入S/D并使其終濃度為0.3％磷酸三丁酯+1％聚山梨酯80，室溫放置，分別在1、2、4h取樣，取樣后立即進(jìn)行ProteinA純化以去除S/D，獲得洗脫收集峰后立即調(diào)節(jié)pH值至5.0，待檢。未進(jìn)行S/D滅活的pH5.0的樣品作為0點(diǎn)對(duì)照，待檢。將上述所有穩(wěn)定性考察獲得的樣品送檢SEC-HPLC，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示抗體分子在低pH3.0和3.3條件下發(fā)生主峰(Mainpeak)向低分子量雜質(zhì)(LMW)遷移，且滅活時(shí)間延長(zhǎng)、pH越低，遷移的比例升越高，這表明抗體分子發(fā)生斷裂產(chǎn)生片段化。而S/D滅活過程中，抗體SEC-HPLC純度未發(fā)生明顯變化，表明抗體分子穩(wěn)定。綜上所述，針對(duì)該抗體分子，宜采用S/D方式進(jìn)行病毒滅活。表3GB222分子在不同滅活條件下的SEC-HPLC結(jié)果抗體分子在常用的低pH值滅活過程中確實(shí)有穩(wěn)定性不好的現(xiàn)象，例如產(chǎn)生聚合(聚合可以以聚體或顆粒物形式存在)，或產(chǎn)生碎片(抗體分子肽鍵斷裂，形成低分子量雜質(zhì))。本實(shí)施例證明了GB222分子是不耐受低pH值的分子，S/D病毒滅活是替代低pH滅活的有效方式。因此本發(fā)明針對(duì)GB222分子選擇S/D病毒滅活，其過程為將蛋白A親和層析收集峰的pH值調(diào)節(jié)至5.2±0.2，加入20×S/D至終濃度為終濃度為0.3％TnBP+1％聚山梨酯80，室溫孵育1h。病毒去除效果驗(yàn)證方法：蛋白A親和層析收集的樣品pH值調(diào)節(jié)至5.2±0.2，加入20×S/D至終濃度為終濃度為0.3％TnBP+1％聚山梨酯80，向其中分別加入適量的指示病毒(異嗜鼠白血病病毒X-MuLV、病毒偽狂犬病毒PrV)病毒原液，充分混合，在20-25度孵育5分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘分別取樣檢測(cè)病毒滴度。表4中數(shù)據(jù)可以看出采用S/D病毒滅活的方法可以達(dá)到對(duì)兩種指示病毒的滅活效果高于4log10以上的要求。將其病毒去除能力與低pH滅活去除能力做對(duì)比如下表格4：表4.S/D病毒滅活能力Log10從表4可以看出采用S/D病毒滅活可以獲得比低pH病毒滅活更好的病毒滅活能力。病毒滅活后深層過濾的優(yōu)化病毒滅活的過程中蛋白的溶液環(huán)境的變化會(huì)導(dǎo)致蛋白溶液不同程度的混濁現(xiàn)象，原因是溶液中的蛋白產(chǎn)生了一些不溶性雜質(zhì)，此時(shí)我們將再次引進(jìn)深層過濾的方法，降低溶液濁度，同時(shí)可以去除不溶性雜質(zhì)例如：HCP，聚體，脂類蛋白，DNA等。選擇深層過濾膜X0HC(貨號(hào)MX0HC23CL3，廠家：默克)和深層過濾膜A1HC(貨號(hào)MA1HC23CL3，廠家：默克)進(jìn)行深層過濾工藝開發(fā)，通過小試對(duì)比兩種膜HCP的去除效果。GB222病毒滅活后中間體1L，蛋白濃度：11.7g/L，宿主蛋白HCP含量1847.9ppm。選擇膜面積為0.0023m2深層過濾膜X0HC和深層過濾膜A1HC兩種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用恒定流速實(shí)驗(yàn)即以恒定的流速使料液通過濾器，記錄一定時(shí)間間隔的過濾器壓降和濾液體積，當(dāng)濾器的壓降達(dá)到設(shè)定值時(shí)停止實(shí)驗(yàn)。