本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細(xì)胞的移植和基因治療
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及一種提高人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)移植和歸巢效率的基因治療方法。
背景技術(shù)：
：：間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)來自于能夠產(chǎn)生結(jié)締組織的中胚層細(xì)胞。MSC可以很容易地從成人的幾種組織中獲得，包括脂肪組織和骨髓。據(jù)推測(cè)，對(duì)非造血組織和器官骨髓移植來說，一部分療效可能來自供體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或患者自體植入的MSC細(xì)胞。對(duì)于某些嚴(yán)重的和缺陷性的疾病，間充質(zhì)干細(xì)胞移植是一個(gè)非常有前景的治療方法。一個(gè)實(shí)例是成骨不全癥(OI)，這是一個(gè)先天性的疾病，世界各地受到影響人約1/10000。在美國約有30000人，包括越來越多的成年人，都受到這種疾病的困擾。成骨不全(OI)的患者骨頭脆弱，容易骨折。嚴(yán)重情況從相對(duì)溫和狀態(tài)到不同程度的殘疾，包括極端矮小。最嚴(yán)重的是在圍產(chǎn)期由于肺功能不全而導(dǎo)致死亡，其顯著的特征是不發(fā)育和胸骨骨折，目前成骨不全癥還沒有辦法治愈。干細(xì)胞治療成骨不全癥(OI)的應(yīng)用是很有前景的。干細(xì)胞治療的理論基礎(chǔ)是：成骨不全癥(OI)患者骨中的成骨細(xì)胞可被能合成骨基質(zhì)的正常細(xì)胞取代，從而從組織具有正常的功能。這是基于移植入正常細(xì)胞合成骨基質(zhì)的優(yōu)勢(shì)要高于OI患者身體中內(nèi)源性細(xì)胞合成缺陷骨基質(zhì)的前提下。從根本上說，該方法主要是進(jìn)行細(xì)胞移植，移植的細(xì)胞將遷移到身體每個(gè)骨組織部位，合成并積累正常的骨基質(zhì)。兩種成人干細(xì)胞已被用于治療OI：造血干細(xì)胞(HSC)和間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。移植造血干細(xì)胞能治療多種疾病，如清髓后造血功能的重建是一個(gè)正在進(jìn)行的常規(guī)程序。到目前為止，造血干細(xì)胞是唯一的可以通過全身移植以達(dá)到治療效果的干細(xì)胞。通過骨髓移植(BMT)，造血干細(xì)胞可以很容易地遷移到干細(xì)胞壁龕。盡管其有向骨內(nèi)膜的歸巢能力，骨髓移植和造血干細(xì)胞移植(HSCT)對(duì)骨疾病如成骨不全。在所有發(fā)表過的關(guān)于MSC移植的研究中，長期間充質(zhì)干細(xì)胞移植尚未有令人信服的實(shí)例說明，雖然能經(jīng)常觀察到治療的優(yōu)勢(shì)。眾所周知，間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過血管移植，90％的間充質(zhì)干細(xì)胞移植24小時(shí)后死亡，僅有少量的間充質(zhì)干細(xì)胞在移植72小時(shí)仍可被檢測(cè)到。最根本的原因是，MSCs遇到了嚴(yán)重的阻力-缺乏基質(zhì)的支持，這種基質(zhì)對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞移植是必須的，甚至從收獲移植的細(xì)胞開始。在MSC或其他貼壁細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療情況下，細(xì)胞從正常貼壁生長狀態(tài)下被迫停止，一個(gè)稱為“失巢凋亡”的細(xì)胞程序性死亡通路就會(huì)啟動(dòng)。失巢凋亡，是希臘語，意思是“無家可歸”，指的是由于基質(zhì)附著喪失而引起的細(xì)胞程序性死亡。目前面臨的主要問題是在現(xiàn)有的技術(shù)條件下,間充質(zhì)干細(xì)胞向骨髓歸巢的能力有限，即使在子宮內(nèi)移植，但這似乎是一個(gè)效率低下的現(xiàn)象。參考文獻(xiàn)：1.NiyibiziC,LiF(2009)Potentialimplicationsofcelltherapyforosteogenesisimperfecta.IntJClinRheumtol4:57-66.2.TakahashiK,TanabeK,OhnukiM,NaritaM,IchisakaT,etal.