技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
：涉及一種混合微生物制劑及其制造方法，尤其涉及一種用于以生物學方式復(fù)原被復(fù)合污染物質(zhì)的油類污染的土壤的混合微生物制劑及其制造方法。
背景技術(shù)：
：：由于油類污染土壤并非被一種油類污染，而是以復(fù)合性的方式被多種油類污染，因此，只有一同組合使用具有可以對各個油類擁有高效率且具有可以進行選擇性的分解的能力的微生物制劑，才可以有效地進行凈化。在到目前為止所知曉的微生物制劑中，很多種微生物制劑雖然具有油類分解能力，但要么根據(jù)各微生物制劑的特性來分解能力弱，要么根據(jù)油類的種類來呈現(xiàn)出選擇性的分解能力，而且在高濃度的油類污染區(qū)域中，發(fā)生因污染物質(zhì)而使增值變?nèi)醯戎T多問題。并且，由于被多種油類以復(fù)合性的方式污染，或者根據(jù)土壤的種類、形狀及含水率而存在很難幾乎完全凈化多種土壤層的問題。韓國授權(quán)專利第10-1198103號（2012年10月31日授權(quán)）公開了具有油類分解能力的新的微生物及其制造方法，其特征在于，由具有油類分解能力的假單胞細菌（Pseudomonassp.）MJ32KCTC11678BP和假單胞細菌（Pseudomonassp.）MJ33KCTC11679BP指定的多個新的菌株、使多個新的菌株固定于特定載體的微生物制劑及利用它們來以復(fù)合性的方式復(fù)原被油類污染的土壤。根據(jù)所公開的技術(shù)，由于對多種難分解性物質(zhì)具有分解能力，并對高濃度油類污染具有高的抵抗力，還擁有生分解能力，因此，在單獨或與具有油類分解能力的多種菌株一同在有效的載體中實現(xiàn)固定化來使用于油類污染土壤的生物學復(fù)原的情況下，與以往的污染土壤復(fù)原方法相比，既有效又經(jīng)濟，并能夠以環(huán)保的方式凈化污染環(huán)境。韓國公開專利第10-2008-0007861號（2008年01月23日公開）公開了具有油類分解能力的新的微生物及油類污染土壤的生物學復(fù)原方法。根據(jù)所公開的技術(shù)，新的微生物被指定為紅球菌EN3KCTC19082（RhodococcusbaikoneurensisEN3KCTC19082）、約氏不動桿菌EN67KCTC12360（AcinetobacterjohnsoniiEN67KCTC12360）及溶血不動桿菌EN96KCTC12361（AcinetobacterhaemolyticusEN96KCTC12361），并且，除了新的微生物之外，可以使用從油類污染土壤分離的具有油類分解能力的諾卡氏菌屬、大頭茶屬、紅球菌屬、不動桿菌屬的多種微生物，而且，可以通過添加作為生表面活性劑的一種的2-烷基-3-羥基酸及其衍生物來增加這些菌株的油類分解活性度，由此，與現(xiàn)有的污染土壤復(fù)原方法相比，既有效、又經(jīng)濟，并且能夠以環(huán)保方式凈化污染環(huán)境。上述現(xiàn)有的微生物制劑及其制造方法在利用微生物制劑對被復(fù)合污染物質(zhì)的油類污染的土壤進行復(fù)原的過程中，在將對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生的影響最小化方面存在局限性，尤其，具有在對被具有廣范圍的分子量和多種分子結(jié)構(gòu)且包含直鏈型碳化氫或脂肪族、芳香族碳化氫的復(fù)合污染物質(zhì)的油類污染的土壤實施生物學復(fù)原方面存在局限性的問題?，F(xiàn)有的微生物制劑及其制造方法由于同樣未能考慮地下處理之類的原位（in-situ）處理工序、土壤耕作之類的離位（ex-situ）處理工序等不同工序的特性，因而具有很難進行實現(xiàn)最優(yōu)化的油類污染土壤的復(fù)原的問題。并且，在對油類污染土壤進行地下處理的情況下，需要具有廣泛的油類分解性，并需要優(yōu)秀的土壤滲透性，但通過現(xiàn)有的微生物制劑及其制造方法很難在長時間內(nèi)獲得效果，并且，在此還具有很難有效地處理廣范圍的污染區(qū)域的問題。