一種培養(yǎng)杜仲細(xì)胞生產(chǎn)黃酮的培養(yǎng)基及其制備方法與流程

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導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明屬于植物細(xì)胞培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種培養(yǎng)杜仲細(xì)胞生產(chǎn)黃酮的培養(yǎng)基及其制備方法。

背景技術(shù)：

杜仲屬杜仲科杜仲屬，為杜仲科多年生落葉喬木。杜仲是我國特產(chǎn)古老樹種，屬國家二類保護(hù)樹種。杜仲是一種名貴的藥用植物，樹皮、葉均可入藥，味甘、微辛，性溫，具有補(bǔ)肝腎、壯筋骨、安胎、降血壓等功能，主治腎虛腰痛、筋骨痞軟、乏力眩暈、小便頻數(shù)、陽萎、遺精、胎元不固、高血壓等。樹皮含樹脂，藥理研究證實(shí)，樹皮提取物具有降壓、利尿作用，又能減少膽固醇的吸收，是一種良好的抗衰老天然藥物。杜仲葉中也有十幾種藥用有效成分，目前，專家已成功分離并提取抗衰老作用強(qiáng)、降血壓、調(diào)節(jié)免疫作用的成分，國外還研究出其具有促進(jìn)骨細(xì)胞和肌肉纖維生長的作用等。杜仲富含黃酮類化合物，不僅具有治療糖尿病的功效，同時研究表明，杜仲黃酮類物質(zhì)還具有明顯的調(diào)節(jié)骨代謝功能的藥效作用，可防治骨質(zhì)疏松。

中國專利CN101358197B提供了一種杜仲毛狀根誘導(dǎo)生產(chǎn)藥用成分桃葉珊瑚甙的方法，遺傳轉(zhuǎn)化獲得可生產(chǎn)桃葉珊瑚甙的杜仲毛狀根，其過程是用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化杜仲，獲得了杜仲毛狀根，經(jīng)分子檢測確為遺傳轉(zhuǎn)化的毛狀根，HPLC檢測表明遺傳轉(zhuǎn)化獲得的杜仲毛狀根能夠生產(chǎn)桃葉珊瑚甙。中國專利CN1422948B公開了一種植物細(xì)胞培養(yǎng)基及使用培養(yǎng)基培養(yǎng)植物細(xì)胞的方法，該培養(yǎng)基應(yīng)用水培技術(shù)，含有1.0mM-6.0mM鈣鹽，1.0nm-6.0mm硝酸鹽和1.0ng-5.0ng/L磷酸鹽；優(yōu)選的鈣鹽為CaCl₂·2H₂O，硝酸鹽為NaNO₃，磷酸鹽為Ca₃(P0₄)₂。

由于杜仲含有豐富的生物活性成分，因此，自古以來，杜仲被列為名貴中藥和上品。但是，其野生資源正在日益稀竭，由于杜仲生長緩慢，一般需15年才能提供商品，而商品藥材的有效藥用成分含量極低、產(chǎn)量質(zhì)量都不穩(wěn)定。因此，研究出一種適用于培養(yǎng)杜仲細(xì)胞生產(chǎn)黃酮的培養(yǎng)基是必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)杜仲細(xì)胞生產(chǎn)黃酮的培養(yǎng)基及其制備方法。本發(fā)明提供的培養(yǎng)杜仲細(xì)胞生產(chǎn)黃酮的培養(yǎng)基，成分明確且價格較低，黃酮含量高，產(chǎn)量質(zhì)量穩(wěn)定，有利于日常應(yīng)用、廣泛推廣及產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種培養(yǎng)杜仲細(xì)胞生產(chǎn)黃酮的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：甘油30-50mg/L，煙酸0.05-0.1mg/L，碘化鉀2-4mg/L，氨基乙酸0.3-0.8mg/L，硫胺素3-7mg/L，活性炭0.02-0.1g/L，谷胱甘肽20-50μg/L，木犀草素40-80μg/L，胞嘧啶4-10mg/L和萘乙酸9-15mg/L。

一種培養(yǎng)杜仲細(xì)胞生產(chǎn)黃酮的培養(yǎng)基，優(yōu)選的方案是，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：甘油38mg/L，煙酸0.08mg/L，碘化鉀3mg/L，氨基乙酸0.6mg/L，硫胺素5mg/L，活性炭0.07g/L，谷胱甘肽42μg/L，木犀草素60μg/L，胞嘧啶8mg/和萘乙酸14mg/L。

