本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說，涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-賴氨酸為堿性必需氨基酸，同時(shí)也是人體和動(dòng)物所不能合成的八種必需氨基酸中最重要的一種，故常稱為第一限制性氨基酸。人體必需通過日常飲食和補(bǔ)品獲得賴氨酸，但由于食物中賴氨酸含量甚低，且在加工過程中易被破壞，造成賴氨酸缺乏。
L-賴氨酸在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、畜牧飼料等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。在谷類為主的食品中添加一定量的L-賴氨酸，可提高其蛋白質(zhì)的吸收率和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；在飼料中添加L-賴氨酸能夠提高飼料的利用率；在醫(yī)藥工業(yè)上，L-賴氨酸一般被用作氨基酸輸液，可以作為治療鉛中毒的藥物、利尿的輔助治療劑、血栓預(yù)防劑。
賴氨酸多是通過微生物發(fā)酵來制備，具體方法為將賴氨酸發(fā)酵菌種接種至發(fā)酵罐中，并根據(jù)發(fā)酵罐發(fā)酵液的碳源和氮源的殘留量，添加碳源和氮源，以發(fā)酵產(chǎn)生賴氨酸。
經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，公開號(hào)為CN102533891A的中國(guó)專利申請(qǐng)公開了一種可提高終點(diǎn)賴氨酸含量、單罐供酸量和轉(zhuǎn)化率，即提高賴氨酸產(chǎn)能的方法，所述方法具體包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，在流加碳源和流加氮源的條件下，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)15小時(shí)后，向發(fā)酵液中流加營(yíng)養(yǎng)鹽，所述營(yíng)養(yǎng)鹽包括氯化鉀、硫酸鎂和硫酸錳。
公開號(hào)為CN101104863A的中國(guó)專利申請(qǐng)公開了一種賴氨酸發(fā)酵的方法，該方法包括如下步驟：將菌種從斜面試管到大種子瓶培養(yǎng)9-11小時(shí)后移到二級(jí)種子罐，種量為0.2-0.3％，培養(yǎng)溫度為38-40℃，培養(yǎng)15-17小時(shí)后移入三級(jí)種子罐，種量5-6％，培養(yǎng)9-11小時(shí)后移入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵罐接種后，連續(xù)流加糖、流加有機(jī)氮源，種量為14-18％。
但現(xiàn)有的賴氨酸制備方法得到的終點(diǎn)賴氨酸含量、總酸量和糖酸轉(zhuǎn)化率低，生產(chǎn)成本居高不下。因此，需要開發(fā)一種新型的賴氨酸的制備方法，以提高賴氨酸的發(fā)酵效率，降低賴氨酸的生產(chǎn)成本。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種L-賴氨酸的發(fā)酵方法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
本發(fā)明提供一種L-賴氨酸的發(fā)酵方法，包括以下步驟：將賴氨酸搖瓶種子接入賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)成熟后，再接入賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，待達(dá)到賴氨酸二級(jí)種子成熟標(biāo)準(zhǔn)后，接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基，在流加碳源和氮源的條件下，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)至發(fā)酵終點(diǎn)；所述賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基、賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基和賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源為硫酸銨，發(fā)酵培養(yǎng)過程中流加的氮源為硫酸銨溶液；所述賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基、賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基和賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中添加醋酸鹽。
作為優(yōu)選，本發(fā)明中的賴氨酸搖瓶種子選自產(chǎn)賴氨酸大腸桿菌搖瓶種子、產(chǎn)賴氨酸黃色短桿菌搖瓶種子、產(chǎn)賴氨酸谷氨酸棒桿菌搖瓶種子中的一種或幾種。
本發(fā)明的中的碳源選用現(xiàn)有技術(shù)中的所有碳源，例如木薯液化液、玉米液化液、葡萄糖溶液、蔗糖溶液、果糖溶液。優(yōu)選的，以葡萄糖溶液作為碳源。更優(yōu)選的，以質(zhì)量體積濃度為50-60％葡萄糖溶液作為碳源。
具體的，本發(fā)明所述的發(fā)酵方法包括以下步驟：
(1)將賴氨酸搖瓶種子接入賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基在一級(jí)種子罐中培養(yǎng)，一級(jí)種子罐中硫酸銨的初始濃度為8-12g/L，當(dāng)一級(jí)種子液中總糖濃度下降至8-15g/L時(shí)，停止培養(yǎng)，得成熟賴氨酸一級(jí)種子液；
(2)將成熟賴氨酸一級(jí)種子液接入賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基在二級(jí)種子罐中培養(yǎng)，二級(jí)種子罐中硫酸銨的初始濃度為10-15g/L，當(dāng)二級(jí)種子液中還原糖濃度下降至5-8g/L時(shí)，停止培養(yǎng)，得成熟賴氨酸二級(jí)種子液；
(3)將成熟賴氨酸二級(jí)種子液接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，在流加葡萄糖溶液和硫酸銨溶液的條件下，在發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵罐中的硫酸銨初始濃度為9-14g/L，培養(yǎng)40-44小時(shí)，得L-賴氨酸。