現(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻韓國授權(quán)專利第10-1198103號韓國公開專利第10-2008-0007861號技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于解決上述缺點，即提供以生物學方式復(fù)原被復(fù)合污染物質(zhì)的油類污染的土壤的混合微生物制劑及其制造方法。解決上述問題的方法在于提供混合微生物制劑，根據(jù)本發(fā)明的一特征，其特征在于，以1:1:2:2:1:1:1的比率混合醋酸鈣不動桿菌、肺炎克雷伯氏菌、生癌腸桿菌、施氏假單胞菌、紅串紅球菌、惡臭假單胞菌等6種菌株以及紅球菌屬、不動桿菌屬、大頭茶屬、鞘氨醇桿菌屬、莢膜黃桿菌、不動桿菌屬、黃單胞菌屬中的1種菌株來制造而成。解決上述問題的方法在于提供混合微生物制劑，根據(jù)本發(fā)明的另一特征，其特征在于，其以1:1:3:3:3:1:1的比率混合醋酸鈣不動桿菌、肺炎克雷伯氏菌、生癌腸桿菌、施氏假單胞菌、紅串紅球菌、惡臭假單胞菌等6種菌株以及紅球菌屬、不動桿菌屬、大頭茶屬、鞘氨醇桿菌屬、莢膜黃桿菌、不動桿菌屬、黃單胞菌屬中的1種菌株來制造而成。解決上述問題的方法在于提供混合微生物制劑的制造方法，根據(jù)本發(fā)明的又一特征，其包括：在污染土壤中稀釋醋酸鈣不動桿菌、肺炎克雷伯氏菌、生癌腸桿菌、施氏假單胞菌、紅串紅球菌、惡臭假單胞菌等6種菌株以及紅球菌屬、不動桿菌屬、大頭茶屬、鞘氨醇桿菌屬、莢膜黃桿菌、不動桿菌屬、黃單胞菌屬中的1種菌株作為微生物，并調(diào)節(jié)水分來進行添加的步驟；使智能型混凝試驗攪拌機完全封閉，并測定上述生化需氧量微生物的芳香族碳化氫分解率的步驟；測定土壤內(nèi)殘留油類碳化氫（TPH）的量來計算出土壤內(nèi)油類碳化氫的分解率的步驟；實施細菌粘附烴測試，來測定上述微生物的親水性的步驟；利用甲磺酸甲酯來執(zhí)行上述微生物的細胞壁組成變化的步驟；執(zhí)行電動電勢測定來確認上述微生物的土壤內(nèi)移動性的步驟；確認即使在使改變原菌株和細胞壁的多個微生物傳代培養(yǎng)100代或200代后，細胞壁的特性是否得到維持的步驟；以及以1:1:2:2:1:1:1的比率混合上述微生物，并實現(xiàn)劑型化的步驟。解決上述問題的方法在于提供混合微生物制劑的制造方法，根據(jù)本發(fā)明的還有一特征，包括：在污染土壤中稀釋醋酸鈣不動桿菌、肺炎克雷伯氏菌、生癌腸桿菌、施氏假單胞菌、紅串紅球菌、惡臭假單胞菌等6種菌株以及紅球菌屬、不動桿菌屬、大頭茶屬、鞘氨醇桿菌屬、莢膜黃桿菌、不動桿菌屬、黃單胞菌屬中的1種菌株作為微生物，并調(diào)節(jié)水分來進行添加的步驟；使生化需氧量智能型混凝試驗攪拌機完全封閉，并測定上述微生物的芳香族碳化氫分解率的步驟；測定土壤內(nèi)油類碳化氫殘留的量來計算出土壤內(nèi)的油類碳化氫分解率的步驟；實施細菌粘附烴測試來測定上述微生物的親水性的步驟；利用甲磺酸甲酯來執(zhí)行上述微生物的細胞壁組成變化的步驟；執(zhí)行電動電勢測定來確認上述微生物的土壤內(nèi)移動性的步驟；確認即使在使改變原菌株和細胞壁的多個微生物傳代培養(yǎng)100代或200代后，細胞壁的特性是否得到維持的步驟；以及以1:1:3:3:3:1:1的比率混合上述微生物，并實現(xiàn)劑型化的步驟。本發(fā)明效果在于，提供以生物學方式復(fù)原被復(fù)合污染物質(zhì)的油類污染的土壤的混合微生物制劑及其制造方法，從而在利用微生物制劑對被復(fù)合污染物質(zhì)的油類污染的土壤進行復(fù)原的過程中，有利于將對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生的影響最小化，尤其，可以對被具有廣范圍的分子量和多種分子結(jié)構(gòu)且包含直鏈型碳化氫或脂肪族、芳香族碳化氫的復(fù)合污染物質(zhì)的油類進行綜合分解。根據(jù)本發(fā)明，與地下處理之類的原位（in-situ）處理工序、土壤耕作之類的離位（ex-situ）處理工序等不同工序的特性相匹配地提供具有差別化的油類分解功效的混合物生物制劑，從而具有對油類污染土壤實現(xiàn)最優(yōu)化，并可以實現(xiàn)綜合性復(fù)原的效果。