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含抗間皮素單鏈抗體的嵌合抗原受體修飾的樹突狀細胞及其用途的制作方法

文檔序號:12029133閱讀:500來源:國知局
含抗間皮素單鏈抗體的嵌合抗原受體修飾的樹突狀細胞及其用途的制作方法與工藝

本發(fā)明屬于腫瘤生物制品領域,具體地,涉及過繼免疫治療中的一種嵌合抗原受體mesocar及其基因和重組表達載體、工程化的靶向間皮素的dc細胞(mesocar-dc)及其應用。



背景技術:

樹突狀細胞(dendriticcells,dcs)是一類成熟時具有許多樹突樣凸起的、能夠識別、攝取和加工外源性抗原并將抗原肽提呈給初始t細胞并誘導t細胞活化增殖的、功能最強的抗原呈遞細胞。

目前的dc細胞免疫治療,是分離腫瘤患者自身的單核細胞,在體外培養(yǎng)、擴增、并誘導其生成dc,然后讓dc負載相應的腫瘤抗原,經嚴格篩選后制備成負載腫瘤抗原的dc,然后將這些dc細胞回輸到相應患者體內,刺激、激活人體內的天然抗腫瘤系統(tǒng)。dc免疫細胞治療廣泛適用于多種腫瘤的治療,但是,單純靠體外活化dc細胞取得的療效有限,因此在dc細胞免疫治療腫瘤的方法上仍需進一步改善。

嵌合抗原受體t細胞療法(chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy,car-t)是目前最有發(fā)展前景的腫瘤免疫療法之一。一般的,嵌合抗原受體car由一個腫瘤相關抗原結合區(qū)、胞外鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)域以及胞內信號轉導區(qū)組成。car-t細胞療法通過把能特異性識別腫瘤相關抗原的單鏈抗體(singlechainfragmentvariable,scfv)和t細胞活化序列偶聯(lián),并使其表達到t細胞表面,使能特異性識別腫瘤相關抗原的scfv通過跨膜區(qū)與t細胞胞內的活化增殖信號域偶聯(lián)。表達car的t細胞以抗原依賴、但非mhc限制的方式識別并結合腫瘤抗原,啟動并活化特異性殺傷腫瘤反應。

人間皮素(mesothelin,簡寫為meso)是一種40kda的細胞表面的糖基磷脂酰肌醇(gpi)-連接的糖蛋白。間皮素以相對低的水平存在于健康個體的胸膜、腹膜及心包膜的間皮細胞中,但在許多不同的癌癥中高度表達,包括間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、鱗狀細胞癌、前列腺癌、肺癌、膽管癌和乳腺癌。已經在多于55%的肺癌和多于70%的卵巢癌中檢測到高水平的間皮素。早期臨床數據表明,間皮素特異的car-t細胞可被機體很好的耐受,并且對于卵巢癌,胰腺癌,間皮素瘤有很好的臨床效果。但car-t可產生一定的脫靶毒性,影響其細胞免疫療效;而且更重要的是,由于腫瘤的異質性,同一個腫瘤往往存在多種腫瘤抗原,因此針對單一腫瘤抗原的car-t療效有限,而且容易復發(fā)。

因此,我們設計了一種新型的dc細胞治療腫瘤策略,利用慢病毒系統(tǒng)將間皮素信號域與腫瘤相關嵌合抗原受體融合,轉導dc細胞,使其在dc細胞表面表達間皮素特異性的car,通過識別腫瘤細胞表面的間皮素與腫瘤細胞結合,活化dc細胞,并將信號呈遞給具殺傷效應的t淋巴細胞,從而激活t細胞的特異性腫瘤殺傷能力,并激活自身免疫,來達到監(jiān)測、殺滅腫瘤的目的,并且可以有效降低由于脫靶效應造成的毒副作用,以及腫瘤異質性導致的復發(fā)及耐受。



技術實現要素:

為了克服現有技術中體外活化dc細胞對腫瘤的殺傷作用比較弱、特異殺傷活性有待提高的缺陷,本發(fā)明提供了以下方面。

本發(fā)明首先提供了一種嵌合抗原受體(car),所述嵌合抗原受體由人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)信號肽、抗間皮素單鏈抗體(ss1scfv)、人cd8α鉸鏈區(qū)、人cd40的跨膜區(qū)和胞內信號區(qū)串聯(lián)構成,稱為mesocar。

進一步的,所述單鏈抗體的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明還提供了編碼所述嵌合抗原受體的基因,其核苷酸序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明還提供了表達載體,其包含并能表達氨基酸序列為seqidno.1所示的嵌合抗原受體的編碼基因。