優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基或White培養(yǎng)基。

另外，本發(fā)明還提供了培養(yǎng)杜仲細(xì)胞生產(chǎn)黃酮的培養(yǎng)基的制備方法，步驟如下：

S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入煙酸、谷胱甘肽和木犀草素，攪拌24-36分鐘，加入碘化鉀、氨基乙酸、硫胺素、活性炭、胞嘧啶和萘乙酸，繼續(xù)攪拌18-24分鐘，加入甘油，攪拌10分鐘，得混合物；

S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至5.6-6.0，滅菌溫度為115℃-122℃，滅菌時間為20-28分鐘，即得。

優(yōu)選地，所述步驟S1攪拌28分鐘。

優(yōu)選地，所述步驟S1繼續(xù)攪拌22分鐘。

優(yōu)選地，所述步驟S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至5.7。

優(yōu)選地，所述步驟S2滅菌溫度為118℃。

優(yōu)選地，所述步驟S2滅菌時間為25分鐘。

本發(fā)明所用主要原料的作用：

煙酸：煙酸也稱作維生素B3，或維生素PP，分子式：C₆H₅NO₂，耐熱，能升華。煙酸又名尼克酸、抗癩皮病因子。在人體內(nèi)還包括其衍生物煙酰胺或尼克酰胺。它是人體必需的13種維生素之一，是一種水溶性維生素，屬于維生素B族。煙酸在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為煙酰胺，煙酰胺是輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的組成部分，參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝，組織呼吸的氧化過程和糖類無氧分解的過程。

硫胺素：硫胺素又稱維生素B1、抗腳氣病因子、抗神經(jīng)炎因子等，是維生素中發(fā)現(xiàn)最早的一種。由嘧啶環(huán)和噻唑環(huán)結(jié)合而成的一種B族維生素。為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末；味苦，有引濕性，露置在空氣中，易吸收水分。在堿性溶液中容易分解變質(zhì)。在體內(nèi)，維生素B1以輔酶形式參與糖的分解代謝，有保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用；還能促進(jìn)腸胃蠕動，增加食欲。維生素B1缺乏時，可引起多種神經(jīng)炎癥，如腳氣病菌。維生素B1缺乏所引起的多發(fā)性神經(jīng)炎，患者的周圍神經(jīng)末梢有發(fā)炎和退化現(xiàn)象，并伴有四肢麻木、肌肉萎縮、心力衰竭、下肢水腫等癥狀。

活性炭：活性炭可以降低組織培養(yǎng)物的有害代謝物濃度，對細(xì)胞生長有利?；钚蕴繛槟咎糠鬯榻?jīng)加工形成的粉末結(jié)構(gòu)，它結(jié)構(gòu)疏松，孔隙大，吸水力強(qiáng)，有很強(qiáng)的吸附作用，它的顆粒大小決定著吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時產(chǎn)生的5-羥甲基糖醛及激素等。

谷胱甘肽：谷胱甘肽(分子式C₁₀H₁₇O₆N₃S)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結(jié)合，含有巰基的的三肽，具有抗氧化作用和解毒作用。谷胱甘肽在生命體內(nèi)的作用機(jī)理和四大生理功能：1、清除人體細(xì)胞內(nèi)的自由基，是細(xì)胞內(nèi)最主要的抗氧化劑。2、與人體內(nèi)的有毒物質(zhì)結(jié)合并排出體外，是人體內(nèi)重要的解毒劑。3、激活和保護(hù)免疫細(xì)胞，增強(qiáng)人體免疫功能，是重要的免疫增強(qiáng)劑。4、影響皮膚細(xì)胞酪氨酸酶活性、抑制黑色素生成，防止皮膚色斑的產(chǎn)生。

木犀草素：木犀草素是一種天然黃酮類化合物，存在于多種植物中?；瘜W(xué)名：3',4',5,7-四羥黃酮。CAS號：491-70-3，分子式：C₁₅H₁₀O₆，分子量：286.23。具有抗癌、抗菌、抗炎、祛痰、解痙、抗過敏和免疫增強(qiáng)等作用。

胞嘧啶：學(xué)名為2-羰基-4-氨基嘧啶，CAS號：71-30-7，分子式：C₄H₅N₃O。核酸(DNA和RNA)中的主要堿基組成成分之一。胞嘧啶可由二巰基脲嘧啶、濃氨水和氯乙酸為原料合成制得。胞嘧啶核苷、胞嘧啶核苷酸均可作為升高白細(xì)胞的藥物。