根據(jù)本發(fā)明，提供在具有廣泛的油類分解能力，并需要優(yōu)秀的土壤滲透性的油類污染土壤進行地下處理的情況下，也長時間有效的油類污染土壤復(fù)原用微生物制劑，從而不僅可以綜合性地具有油類分解能力，而且可以噴灑于廣泛的污染區(qū)域或向地下注入，可以在廣泛的污染區(qū)域有效地適用原位處理工序，尤其，在復(fù)原由海洋油類泄漏事故引起的附近區(qū)域的土地或工業(yè)園區(qū)區(qū)域等廣泛的油類污染區(qū)域的土壤方面非常有效。附圖說明圖1為對本發(fā)明實施例的混合微生物制劑的制造方法進行說明的圖；圖2為表示利用本發(fā)明實施例的生化需氧量智能型混凝試驗攪拌機的分解率測試結(jié)果的圖；圖3為表示本發(fā)明實施例的油類碳化氫的分解率測定結(jié)果的圖；圖4為表示用于本發(fā)明實施例的微生物的土壤滲透性實驗的微型柱的圖；圖5為表示實施本發(fā)明實施例的細菌粘附烴測試的結(jié)果的圖；圖6為表示利用本發(fā)明實施例的甲磺酸甲酯來執(zhí)行微生物的細胞壁組成變化的結(jié)果的圖；圖7及圖8為表示本發(fā)明實施例的變異菌株的特征即使在進行100代及200代后也得到維持的試驗結(jié)果的圖；圖9至圖11為表示本發(fā)明實施例的原菌株和細胞壁的特性發(fā)生變化的微生物的油類碳化氫的分解率的圖。附圖標記的說明S101：添加水分的步驟S102：測定芳香族碳化氫分解率的步驟S103：測定TPH分解率的步驟S104：測定親水性的步驟S105：執(zhí)行細胞壁的組成成分變化的步驟S106：確認移動性的步驟S107：確認是否維持細胞壁特性的步驟S108：微生物的劑型化具體實施方式以下，參照附圖對本發(fā)明的實施例進行詳細的說明，以使本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
：的普通技術(shù)人員能夠容易地實施。但與本發(fā)明相關(guān)的說明僅為用于進行結(jié)構(gòu)性說明乃至功能性姓名的實施例，因此，本發(fā)明的保護范圍不應(yīng)被解釋為局限于本文所述的實施例。即，實施例可以進行多種變更，并可以具有多種形態(tài)，因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)被理解為可以實現(xiàn)技術(shù)思想的等同技術(shù)方案。并且，本發(fā)明所揭示的目的或效果并非為特定實施例包括這些目的或效果或僅包括這種效果的含義，因而本發(fā)明的保護范圍不應(yīng)被理解為因此而受到限制。以下，參照附圖對本發(fā)明實施例的混合微生物制劑及其制造方法進行詳細說明。本發(fā)明實施例的混合微生物制劑采集存在于油類污染土壤的多個微生物，并篩選油類分解能力優(yōu)秀的微生物菌株，篩選醋酸鈣不動桿菌（Acinetobactercalcoaceticus）DM、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae）DM、生癌腸桿菌（Enterobactercaucerogenus）DM、施氏假單胞菌（Pseudomonasstutzeri）OX1、紅串紅球菌（Rhodococcuserythropolis）、惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida）等共計6種菌株作為微生物菌株，并且，篩選紅球菌屬（Rodococcussp.）、不動桿菌屬（Acinetobactersp.）、大頭茶屬（Gordoniasp.）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacteriumsp.）OLu-1、莢膜黃桿菌（Novosphingobiumcapsulatum）OLu-2、不動桿菌屬（Acinetobactersp.）OLu-3、黃單胞菌屬（Xanthomonassp.）OLu-4中的至少一種菌株作為微生物菌株，對所篩選的總計7種相應(yīng)的微生物菌株進行培養(yǎng)，并以預(yù)設(shè)的比率（例如，1:1:2:2:1:1:1、1:1:3:3:3:1:1等）進行混合來制造。