(2007)Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Cell131:861-872.3.ZouJ,MaederML,MaliP,Pruett-MillerSM,Thibodeau-BegannyS,etal.(2009)Genetargetingofadisease-relatedgeneinhumaninducedpluripotentstemandembryonicstemcells.CellStemCell5:97-110.4.LianQ,ZhangY,ZhangJ,ZhangHK,WuX,etal.(2010)Functionalmesenchymalstemcellsderivedfromhumaninducedpluripotentstemcellsattenuatelimbischemiainmice.Circulation121:1113-1123.5.WarrenL,ManosPD,AhfeldtT,LohYH,LiH,etal.(2010)HighlyefficientreprogrammingtopluripotencyanddirecteddifferentiationofhumancellswithsyntheticmodifiedmRNA.CellStemCell7:618-630.6.ApoloniaL,WaddingtonSN,FernandesC,WardNJ,BoumaG,etal.(2007)Stablegenetransfertomuscleusingnon-integratinglentiviralvectors.MolTher15:1947-1954.7.BanasikMB,McCrayPB,Jr.(2010)Integrase-defectivelentiviralvectors:progressandapplications.GeneTher17:150-157.8.FengJ,YangS,XuL,TianH,SunL,etal.(2007)Roleofcaspase-3inhibitorininducedanoikisofmesenchymalstemcellsinvitro.JHuazhongUnivSciTechnologMedSci27:183-185.9.RyuCH,ParkSA,KimSM,LimJY,JeongCH,etal.(2010)Migrationofhumanumbilicalcordbloodmesenchymalstemcellsmediatedbystromalcell-derivedfactor-1/CXCR4axisviaAkt,ERK,andp38signaltransductionpathways.BiochemBiophysResCommun398:105-110.10.Mendez-FerrerS,MichurinaTV,FerraroF,MazloomAR,MacarthurBD,etal.(2010)Mesenchymalandhaematopoieticstemcellsformauniquebonemarrowniche.Nature466:829-834.11.WangX,LiF,NiyibiziC(2006)Progenitorssystemicallytransplantedintoneonatalmicelocalizetoareasofactiveboneformationinvivo:implicationsofcelltherapyforskeletaldiseases.StemCells24:1869-1878.12.LiechtyKW,MacKenzieTC,ShaabanAF,RaduA,MoseleyAM,etal.(2000)Humanmesenchymalstemcellsengraftanddemonstratesite-specificdifferentiationafterinuterotransplantationinsheep.NatMed6:1282-1286.13.NiyibiziC,WangS,MiZ,RobbinsPD(2004)Thefateofmesenchymalstemcellstransplantedintoimmunocompetentneonatalmice:implicationsforskeletalgenetherapyviastemcells.MolTher9:955-963.14.HorwitzEM,ProckopDJ,FitzpatrickLA,KooWW,GordonPL,etal.(1999)Transplantabilityandtherapeuticeffectsofbonemarrow-derivedmesenchymalcellsinchildrenwithosteogenesisimperfecta.NatMed5:309-313.15.HorwitzEM,ProckopDJ,GordonPL,KooWW,FitzpatrickLA,etal.