進一步地,所述表達載體為慢病毒載體pcdh-mesocar。

本發(fā)明還提供了一種工程化的樹突狀細胞,其含有所述表達載體。

進一步地,所述表達載體為慢病毒載體pcdh-mesocar。

本發(fā)明還提供了所述的工程化的dc細胞在制備用于治療癌癥的制劑中的用途。

進一步地,所述癌癥是間皮素陽性的間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、鱗狀細胞癌、前列腺癌、肺癌、膽管癌和乳腺癌;優(yōu)選胰腺癌。

本發(fā)明還提供了一種表達嵌合抗原受體的樹突狀細胞的方法,其包括將所述嵌合抗原受體的表達載體轉染進樹突狀細胞。

進一步地,所述方法中的嵌合抗原受體為所述mesocar,優(yōu)選為具有seqidno.1所示的氨基酸序列。

進一步地,所述方法中的表達載體包含并能表達氨基酸序列為seqidno.1所示的嵌合抗原受體的編碼基因,優(yōu)選為慢病毒載體pcdh-mesocar。

在一些實施方案中,本發(fā)明所述的car的結構是由單鏈抗體(scfv)、鉸鏈區(qū)(hinge)、跨膜區(qū)(transmembranedomain)、信號域(signaldomain)組成。其中scfv區(qū)由輕鏈可變區(qū)序列和重鏈可變區(qū)序列組成;輕鏈區(qū)和重鏈區(qū)之間通過(gly4-ser)n接頭;單鏈抗體(scfv)結合序列可以為腫瘤相關抗原,如cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd123、cd138、cea、cmet、egfrviii、il33rα2、fap、her2、gd2、psma、muc1、muc16、間皮素和ncam等中的一種或幾種;鉸鏈區(qū)序列為fcγriiiαhinge、cd8αhinge、igg1/4hinge中的一種;跨膜區(qū)序列為cd8αtm、fcεriα-tm、cd40-tm中的一種。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所使用的嵌合抗原受體mesocar的結構示意圖。

圖2為慢病毒表達載體pcdh-mesocar質粒信息圖。

圖3為熒光顯微鏡檢測慢病毒pcdh-mesocar侵染dc細胞的熒光表達情況;a為未侵染的dc細胞,b為pcdh-car(meso)病毒侵染的dc細胞

圖4為體外mesocar-dc細胞與mesothelin+a431細胞(人間皮素過表達的a431細胞)共培養(yǎng)后活化情況,通過流式檢測mhc-i/mhc-ii/cd86/cd40的表達水平分析dc細胞的活化程度。

a為mesocar-dc細胞;b為mesocar-dc細胞與mesothelin+a431以3:1的比例共培養(yǎng)。

圖5為效應細胞mesocar-dc,靶細胞a431-h9,cd8+t細胞以3:1:3比例共培養(yǎng)后,通過流式檢測cd25的表達水平分析t細胞激活情況。

a:未處理的dc細胞與靶細胞a431,cd8+t細胞共培養(yǎng);b:pcdh-空載體轉導的dc細胞與靶細胞a431,cd8+t細胞共培養(yǎng);c:pcdh-mesocar轉導dc細胞與靶細胞a431,cd8+t細胞共培養(yǎng)。

圖6為mesocar-dc治療間皮素陽性荷瘤小鼠后,腫瘤體積的變化情況。

a:小鼠尾靜脈注射1x10^6dc細胞和1x10^6cd8+t細胞;

b:小鼠尾靜脈注射1x10^6慢病毒空載體轉導體外培養(yǎng)dc細胞和1x10^6cd8+t細胞;

c:小鼠尾靜脈注射1x10^6pcdh-mesocar-dc細胞和1x10^6cd8+t細胞。

圖7為mesocar-dc治療間皮素陽性荷瘤小鼠后,小鼠的存活情況。

a:小鼠尾靜脈注射1x10^6dc細胞和1x10^6cd8+t細胞;

b:小鼠尾靜脈注射1x10^6慢病毒空載體轉導體外培養(yǎng)dc細胞和1x10^6cd8+t細胞;

c:小鼠尾靜脈注射1x10^6pcdh-mesocar-dc細胞和1x10^6cd8+t細胞。

具體實施方式

以下對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是,此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明,并不用于限制本發(fā)明。