針對上述微生物，使用稀釋涂抹法，并利用滅菌后的蒸餾水按規(guī)定的比率進行稀釋后，在固體培養(yǎng)基中進行涂抹，并在30℃的條件下進行16小時的培養(yǎng)之后，測定微生物個體數(shù)，之后，為了在微生物制劑中恒定維持微生物的個體數(shù)而使用相同的方法。第一實驗例：具油類分解能力實現(xiàn)最優(yōu)化的微生物組成比的混合微生物制劑的制造第一，對利用生化需氧量（BOD，biochemicaloxygendemand）智能型混凝試驗攪拌機（jartester）的分解率的測定進行說明如下。圖1為對本發(fā)明實施例的混合微生物制劑的制造方法進行說明的圖。參照圖1，準確地測定了利用柴油（Diesel）以10000ppm（mg/kg）的條件使干燥的土壤受到污染的160的土壤。在稀釋上述的微生物，并將水分調(diào)節(jié)為20%來進行添加后（步驟S101），使用鑷子在平板（tablets）橡膠袋子放入NaOH（Sodiumhydroxide），使得生化需氧量智能型混凝試驗攪拌機（OxiTOP）完全封閉，并放入于20℃的培養(yǎng)基來實施零位校正，從而測定了上述微生物的芳香族碳化氫分解率（步驟S102）。圖2為表示利用本發(fā)明實施例的生化需氧量智能型混凝試驗攪拌機的分解率測試結(jié)果的圖。使使用于微生物制劑的微生物混合比率變得不同來測定的結(jié)果如圖2所示。此時，微生物作為醋酸鈣不動桿菌DM、肺炎克雷伯氏菌DM、生癌腸桿菌DM、施氏假單胞菌OX1、紅串紅球菌、惡臭假單胞菌等6種菌株以及紅球菌屬、不動桿菌屬、大頭茶屬、鞘氨醇桿菌屬OLu-1、莢膜黃桿菌OLu-2、不動桿菌屬OLu-3、黃單胞菌屬OLu-4中的1種菌株，7種微生物的混合比率為1:1:2:2:1:1:1，在分解芳香族碳化氫的微生物的相對比率得到完善的情況下，呈現(xiàn)出最佳的分解效果。第二，對油類碳化氫分解率的測定的說明如下。在執(zhí)行上述的步驟S102后，利用標準工序試驗法來測定殘留于土壤內(nèi)的總油類碳化氫的量，并計算出土壤內(nèi)油類碳化氫的分解率（步驟S103）。利用二氯甲烷從土壤內(nèi)抽取油類碳化氫后，使用GC（MS）來進行測定。圖3為表示本發(fā)明實施例的油類碳化氫的分解率測定結(jié)果的圖。為了使基于上述微生物的混合比率的變化的油類碳化氫的分解率實現(xiàn)最優(yōu)化，在經(jīng)過10日后，對多種微生物的組成比進行了分解率的測定。一邊恒定維持總個體數(shù)，一邊改變醋酸鈣不動桿菌DM、肺炎克雷伯氏菌DM、生癌腸桿菌DM、施氏假單胞菌OX1、紅串紅球菌、惡臭假單胞菌等6種菌株以及紅球菌屬、不動桿菌屬、大頭茶屬、鞘氨醇桿菌屬OLu-1、莢膜黃桿菌OLu-2、不動桿菌屬OLu-3、黃單胞菌屬OLu-4中的1種菌株的混合比率，并觀察了分解率。若按相應(yīng)的微生物制劑的順序分別標為A、B、C、D、E、F、G，并觀察油類碳化氫的分解率測定結(jié)果，則如圖3所示。在此，像生癌腸桿菌DM、施氏假單胞菌OX1、紅串紅球菌一樣對芳香族碳化氫擁有分解能力的微生物的相對比率高的1:1:3:3:3:1:1組合組被判斷為油類碳化氫的分解率高。因此，判斷今后為了復(fù)原被油類污染的土壤而應(yīng)當考慮污染物質(zhì)的種類，并適當?shù)卣{(diào)節(jié)混合微生物制劑中的微生物的相對比例。第二實施例：土壤滲透性優(yōu)秀的油類分解菌株混合制劑的制造第一，對滲透性實驗的說明如下。圖4為表示用于本發(fā)明實施例的微生物的土壤滲透性實驗的微型柱的圖。上述，利用40～70mesh的土壤體重新篩選所干燥的土壤，而為了對上述的微生物進行土壤滲透性實驗，使用小容量（例如，3mL）的塑料注射器作為圖4所示的微型柱，并在剝開過濾紙（WhatmanNo.4）后，利用40～70mesh的土壤體注入所篩選的1.5g的土壤。此時，在均勻地填充注入于各微型柱的土壤后，恒定維持體積。為了去除土壤內(nèi)的自生細菌的影響，在121℃的條件下進行20分鐘的濕潤滅菌后，在干燥箱（60℃）中放入一天以上，來去除濕氣，從而維持均勻條件的濕度。對從油類污染土壤中篩選并被判斷為油類分解性優(yōu)秀的醋酸鈣不動桿菌DM、肺炎克雷伯氏菌DM、生癌腸桿菌DM進行比較實驗。