(2001)Clinicalresponsestobonemarrowtransplantationinchildrenwithsevereosteogenesisimperfecta.Blood97:1227-1231.16.HorwitzEM,GordonPL,KooWK,MarxJC,NeelMD,etal.(2002)Isolatedallogeneicbonemarrow-derivedmesenchymalcellsengraftandstimulategrowthinchildrenwithosteogenesisimperfecta:Implicationsforcelltherapyofbone.ProcNatlAcadSciUSA99:8932-8937.17.TakahashiK,YamanakaS(2006)Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell126:663-676.技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種提高人間充質(zhì)干細(xì)胞移植和歸巢效率的基因治療方法，它是一種能夠治療嚴(yán)重的骨骼疾病如成骨不全癥(OI)或其它疾病的MSC移植和基因治療方法，其移植效率是傳統(tǒng)方法100倍。為了解決
背景技術(shù)：
：所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案：一種一種提高人間充質(zhì)干細(xì)胞移植和歸巢效率的基因治療方法，它包含如下步驟：S1、獲取血液或皮膚細(xì)胞；S2、轉(zhuǎn)化成無外源基因的iPS細(xì)胞；S3、對(duì)iPS細(xì)胞采用矯正基因通過鋅指核酸酶ZFN進(jìn)行處理和同源重組；S4、正確分化iPS細(xì)胞到MSCs細(xì)胞；S5、將MSCs轉(zhuǎn)染基因CXCR4、FLIP、Bcl-2，并用凋亡蛋白酶抑制劑進(jìn)行處理；S6、利用AMD3100將干細(xì)胞從干細(xì)胞龕中調(diào)動(dòng)出來，并用VEGF處理以增加血管通透性。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)；所述的步驟S2—步驟S4中，通過向細(xì)胞導(dǎo)入重編程因子OCT4，SOX2和KLF4，皮膚細(xì)胞很容易就能轉(zhuǎn)變成iPS細(xì)胞；用鋅指核酸酶ZFN對(duì)iPS細(xì)胞進(jìn)行處理，可使疾病基因DNA雙鏈斷裂，并構(gòu)建正確的與疾病基因同源重組的編碼基因；修正后的iPS細(xì)胞能夠分化為間充質(zhì)干細(xì)胞。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)；所述的步驟S5中，為了使FLIP因子和Bcl-2因子導(dǎo)入到間充質(zhì)干細(xì)胞中，采用新改進(jìn)的RNA轉(zhuǎn)染方法，或者使用非整合型慢病毒載體NILVs。在逆轉(zhuǎn)率病毒載體中，轉(zhuǎn)入的基因只在轉(zhuǎn)染后的幾天中表達(dá)，其他方式的瞬時(shí)基因轉(zhuǎn)染包括質(zhì)?；蛭h(huán)DNA轉(zhuǎn)染等。移植前，對(duì)MSCs用凋亡蛋白酶抑制劑z-VAD-FMK進(jìn)行處理，可抑制失巢凋亡。在細(xì)胞回輸前，對(duì)MSC進(jìn)行處理，使其高表達(dá)CXCR4，可提高M(jìn)SC的歸巢能力。新改進(jìn)的RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)可用于瞬時(shí)過表達(dá)MSCs中的CXCR4因子；此外，低氧預(yù)處理也可以增加間充質(zhì)干細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)，增加MSC趨化作用能力。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)；所述的步驟S6中，VEGF是一種誘導(dǎo)血管通透性的因子，它是組胺通透性的5000倍。VEGF的信號(hào)導(dǎo)致緊密連接蛋白、粘附蛋白如VE-鈣粘蛋白和相關(guān)蛋白磷酸化，因此，內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附減弱，血管的通透性增加。因此，在MSC移植前2小時(shí)，給患者注射血管內(nèi)皮生長因子。