萘乙酸：CAS號：86-87-3，分子式：C₁₂H₁₀O₂，分子量：186.21。萘乙酸是促進(jìn)植物根系生長的植物生長調(diào)節(jié)劑，也是萘乙酰胺的中間體。萘乙酸用作植物生長調(diào)節(jié)劑，在醫(yī)藥上用作鼻眼凈和眼可明的原料。萘乙酸具有促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，誘導(dǎo)形成不定根，增加坐果，防止落果，改變雌、雄花比率等。萘乙酸可經(jīng)葉片、樹枝的嫩表皮、種子進(jìn)入到植物體內(nèi)，隨同營養(yǎng)流輸導(dǎo)到作用部位。通常用于小麥、水稻、棉花、茶、桑、番茄、蘋果、瓜類、馬鈴薯、林木等，是一種良好的植物生長刺激素。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)杜仲細(xì)胞生產(chǎn)黃酮的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，添加的添加劑包括甘油、煙酸、碘化鉀、氨基乙酸和木犀草素等。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的甘油，作為誘導(dǎo)物，能夠誘導(dǎo)杜仲細(xì)胞，來提高黃酮的產(chǎn)量。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的煙酸和硫胺素，能夠促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝，在杜仲細(xì)胞的代謝中起一定的作用。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的活性炭，能夠吸附杜仲生長中代謝的有毒物質(zhì)，但是，活性炭在吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)的同時，也能吸附生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其它培養(yǎng)基中的成分，發(fā)明人在使用活性炭時，考慮到活性炭的兩面性，經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)，得到合適的活性炭與培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的配比，使其都能更好的發(fā)揮作用。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的谷胱甘肽，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖，避免過氧化物對杜仲細(xì)胞的損害。發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用木犀草素，能夠與其它物質(zhì)協(xié)同作用，促進(jìn)細(xì)胞生長增殖。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的胞嘧啶，能夠調(diào)控細(xì)胞增殖與分化。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的萘乙酸，能夠促進(jìn)杜仲細(xì)胞的分裂與擴(kuò)大。本發(fā)明培養(yǎng)杜仲細(xì)胞生產(chǎn)黃酮的培養(yǎng)基搭配合理，各成分間協(xié)同作用，能夠促進(jìn)黃酮的合成。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的培養(yǎng)杜仲細(xì)胞生產(chǎn)黃酮的培養(yǎng)基具有以下優(yōu)勢：

(1)本發(fā)明提供的培養(yǎng)杜仲細(xì)胞生產(chǎn)黃酮的培養(yǎng)基，成分明確且價格較低，黃酮含量高，產(chǎn)量質(zhì)量穩(wěn)定，有利于日常應(yīng)用、廣泛推廣及產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)。

(2)采用此培養(yǎng)基培養(yǎng)杜仲細(xì)胞不占耕地、不破壞杜仲野生資源，保護(hù)了生態(tài)環(huán)境，解決了杜仲資源短缺的問題。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施方式的描述對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

本發(fā)明MS培養(yǎng)基可購自上海博耀生物科技有限公司；White培養(yǎng)基可購自青島海博生物技術(shù)有限公司；木犀草素可購自西安百川生物科技有限公司。

實(shí)施例1、一種培養(yǎng)杜仲細(xì)胞生產(chǎn)黃酮的培養(yǎng)基

所述培養(yǎng)杜仲細(xì)胞生產(chǎn)黃酮的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：甘油30mg/L，煙酸0.05mg/L，碘化鉀2mg/L，氨基乙酸0.3mg/L，硫胺素3mg/L，活性炭0.02g/L，谷胱甘肽20μg/L，木犀草素40μg/L，胞嘧啶4mg/L和萘乙酸9mg/L。

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。

制備方法：

S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入煙酸、谷胱甘肽和木犀草素，攪拌24分鐘，加入碘化鉀、氨基乙酸、硫胺素、活性炭、胞嘧啶和萘乙酸，繼續(xù)攪拌18分鐘，加入甘油，攪拌10分鐘，得混合物；

S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至5.6，滅菌溫度為115℃，滅菌時間為20分鐘，即得。

實(shí)施例2、一種培養(yǎng)杜仲細(xì)胞生產(chǎn)黃酮的培養(yǎng)基

所述培養(yǎng)杜仲細(xì)胞生產(chǎn)黃酮的培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：甘油50mg/L，煙酸0.1mg/L，碘化鉀4mg/L，氨基乙酸0.8mg/L，硫胺素7mg/L，活性炭0.1g/L，谷胱甘肽50μg/L，木犀草素80μg/L，胞嘧啶10mg/L和萘乙酸15mg/L。