上述微生物為了維持適當?shù)幕钚远贚B（LuriaBertani）培養(yǎng)基中培養(yǎng)一整夜（overnight）（例如，16小時～18小時）后，重新在新的LB培養(yǎng)基中以O(shè)D6000.05～0.1的狀態(tài)進行重新接種，并重新培養(yǎng)至OD6000.6～0.8（exponentialphase）。使培養(yǎng)至指數(shù)為止的微生物進行離心分離（VS-15CFN，8000rpm，10min），來去除上清液，并對微生物進行篩選分離。上述，利用滅菌后的蒸餾水來對進行篩選分離的微生物進行3次清洗，來去除營養(yǎng)源及離子成分后，在滅菌后的蒸餾水中重新實施懸浮，從而制造了被調(diào)節(jié)為OD6000.2的水準的懸浮液。在微型柱中適用與微型柱內(nèi)的1.5g的土壤的外體積一樣的條件的1.8mL的微生物懸浮液，并進行了比較實驗。為了使微生物懸浮液和土壤充分接觸，在常溫、無菌狀態(tài)下放置30分鐘，并在微型柱插入滅菌后的注射針，來防止微生物懸浮液直接排出。在經(jīng)過30分鐘后，使懸浮液進行重力排水，并在利用滅菌后的蒸餾水適當?shù)叵♂尳?jīng)過微型柱的余液后，在LB瓊脂（agar）培養(yǎng)基中涂抹稀釋液，并在30℃培養(yǎng)基中培養(yǎng)了16小時～18小時。測定在平板培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)后生成的菌落數(shù)，來計算出菌落形成單位（CFU，ColonyFormingUnit）值，而就滲透性而言，求得向微型柱投入的微生物的個體數(shù)的滲透微型無的個體數(shù)的百分率比，來篩選出土壤內(nèi)滲透性優(yōu)秀的菌株。第二，對細菌粘附烴（BATH，bacterialadherencetoHydrocarbon）測試進行說明如下。上述微生物的土壤內(nèi)移動性受細胞壁的特性的影響，細菌和霉菌等根據(jù)生長條件（溶解氧的濃度、pH生長培養(yǎng)基中營養(yǎng)源的種類）來改變微生物細胞壁的特性，由此，對細胞壁的親水性和疏水性產(chǎn)生影響。根據(jù)其表面的特性，疏水性的物質(zhì)部與親水性的物質(zhì)相結(jié)合而與疏水性的物質(zhì)相結(jié)合，普通的油類物質(zhì)（即，碳化氫等）的液滴具有疏水性。在使無疏水性溶劑和無法掌握其表面的特性的微生物懸浮液相混合后，實現(xiàn)停滯，并到達平行之后，測定在作為親水性的培養(yǎng)基和作為疏水性的溶劑中展開的微生物量的比，從而可以掌握微生物細胞壁的特性。在進行混合的期間內(nèi)，使得位于水層的微生物中的細胞壁的特性為疏水性的微生物向疏水性溶劑層移動，使得存在于親水性的水層的微生物的量減少。因此，若測定停滯后的水層的光學密度（OD，OpticalDensity），則在疏水性微生物的情況下，光學密度的減少幅度增加。利用這種方法觀察了被判斷為油類分解性優(yōu)秀的醋酸鈣不動桿菌DM、肺炎克雷伯氏菌DM、生癌腸桿菌DM等菌株的細胞壁的特性。作為疏水性溶劑，使用了對二甲苯（p-xylene）（Junsei，日本（Japan））。針對各菌株，利用與滲透性實驗方法相同的方法制造出活性得到維持的微生物，并利用蒸餾水調(diào)節(jié)所制造的懸浮液成為OD4000.5的水準，并在管（tube）中放入4ml的懸浮液來停滯30分鐘后，重新測定了準確的OD400值。在管中放入1ml的對二甲苯，并利用振蕩器（IKA，日本（Japan））來準確混合1分鐘后，在室溫條件下放置30分鐘，使得碳化氫層和水層（微生物懸浮液）相分離后，測定OD400值f，從而計算出相對于初始光學密度值i的最終光學密度值f之比。在此，光學密度值f的比值越接近1，微生物細胞壁的組成成分越成為親水性，光學密度值f的比值月小，越呈現(xiàn)出具有疏水性的細胞壁的組成成分的微生物。圖5為表示實施本發(fā)明實施例的細菌粘附烴測試的結(jié)果的圖。在此，圖5的（a）部分表示相比于醋酸鈣不動桿菌的懸浮液的水性相的吸水減少率，圖5的（b）部分表示相比于生癌腸桿菌的懸浮液的水性相的吸收減少率。