以下實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為本領域常規(guī)方法。

下述實施例中所用的實驗材料,如無特殊說明,均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到,其中:

dmem培養(yǎng)基、x-vivo15培養(yǎng)基購自takara公司。

淋巴細胞分離液購自tbd公司。

t4dna連接酶購自takara公司。

限制性核酸內切酶ecori、xbai購自thermofisherscientific公司。

pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro(簡稱pcdh)及其包裝質粒plp1、plp2、plp/vsvg購自addgene公司。

瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒、普通dna產物純化試劑盒、質粒小提試劑盒均購自天根生化科技有限公司。

pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro購自addgene公司。

dh5αphageresistant化學感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

lipofectaminetm2000transfectionreagent轉染試劑購自invitrogen公司。

293t包裝細胞購自美國atcc。

a431細胞系購自美國atcc。

bhk21細胞系購自美國atcc

胎牛血清購自gibco公司。

peg6000和nacl均購自上海索萊寶生物科技有限公司。

免疫缺陷模式小鼠(nsg)購自北京維通達生物技術有限公司。

基因由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

人gm-csf、il-4、rhil-2、cd3/cd28抗體等購自ebioscience公司。

抗mhc-i,mhc-ii,cd80,cd86,cd3,cd25等流式抗體購自bd公司。

實施例

一、mesocar基因序列的確定

1.1從美國國立醫(yī)學圖書館網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)genbank數據庫中搜索到人gm-csf信號肽基因seqidno.3、人cd8α鉸鏈區(qū)基因seqidno.4、人cd40跨膜區(qū)和胞內信號區(qū)基因序列seqidno.5??归g皮素單鏈抗體(抗ss1scfv)基因序列為seqidno.6。

1.2將上述基因序列依次按人gm-csf信號肽基因、抗ss1scfv、人cd8α鉸鏈區(qū)基因、人cd40跨膜區(qū)和胞內信號區(qū)序列進行連接,形成最終完整的gm-csf-ss1scfv-cd8α-cd40(mesocar)基因序列seqidno.2。

二.pcdh-mesocar表達質粒的構建

2.1全基因合成:

由上海生工合成完整的mesocar基因序列,并在兩端添加酶切位點xbai/ecori。

2.2將上述序列克隆到pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro(簡稱pcdh)慢病毒表達載體中,獲得抗人間皮素-car的表達質粒。

分別將mesocar和慢病毒表達載體pcdh用xbai/ecori進行酶切,酶切體系如下,37℃水浴>1小時。

將酶切產物瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定,對正確的產物進行膠回收。

將相應酶切產物用t4dna連接酶進行連接,連接體系如下:

16℃過夜連接,連接產物轉化dh5a感受態(tài)細胞。

2.3從轉化有pcdh-mesocar的平板中隨機挑取4個單克隆,分別加入含有ampicillin氨芐青霉素(100ug/ml)的4ml的lb培養(yǎng)基中進行擴培,6-8小時后進行質粒提取,并用xbai/ecori進行酶切鑒定,回收大小正確的酶切片段,送上海生工進行測序進一步確定。測序正確的即為pcdh-mesocar。

三.慢病毒的包裝、濃縮和滴度測定

3.1慢病毒的包裝:

3.1.1細胞處理:轉染前24小時收集處于對數生長期的第3-10代293t細胞,將5×10^6293t細胞接種于10cm培養(yǎng)板中,細胞在含有10ml10%fbs的dmem培養(yǎng)基中生長,置37℃5%co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時,達60-80%密度時可進行轉染。

3.1.2向細胞中以5:2:2:2的比例共轉染慢病毒載體質粒(pcdh-mesocar或其空載體pcdh)及其包裝質粒plp1,plp2,plp/vsvg;轉染體系如下:

6~8小時后將10cm培養(yǎng)盤中培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基。

3.1.3轉染后24小時,于熒光顯微鏡下觀察293t細胞轉染后gfp熒光表達情況。分別于轉染24小時、48小時后收集293t培養(yǎng)上清,3000rpm離心15分鐘,72小時后收集293t細胞和上清于15ml管,反復凍融三次裂解細胞,離心收集上清;

3.1.4用0.45μm濾器過濾病毒上清,分別獲得pcdh-空載體和pcdh-mesocar病毒原液;-80℃保存。

3.2慢病毒濃縮

3.2.1分別收集細胞及培養(yǎng)上清,peg6000濃縮病毒,向病毒溶液中加入1/4體積的peg6000/nacl溶液(25%peg6000+4.4%nacl),混勻,4℃靜置1小時;

3.2.24℃,5000rpm離心30分鐘;