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)；所述的步驟S6中，注射CXCR4因子的拮抗劑AMD3100可以實(shí)現(xiàn)11％的干細(xì)胞龕排空；添加小分子抑制劑VLA-4、bio5192連同AMD3100動(dòng)員循環(huán)系統(tǒng)中造血干細(xì)胞的能力與僅僅使用AMD3100相比增加3倍；另外，G-CSF存在的情況下動(dòng)員間充質(zhì)干細(xì)胞的能力增加8倍。AMD3100和其他藥物給藥2小時(shí)后，循環(huán)中的干細(xì)胞達(dá)到高峰，大多數(shù)動(dòng)員的干細(xì)胞將在6小時(shí)后移回干細(xì)胞龕，因此，在細(xì)胞動(dòng)員2小時(shí)后進(jìn)行MSCs移植治療。大量動(dòng)員的造血干細(xì)胞將與移植的間充質(zhì)干細(xì)胞在循環(huán)中相互作用，進(jìn)而促進(jìn)MSC遷移到干細(xì)胞龕。采用上述技術(shù)方案后，本發(fā)明具有以下有益效果：1、由于改善周圍的循環(huán)條件使得MSC移植效率大大提高，歸巢率提高，并且血管障礙也相應(yīng)減小。2、結(jié)合一些新的方法，MSC的移植效率比傳統(tǒng)的方法增加100倍，從而對(duì)疾病如成骨發(fā)育不全癥(OI)達(dá)到前所未有的療效。附圖說明圖1為本發(fā)明所提供的實(shí)施例的流程圖。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本具體實(shí)施方式采用以下技術(shù)方案：一種提高人間充質(zhì)干細(xì)胞移植和歸巢效率的基因治療方法，它包含如下步驟：S1、獲取血液或皮膚細(xì)胞；S2、轉(zhuǎn)化成無外源基因的iPS細(xì)胞；S3、對(duì)iPS細(xì)胞采用矯正基因通過鋅指核酸酶ZFN進(jìn)行處理和同源重組；S4、正確分化iPS細(xì)胞到MSCs細(xì)胞；S5、將MSCs轉(zhuǎn)染基因CXCR4、FLIP、Bcl-2，并用凋亡蛋白酶抑制劑進(jìn)行處理；S6、利用AMD3100將干細(xì)胞從干細(xì)胞龕中調(diào)動(dòng)出來，并用VEGF處理以增加血管通透性。本具體實(shí)施方式的原理及具體實(shí)施方法如下：1、間充質(zhì)干細(xì)胞：iPS細(xì)胞產(chǎn)生，基因矯正和MSC分化：通過向細(xì)胞導(dǎo)入重編程因子OCT4,SOX2和KLF4，皮膚細(xì)胞很容易就能轉(zhuǎn)變成iPS細(xì)胞。用鋅指核酸酶(ZFN)對(duì)iPS細(xì)胞進(jìn)行處理，可使疾病基因DNA雙鏈斷裂，并構(gòu)建正確的與疾病基因同源重組的編碼基因。修正后的iPS細(xì)胞能夠分化為間充質(zhì)干細(xì)胞。iPSC來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的使用有幾個(gè)突出的優(yōu)勢(shì)：1)iPS來源的比骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力。2)iPS來源的間充質(zhì)干細(xì)胞比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更小，因此移植后不大可能在肺部滯留。2、抑制失巢凋亡：在細(xì)胞抵御失巢凋亡的研究中，已發(fā)現(xiàn)幾個(gè)因子在抑制失巢凋亡中發(fā)揮著重要的作用。在凋亡蛋白酶激活的死亡受體通路存在缺陷的情況下，如使caspase-8抑制劑過表達(dá)，可以使細(xì)胞抵抗失巢凋亡。同樣，線粒體通路障礙，如抗凋亡Bcl-2家族蛋白(Bcl-2、Bcl-x(L)、Mcl-1等)的過表達(dá)，也可以使細(xì)胞抵抗失巢凋亡。因此，過表達(dá)FLIP和Bcl-2能夠增加MSCs全身移植后抵御細(xì)胞死亡的能力，為了使FLIP因子和Bcl-2因子導(dǎo)入到間充質(zhì)干細(xì)胞中，采用一種新改進(jìn)的RNA轉(zhuǎn)染方法。另外，可以使用非整合型慢病毒載體(NILVs)。在逆轉(zhuǎn)率病毒載體中，轉(zhuǎn)入的基因只在轉(zhuǎn)染后的幾天中表達(dá)，其他方式的瞬時(shí)基因轉(zhuǎn)染包括質(zhì)?；蛭h(huán)DNA轉(zhuǎn)染等。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，凋亡蛋白酶-3在誘導(dǎo)體外間充質(zhì)干細(xì)胞失巢凋亡起著重要的作用，并且發(fā)現(xiàn)抑制凋亡蛋白酶-3的活性能夠顯著降低細(xì)胞的死亡[8]。因此，移植前，對(duì)MSCs用凋亡蛋白酶抑制劑z-VAD-FMK進(jìn)行處理。3、增加MSC趨化作用能力：類似于造血干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞遷移也是通過趨化因子配體/受體(SDF-1/CXCR4)軸來實(shí)現(xiàn)的。