油類分解性優(yōu)秀的醋酸鈣不動桿菌DM、肺炎克雷伯氏菌DM、生癌腸桿菌DM等的菌株呈現(xiàn)出不同的細胞壁的特性。在執(zhí)行上述的步驟S103后，為了檢測微生物的土壤內(nèi)移動性而實施細菌粘附烴測試，從而可以測定微生物的親水性（步驟S104）。此時，作為細菌粘附烴測試的結(jié)果，如圖5所示，醋酸鈣不動桿菌的細胞壁的特性在比較菌株中疏水性最高，生癌腸桿菌的表面的親水性最高?？芍@種細胞壁的親水性、疏水性的變化對微生物的土壤內(nèi)移動性產(chǎn)生很大影響。在細胞表面尤其為疏水性的醋酸鈣不動桿菌的土壤內(nèi)的滲透性最差，細胞壁為親水性的生癌腸桿菌的土壤內(nèi)的滲透性最優(yōu)秀。微生物的土壤內(nèi)移動性與油類分解性一樣，同樣為重要的變數(shù)。在注入細胞壁的疏水性強的油類分解微生物的培養(yǎng)液的情況下，相比于注入親水性的油類分解微生物的情況，因土壤內(nèi)移動性低而無法向污染區(qū)域投入。即，判斷出適用細胞壁的親水性高的微生物在進行生物學復(fù)原方面更為有效。第三實驗例：油類分解菌株的土壤改善方法第一，基于微生物細胞壁的化學變化的滲透性調(diào)節(jié)的說明如下。在執(zhí)行上述的步驟S104后，作為用于增進被判斷為油類分解性佳，且被使用于土壤滲透性的微生物的醋酸鈣不動桿菌、肺炎克雷伯氏菌、生癌腸桿菌等的滲透性的方法，利用甲磺酸甲酯（methylmethanesulfonate；MMS，Sigma）來執(zhí)行了上述微生物的細胞壁組成變化（步驟S105）。而且，使各微生物在M9最小培養(yǎng)基中培養(yǎng)一整夜（例如，16小時～18小時）后，從新在最小培養(yǎng)基中以O(shè)D6000.05～0.1的狀態(tài)重新接種，并培養(yǎng)至OD6000.6～0.8（exponentialphase）。使培養(yǎng)至指數(shù)為止的微生物進行離心分離（8000rpm，10min），來去除上清液，并收集微生物，在使用磷酸鹽緩沖液（0.1MPPB，pH7）對所收集的微生物進行3次清洗，并重新在M9中實施懸浮。以使微生物懸浮液的濃度成為OD5502的方式進行稀釋，來制造了懸浮液，并在滅菌后的3個離心分離用微型管（microcentrifugetube）中分別注入了1.25ml的相應(yīng)的微生物懸浮液。其中，在2個管中分別放入6.25μl、12.5μl的甲磺酸甲酯，并利用振蕩器來在30秒鐘內(nèi)進行適當?shù)恼袷?。?0℃的條件下，使適當濃度的微生物懸浮液和MMS（Sigma）完全混合而成的懸浮液培養(yǎng)一小時后，進行離心分離，之后去除上清液，并利用25ml的M9最小培養(yǎng)基進行清洗。之后，重新進行離心分離后，利用10ml的M9最小培養(yǎng)基進行清洗，并使所聚集的微生物在10ml的M9最小培養(yǎng)基中實施懸浮。在30℃的條件下，使微生物懸浮液培養(yǎng)一小時，并利用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，phosphatebuffersaline）使其中的一部分以適當?shù)臐舛认♂專⑼磕ㄓ贚B板（plate）。在使剩余的培養(yǎng)液在M9最小培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時～18小時后，重新在M9最小培養(yǎng)基中以O(shè)D6000.05～0.1狀態(tài)實施重新接種，并在培養(yǎng)至OD6000.6～0.8（exponentialphase）為止后，使用PPB清洗3次，并利用微型柱來進行了數(shù)次反復(fù)滲透實驗。為了認為地改變油類分解微生物的細胞壁的特性，來使土壤內(nèi)移動性增進，使用甲磺酸甲酯來以化學性的方式改變微生物的細胞壁的組成成分。改變甲磺酸甲酯的投入濃度來調(diào)節(jié)了變化程度。可知當為了增進微生物的土壤滲透性而使發(fā)生變化的2.5ml的微生物懸浮液滲透3g的土壤時，與未發(fā)生變化的原來的菌株相比，滲透性得到提高。圖6為表示利用本發(fā)明實施例的甲磺酸甲酯來執(zhí)行微生物的細胞壁組成變化的結(jié)果的圖。