3.2.3棄上清,加入2ml病毒溶解液(10mmtris-hcl(ph8.0),2mmmgcl2,5%蔗糖)溶解慢病毒沉淀,并分裝于-80℃儲存。

3.3慢病毒滴度測定

3.3.1預先接種bhk21細胞至24孔板,10^5細胞/孔,置于37℃5%co2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)18小時;

3.3.2溶解病毒,準備從10-2到10-7做10倍梯度稀釋病毒樣品;

3.3.3去除細胞培養(yǎng)液,加入含有不同梯度的病毒細胞培養(yǎng)液,并在培養(yǎng)液中加入6ug/ml的聚凝胺(polybrene),置于37℃5%co2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時;

3.3.4去除細胞培養(yǎng)液,加入10%fbs的dmem培養(yǎng)液,置于37℃5%co2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時;

3.3.5去除細胞培養(yǎng)液,加入含2ug/ml嘌呤霉素和1%fbs的dmem培養(yǎng)液,置于37℃5%co2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時;

3.3.6去除細胞培養(yǎng)液,加入結晶紫染色液,計數被染色克隆數,并計算病毒滴度。

3.2.10將病毒稀釋至10^7tu/ml,于-80℃儲存。

四.dc細胞的體外培養(yǎng)、感染和擴增

1用cd14+分選試劑盒(購自stemcell公司)將cd14+細胞從pbmc中分選出來。

2用x-vivo15培養(yǎng)基重懸細胞,加入500u/ml的gm-csf溶液、500u/ml的il-4溶液和一定量的自體血漿,誘導cd14+細胞向dc細胞分化。

3向培養(yǎng)6至8天的dc細胞中每孔分別加入pcdh-空載體或pcdh-mesocar病毒濃縮液(梯度設定,確定最佳感染滴度),以及終濃度為6μg/ml的聚凝胺,混勻,置于37℃,5%co2培養(yǎng)箱培養(yǎng),24小時內不換液;感染后24小時進行第二次感染;

4感染后96小時,用熒光顯微鏡觀察dc細胞的綠色熒光表達情況并照相。結果見圖3。

5收集細胞后,1000rpm離心10分鐘,pbs洗滌1次,用適量pbs重懸細胞置于流式管中,用流式細胞儀檢測gfp陽性率。

五.體外共培養(yǎng)測定car-dc細胞的活化及對t細胞的激活作用

5.1分析dc細胞活化,效應細胞mesocar-dc與靶細胞間皮素+a431(人間皮素轉染a431細胞)細胞以不同比例共培養(yǎng)后,通過流式檢測表明dc細胞活化的mhc-i/mhc-iii/cd86/cd40的表達水平。結果見圖4。

5.2分析t細胞激活

5.2.1t細胞的分離培養(yǎng),用cd8+t細胞分選試劑盒(購自stemcell公司)將t細胞從外周血單核細胞(pbmc)中分選出來;

5.2.2用含10%fbs的rpmi1640培養(yǎng)基調整細胞濃度至1×10^6/ml,將細胞接種到預先用抗人cd3和cd28抗體包被的細胞培養(yǎng)瓶中,再加入200iu/ml重組人白細胞介素2(rhil-2),置于37℃5%co2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng);

5.2.3mesocar-dc,a431,cd8+t細胞以3:1:3比例共培養(yǎng)后,通過流式檢測t細胞活化的cd25的表達水平,分析t細胞激活情況。結果見圖5,與對照相比mesocar-dc對t細胞的刺激作用明顯。

六.體內mesocar-dc細胞對間皮素+腫瘤的殺傷活性

6.1nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj(nsg)小鼠在皮下植入5x10^6原代a431-h9(人間皮素穩(wěn)轉a431)細胞,觀察并測量腫瘤生長情況,直至腫瘤生長至40mm3,給予car-dc。

6.2mesocar-dc細胞治療間皮素陽性荷瘤小鼠的效果測定:從小鼠尾靜脈注射1x10^6mesocar-dc和1x10^6cd8+t細胞,觀察并測量腫瘤的生長情況,結果見圖6,同時記錄小鼠存活情況,結果見圖7。

由圖可知,mesocar-dc細胞組的荷瘤小鼠治療后28天生存率為100%,而單dc細胞治療及空載體dc細胞組小鼠全部死亡。說明mesocar-dc對于間皮素陽性荷瘤小鼠有很好的治療效果。

序列表

<110>時力生物科技(北京)有限公司

<120>含抗間皮素單鏈抗體的嵌合抗原受體修飾的樹突狀細胞及其用途

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>394

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>mesocar的氨基酸序列

<400>1

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151015

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<223>人cd40跨膜區(qū)及胞內信號區(qū)的核酸序列

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