本次實(shí)驗(yàn)考察深層濾器的過濾情況，在適當(dāng)時(shí)間間隔記錄壓降，濾液體積。實(shí)驗(yàn)方法如下：1.將所需過濾器與管路連接，并在濾器上游連接壓力表；2.在容器中裝入工藝中具有代表性的水、緩沖液；3.利用泵將水打入管路，沖洗濾器以排除空氣；4.利用水或緩沖液校準(zhǔn)泵流速，并設(shè)定實(shí)驗(yàn)流速。建議通量為100–300LMH。水洗10CV之后用沖膜緩沖液：50mM乙酸乙酸鈉,pH5.2沖洗1CV；5.打入料液進(jìn)行深層過濾，當(dāng)料液通過濾器時(shí)開始實(shí)驗(yàn)；6.待有料液流出時(shí)收集，當(dāng)?shù)谝坏瘟弦哼M(jìn)入置于天平上的容器時(shí)開始計(jì)時(shí)；7.當(dāng)濁度貫穿或者達(dá)到壓力上限時(shí)(15psi)，終止實(shí)驗(yàn)；8.記錄最終的壓力并取樣測(cè)定樣品的蛋白濃度和宿主蛋白HCP含量；9.通過蛋白濃度和過濾體積計(jì)算膜載量和得率。表5使用A1HC和X0HC的病毒滅活后深層過濾后HCP含量對(duì)比膜包載量(L/m2)*得率(％)**濾后HCP含量(ppm)深層過濾膜X0HC165.592.69.29深層過濾膜A1HC548.484.941.53*：載量＝過濾體積/膜面積**:得率＝(過濾后樣品的體積*過濾后樣品的濃度)/(過濾樣品的體積*過濾樣品的濃度)表5中顯示GB222病毒滅活后深層過濾膜A1HC和深層過濾膜X0HC載量、得率以及宿主蛋白HCP含量對(duì)比。依據(jù)結(jié)果可以看出，深層過濾膜A1HC和深層過濾膜X0HC去除宿主蛋白HCP相差較大，起始過濾樣品中宿主蛋白HCP含量1847.9ppm，深層過濾膜X0HC濾后為9.29ppm，深層過濾膜A1HC濾后為41.53ppm。深層過濾對(duì)宿主蛋白具有非常好的去除效果，且由于之前的S/D病毒滅活使得部分種類HCP沉淀更加增強(qiáng)了去除效果。兩個(gè)種類的深層過濾膜相比較由于宿主蛋白HCP雜質(zhì)作為一項(xiàng)重要指標(biāo)首先考慮，因此選擇深層過濾膜X0HC作為病毒滅后的深層過濾膜。粗純工藝放大實(shí)驗(yàn)依據(jù)小試工藝開發(fā)研究的工藝參數(shù)，對(duì)GB222分子的純化進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)。上游細(xì)胞培養(yǎng)和收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清操作方法如前所述。粗純工藝：ProteinA親和層析、病毒滅活和病毒滅活后深層過濾ProteinA親和層析選擇ProteinADiamond(博格隆)作為親和層析的填料，裝柱體積為3.1L。層析柱平衡完畢后上樣，載量小于35mg/ml，上樣完畢后，淋洗液(25mMTris-HCl，50mMNaClPH7.4±0.2電導(dǎo)率7.0±0.2)淋洗層析柱5CV，之后進(jìn)行洗脫液(100mM乙酸乙酸鈉pH3.6±0.2)洗脫，當(dāng)UV280吸收值大于0.5AU時(shí)開始收集洗脫峰，小于0.5AU時(shí)停止收集。洗脫完畢之后0.1M磷酸清洗3CV(保留時(shí)間16min)，重新平衡層析柱，平衡好后清洗液(50mMNaOH1MNaCl)沖洗3CV，緩沖液平衡，超純水沖洗2CV，保存液保持層析柱，存放于2-8度。