如圖6所示，在醋酸鈣不動桿菌（AC）的情況下，被6.25μl的甲磺酸甲酯處理的微生物的滲透性在醋酸鈣不動桿菌為0%時提高為14.7±2.9%。在肺炎克雷伯氏菌（KP）的情況下，可知當原菌株的土壤滲透性為0%時利用6.25μl的MMS來得到處理的菌株（M_1）、利用12.5μl的MMS來得到處理的菌株（M_2）的滲透性分別相對提高3±0.25%、99±13.82%。并且，在細胞壁的親水性佳的原來的生癌腸桿菌（EC）的情況下，可知當利用原菌株的土壤滲透性為約1±0.27%時利用6.25μl的MMS來得到處理的菌株（M_1）、利用12.5μl的MMS來得到處理的菌株（M_2）的滲透性分別為3.3±1.13%、2.2±0.95%，土壤滲透性得到提高，從而與其他菌株相比，土壤移動性的增進相對不是很大。上述的特性如圖6所示，即使在對原菌株和發(fā)生變化的菌株進行100代以上的傳代培養(yǎng)之后，也呈現(xiàn)出幾乎相同的形態(tài)。在醋酸鈣不動桿菌的情況下，在100代之后發(fā)生變異的微生物（AC100generation）的滲透性在原株的滲透性為0%時，增加為36±13.9%，在肺炎克雷伯氏菌（KP100generation）的情況下，當原株的土壤滲透性為0%時變異為6.25μl、12.5μl的變異株分別呈現(xiàn)出12.6±4.3%、87.1±31.6%的滲透性，在生癌腸桿菌（EC100generation）的情況下，當原株的土壤滲透性為約0.04±0.04%時變異為6.25μl、12.5μl的變異株分別呈現(xiàn)出3.8±0.08%、3.7±0.6%的滲透性，因此，可知當考慮誤差時，100代后的微生物的滲透性與出示變異菌株相比，土壤內(nèi)移動性相對略有提高或幾乎呈現(xiàn)出相似的水準。第二，對電動電勢（Zetapotential）測定的說明如下。在執(zhí)行上述的步驟S105后，可以執(zhí)行電動電勢測定來確認上述微生物的土壤內(nèi)移動性（步驟S106）。此時，在M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)一整夜（例如，16小時～18小時）的各菌株后，重新在M9最小培養(yǎng)基中以O(shè)D6000.05～0.1的狀態(tài)進行重新接種，并培養(yǎng)至OD6000.6～0.8（exponentialphase）。在培養(yǎng)至指數(shù)以上后，進行離心分離（8000rpm，10min），并去除上清液，回收微生物。使用磷酸鹽緩沖液（0.1MPPB，pH7）進行3次清洗，并以使微生物懸浮液的濃度成為大致2.5×108cells/ml（OD600≒2）的方式實施懸浮。在常溫條件下對懸浮液進行3～5分鐘的超聲波降解（sonication）（BRANSONIC，Ultrasoniccleanser），并將此在滅菌后的微型管中分別分株1ml。使用ELS-8000（Otsuka，日本（Japan））作為測定儀，并為了獲得電動電勢測定的準確性而在每次進行微生物的測定時，在清洗干凈測定儀內(nèi)的多個細胞后，反復(fù)測定2次。作為與滲透性相比較來掌握細胞壁變化的特性的方法，利用了電動電勢。若電動電勢的絕對值變小，則微生物的細胞壁呈現(xiàn)出親水性。圖7及圖8為表示本發(fā)明實施例的變異菌株的特征即使在進行100代及200代后也得到維持的試驗結(jié)果的圖。如圖7及圖8所示，呈現(xiàn)出作為微生物的醋酸鈣不動桿菌（AC）、肺炎克雷伯氏菌（KP）及生癌腸桿菌（EC）和以相應(yīng)的微生物的細胞壁呈現(xiàn)出親水性的方式發(fā)生變異的變異菌株的特征即使在100代及200代后也得到維持的試驗結(jié)果，在此，可以對菌株和變異菌株的電動電勢值進行比較。在醋酸鈣不動桿菌（AC）的情況下，電動電勢絕對值的增加幅度小，且在誤差范圍內(nèi)發(fā)生變化。相反，在肺炎克雷伯氏菌（KP）或生癌腸桿菌（EC）的情況下，可知變異菌株的電動電勢絕對值明顯減少?？芍龑?dǎo)化學變異，使得細胞壁的特性變化為親水性。在生癌腸桿菌（EC）的情況下，與相對不同的兩個菌株（肺炎克雷伯氏菌（KP）及生癌腸桿菌（EC））相比，菌株的滲透性高，這是因為生癌腸桿菌（EC）的細胞壁的特性為原來的親水性。