SDF1是由干細(xì)胞龕或傷口分泌的趨化因子，SDF-1梯度吸引表達(dá)趨化因子受體CXCR4的HSCs或MSCs向干細(xì)胞龕或創(chuàng)傷處遷移。為了提高M(jìn)SC的歸巢能力，在細(xì)胞回輸前，對(duì)MSC進(jìn)行處理，使其高表達(dá)CXCR4，一種新的改進(jìn)的RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)可用于瞬時(shí)過表達(dá)MSCs中的CXCR4因子。此外，低氧預(yù)處理也可以增加間充質(zhì)干細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)。4、增加血管通透性：干細(xì)胞移植是這樣一個(gè)過程，細(xì)胞在血液循環(huán)中通過瞬時(shí)消除內(nèi)皮細(xì)胞粘附來穿過血管屏障。造血干細(xì)胞已經(jīng)發(fā)展了所有的關(guān)于細(xì)胞動(dòng)員和歸巢的機(jī)制。然而，間充質(zhì)干細(xì)胞的動(dòng)員和歸巢比造血干細(xì)胞更加困難，這可能是由于MSCs內(nèi)在生物學(xué)特性以及與造血干細(xì)胞相比它們的體積比較大的緣故。血管通透性增加是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的主要原因之一。因此，短暫地增加血管通透性能提高M(jìn)SC移植效率。血管內(nèi)皮生長因子(BEGF)是一種多功能的細(xì)胞因子，在血管生成中起著重要的作用。血管內(nèi)皮生長因子最初被描述為一個(gè)腫瘤分泌的蛋白，是血液循環(huán)大分子，可以使微靜脈和小靜脈循環(huán)具有很強(qiáng)的滲透性，因此，最初被稱為血管通透性因子。事實(shí)上，VEGF是已知的一種最有效的誘導(dǎo)血管通透性的因子，它是組胺通透性的5000倍。VEGF的信號(hào)導(dǎo)致緊密連接蛋白、粘附蛋白如VE-鈣粘蛋白和相關(guān)蛋白磷酸化，因此，內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附減弱，血管的通透性增加。因此，在MSC移植前2小時(shí)，給患者注射血管內(nèi)皮生長因子。5、排空干細(xì)胞龕中的細(xì)胞：間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞形成獨(dú)特的骨髓龕。間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞處于干細(xì)胞龕附近可以相互調(diào)節(jié)。提高干細(xì)胞移植，排空干細(xì)胞龕是有必要的。穩(wěn)態(tài)條件下，可用的干細(xì)胞龕不足1％，而11％的干細(xì)胞龕可以通過注射CXCR4因子的拮抗劑AMD3100來實(shí)現(xiàn)排空。此外，添加小分子抑制劑VLA-4、bio5192連同AMD3100動(dòng)員循環(huán)系統(tǒng)中造血干細(xì)胞的能力與僅僅使用AMD3100相比增加3倍。另外，G-CSF存在的情況下動(dòng)員間充質(zhì)干細(xì)胞的能力增加8倍。AMD3100和其他藥物給藥2小時(shí)后，循環(huán)中的干細(xì)胞達(dá)到高峰，大多數(shù)動(dòng)員的干細(xì)胞將在6小時(shí)后移回干細(xì)胞龕，因此，在細(xì)胞動(dòng)員2小時(shí)后進(jìn)行MSCs移植治療。大量動(dòng)員的造血干細(xì)胞將與移植的間充質(zhì)干細(xì)胞在循環(huán)中相互作用，進(jìn)而促進(jìn)MSC遷移到干細(xì)胞龕。本具體實(shí)施方式的因子組合與實(shí)施方法為：在移植前8-16個(gè)小時(shí)，用Bcl-2、FLIP和CXCR4基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，當(dāng)收獲間充質(zhì)干細(xì)胞，顯著的基因表達(dá)水平也已經(jīng)達(dá)到，在細(xì)胞分裂酶如胰蛋白酶收獲前2個(gè)小時(shí)，通過z-VAD-FMK對(duì)MSCs用凋亡蛋白酶抑制劑處理。MSC收獲后，迅速地將它們移植到病人體內(nèi)。移植前2個(gè)小時(shí)，先對(duì)病人注射AMD3100和VEGF，這樣可以增加MSC移植效率，AMD3100和VEGF可以給藥2-3天，每天2-3次。一周后，可重復(fù)治療周期，進(jìn)一步增加MSC移植效率。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3