病毒滅活ProteinA親和層析后的樣品進(jìn)行滅活，樣品的pH值調(diào)節(jié)至5.2±0.2，加入20×S/D至終濃度為終濃度為0.3％TnBP+1％聚山梨酯80，室溫孵育1h。病毒滅活后深層過濾病毒滅活后的樣品用X0HC深層過濾膜進(jìn)行深層過濾：使用前用超純水沖洗10CV，緩沖液50mM乙酸乙酸鈉，pH5.2沖洗1CV深層過濾膜，沖洗完畢之后連接管道進(jìn)行樣品過濾，將樣品打入深層過濾膜，流速為100-300LMH，過濾過程中檢測(cè)端口壓力，兩個(gè)進(jìn)口端壓力均要求小于2bar，上樣完畢后，用緩沖液50mM乙酸乙酸鈉,pH5.2沖洗1CV繼續(xù)沖洗深層過濾膜2CV，并回收沖洗濾出液。病毒滅活后深層過濾的樣品經(jīng)過后續(xù)精純步驟和超濾濃縮步驟最終制備成單克隆抗體原液，精純和超濾工藝完全同工藝一所述。該放大實(shí)驗(yàn)中的各個(gè)純化步驟之后的樣品中蛋白質(zhì)濃度和HCP含量參見表6。表6.放大實(shí)驗(yàn)各個(gè)純化步驟之后的樣品中CHO宿主蛋白檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)表6列出了經(jīng)過粗純工藝二放大實(shí)驗(yàn)HCP檢測(cè)結(jié)果，通過表中數(shù)據(jù)可以看出經(jīng)過優(yōu)化后的工藝可以大大降低HCP的含量，經(jīng)過以上工藝HCP含量可以從4～5×105ppm降低至2.3ppm。HCP的含量降低后不同稀釋倍數(shù)檢查結(jié)果無明顯差異，說明對(duì)HCP檢測(cè)產(chǎn)生干擾的某種特定種類的HCP經(jīng)過本發(fā)明方法的ProteinADiamond親和層析和病毒滅活后深層過濾步驟后已經(jīng)被清除。綜上所述，與現(xiàn)有單克隆抗體下游純化過程相比本發(fā)明通過采用病毒滅活后深層過濾步驟，同時(shí)優(yōu)化ProteinA親和層析和和病毒滅活后深層過濾大大地提高了HCP的除去效果。本發(fā)明的實(shí)施例方法針對(duì)GB222分子經(jīng)過優(yōu)化的粗純工藝(ProteinA親和層析、病毒滅活和病毒滅活后深層過濾)能夠非常強(qiáng)健、有效地去除GB222樣品中的HCP，經(jīng)過放大驗(yàn)證后HCP含量可以降低至2.3ppm，遠(yuǎn)低于100ppm內(nèi)控指標(biāo)說明本工藝的有效性。本發(fā)明的方法中病毒滅活后深層過濾得到的GB222樣品經(jīng)進(jìn)一步的陰離子交換層析和陽離子交換層析后HCP含量可以降低至0.4ppm，最終超濾濃縮制得的單克隆抗體原液中HCP含量可以降低至0.3ppm，并且HCP含量檢測(cè)結(jié)果呈線性。另外，本發(fā)明病毒滅活采用S/D方法對(duì)GB222樣品進(jìn)行滅活，通過病毒驗(yàn)證試驗(yàn)顯示指示病毒的滅活效果高于4log10以上的要求。以上是根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選生產(chǎn)形態(tài)通過實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了沒有限制的描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，在所附權(quán)利要求書定義的范圍內(nèi)，專家可以做變化和/或變型，而不脫離相關(guān)的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3