由于這種特性，可知生癌腸桿菌（EC）即使引誘變異，細胞壁的特性變化也不大。即，以化學性的方式發(fā)生變化的多個菌株的土壤內(nèi)滲透性可以增進，而即使在100代、200代后，引誘化學變化來使細胞壁的特性變化為親水性的微生物的特征依舊得到維持。第三，對土壤移動性增進微生物的油類分解性（TPH）的說明如下。一邊為了增進土壤滲透性而變化微生物的細胞壁，一邊為了掌握是否對微生物的油類分解性產(chǎn)生影響，以與上述的方法相同的方式測定了微生物的油類分解性。圖9至圖11為表示本發(fā)明實施例的原菌株和細胞壁的特性發(fā)生變化的微生物的油類碳化氫的分解率的圖。在此，圖9示出作為原菌株的醋酸鈣不動桿菌（AC）和細胞壁的特性發(fā)生變化的微生物（ACM2）（即，利用12.5μl的MMS來使醋酸鈣不動桿菌（AC）發(fā)生變換的菌株）的油類碳化氫的分解率，圖10示出作為原菌株的肺炎克雷伯氏菌（KP）和細胞壁的特性發(fā)生變化的微生物（KPM2（即，利用6.25μl的MMS來使肺炎克雷伯氏菌（KP）發(fā)生變換的菌株）、KPM2（即，利用12.5μl的MMS來使肺炎克雷伯氏菌（KP）發(fā)生變換的菌株））的油類碳化氫的分解率，圖11示出作為原菌株的生癌腸桿菌（EC）和細胞壁的特性發(fā)生變化的微生物（ECM1（即，利用6.25μl的MMS來使生癌腸桿菌（EC）發(fā)生變換的菌株）、ECM2（即，利用12.5μl的MMS來使生癌腸桿菌（EC）發(fā)生變換的菌株））的油類碳化氫的分解率。在執(zhí)行上述的步驟S106后，可以確認使原菌株和細胞壁發(fā)生變化的多個微生物在進行100代或200代的傳代培養(yǎng)（generation）后，細胞壁的特性是否得到維持（步驟S107）。在此，在整體上，與原菌株相比，呈現(xiàn)出±10%左右的分解性，而對于使原菌株和細胞壁發(fā)生變化的多個微生物進行100代或200代的傳代培養(yǎng)的多個微生物而言，傳代培養(yǎng)期間變得越長，油類分解性越減少，這被判斷為使用LB培養(yǎng)基的持續(xù)的傳代培養(yǎng)而呈現(xiàn)出引誘（inducing）微生物內(nèi)油類分解性途徑的代謝所參與的酶的效果。在執(zhí)行上述步驟S107后，能夠以預(yù)設(shè)的比率（例如，1:1:2:2:1:1:1、1:1:3:3:3:1:1等）混合上述的微生物來實施劑型化（步驟S108）。具有上述構(gòu)成的混合微生物制劑及其制造方法，利用微生物制劑對被復(fù)合污染物質(zhì)的油類污染的土壤進行復(fù)原的過程中，有利于將對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生的影響最小化，尤其，可以對被具有廣范圍的分子量和多種分子結(jié)構(gòu)且包含直鏈型碳化氫或脂肪族、芳香族碳化氫的復(fù)合污染物質(zhì)的油類進行綜合分解。本發(fā)明提供，與地下處理之類的原位（in-situ）處理工序、土壤耕作之類的離位（ex-situ）處理工序等不同工序的特性相匹配地，具有差別化的油類分解功效的混合物生物制劑，從而具有對油類污染土壤實現(xiàn)最優(yōu)化，并可以實現(xiàn)綜合性復(fù)原的效果。且本發(fā)明提供，在具有廣泛的油類分解能力，并需要優(yōu)秀的土壤滲透性的油類污染土壤進行地下處理的情況下，也長時間有效的油類污染土壤復(fù)原用微生物制劑，從而不僅可以綜合性地具有油類分解能力，而且可以噴灑于廣泛的污染區(qū)域或向地下注入，可以在廣泛的污染區(qū)域有效地適用原位處理工序，尤其，在復(fù)原由海洋油類泄漏事故引起的附近區(qū)域的土地或工業(yè)園區(qū)區(qū)域等廣泛的油類污染區(qū)域的土壤方面非常有效。以上雖然對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍不限于此，利用發(fā)明要求保護范圍所定義的本發(fā)明的基本概念的普通技術(shù)人員的多種變形及改良形態(tài)也同樣屬于本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3