本發(fā)明根據(jù)發(fā)酵后期不產(chǎn)酸或者產(chǎn)酸較慢來判斷發(fā)酵終點(diǎn)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)38-42小時(shí)可以達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，優(yōu)選培養(yǎng)40小時(shí)。
進(jìn)一步地，步驟(3)中流加葡萄糖溶液和硫酸銨溶液的方法為：發(fā)酵培養(yǎng)過程中每2-4h取樣測(cè)發(fā)酵液的還原糖濃度和氨氮濃度，當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖濃度下降至4-8g/L時(shí)，開始流加質(zhì)量體積比為50-60％葡萄糖溶液并維持發(fā)酵液的還原糖濃度為4-8g/L，當(dāng)發(fā)酵液中的氨氮濃度下降為1-2g/L時(shí)，開始流加質(zhì)量體積比為40-45％硫酸銨溶液并維持發(fā)酵液中的氨氮濃度為1-2g/L。優(yōu)選的，流加質(zhì)量體積比為40％的硫酸銨溶液。
上述L-賴氨酸的發(fā)酵方法中，總糖濃度、還原糖濃度、氨氮濃度的測(cè)定為本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段，本發(fā)明對(duì)此不作限定。
更具體的，本發(fā)明的L-賴氨酸的發(fā)酵方法中，步驟(1)賴氨酸搖瓶種子的接種量為賴氨酸一級(jí)培養(yǎng)基體積的1-3‰，培養(yǎng)過程中控制溶氧30％-50％?？刹捎萌缦碌目刂剖侄危簻囟?5-37℃，罐壓0.05-0.07Mpa，通風(fēng)比1:0.4-1:0.6，攪拌300-350rpm，pH6.6-6.8。
對(duì)賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基的滅菌處理可采用本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段，本發(fā)明對(duì)此不作限定，例如可通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min。優(yōu)選的，為了防止在較低pH情況下培養(yǎng)基物料會(huì)產(chǎn)生沉淀或不利于發(fā)酵的反應(yīng)，在滅菌前用20％氫氧化鉀調(diào)pH值為6.0-6.4。
進(jìn)一步地，所述步驟(1)中賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基包括蔗糖20-40g/L，硫酸鎂0.5-1.5g/L，磷酸二氫鉀0.5-1.5g/L，硫酸銨8-12g/L，酵母浸粉5-10g/L，蘇氨酸0.4-0.6g/L，蛋氨酸0.4-0.6g/L，味精7-10g/L，丙酮酸鈉0.5-0.8g/L，醋酸鹽1-3g/L。優(yōu)選的，賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基包括蔗糖35g/L，硫酸鎂0.7g/L，磷酸二氫鉀0.7g/L，硫酸銨11g/L，酵母浸粉7g/L，蘇氨酸0.6g/L，蛋氨酸0.46g/L，味精7g/L，丙酮酸鈉0.5g/L，醋酸鈣1.5g/L。
所述步驟(2)中賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基包括葡萄糖60-80g/L，硫酸鎂0.5-1.5g/L，磷酸二氫鉀0.5-1.5g/L，硫酸銨10-15g/L，玉米漿水解液1-1.5g/L，毛發(fā)水解液1-1.5g/L，甜菜糖蜜10-15ml/L，蘇氨酸0.4-0.6g/L，蛋氨酸0.4-0.6g/L，醋酸鹽1-3g/L。優(yōu)選的，賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基包括賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基包括葡萄糖70g/L，硫酸鎂0.7g/L，磷酸二氫鉀0.7g/L，硫酸銨12g/L，玉米漿水解液1.3g/L，毛發(fā)水解液1.3g/L，甜菜糖蜜10ml/L，蘇氨酸0.5g/L，蛋氨酸0.5g/L，醋酸鈣1g/L。
所述步驟(3)中賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖20-40g/L，硫酸鎂0.5-1.5g/L，磷酸0.3-0.5ml/L，硫酸銨9-14g/L，玉米漿水解液0.5-1g/L，毛發(fā)水解液0.5-1g/L，甜菜糖蜜10-15ml/L，甜菜堿0.5-0.8g/L，醋酸鹽1-3g/L。優(yōu)選的，賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖30g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸0.3ml/L，硫酸銨11g/L，玉米漿水解液1g/L，毛發(fā)水解液1g/L，甜菜糖蜜10ml/L，甜菜堿0.6g/L，醋酸鈣1g/L。
在本發(fā)明的L-賴氨酸的發(fā)酵方法中，步驟(1)賴氨酸搖瓶種子的接種量為賴氨酸一級(jí)培養(yǎng)基體積的1-3‰，培養(yǎng)過程中控制溶氧30％-50％。步驟(2)成熟賴氨酸一級(jí)種子液的接種量為賴氨酸二級(jí)培養(yǎng)基體積的2-5％，培養(yǎng)過程中控制溶氧30％-50％。步驟(3)成熟賴氨酸二級(jí)種子液的接種量為賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10-15％，培養(yǎng)過程中控制溶氧25％-40％?？刂迫苎蹩刹捎萌缦碌目刂剖侄危簻囟?5-37℃，罐壓0.05-0.07Mpa，通風(fēng)比1:0.4-1:0.6，攪拌300-350rpm，pH6.6-6.8。
本發(fā)明的有益效果在于：
本發(fā)明通過在培養(yǎng)基中添加醋酸鈉進(jìn)行L-賴氨酸的發(fā)酵，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和賴氨酸的合成，顯著提高了終點(diǎn)賴氨酸含量、總酸量及糖酸轉(zhuǎn)化率，并顯著縮短了發(fā)酵周期。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
在下述實(shí)施例和對(duì)比例中：
OD值測(cè)定：將取樣的發(fā)酵液稀釋25倍，采用7230G可見分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)562nm可見光下測(cè)定吸光值。
按照GB/T5009.7-2008的方法測(cè)定還原糖的濃度。
按照GB3595-83的方法測(cè)定銨根離子的濃度。
按照GB10794-89標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定發(fā)酵液中的賴氨酸濃度(以賴氨酸鹽酸鹽計(jì))。
總酸量＝(放罐的賴氨酸濃度×放罐體積+中間排料的賴氨酸濃度×排料體積)
總耗糖量＝種子罐用糖重量+發(fā)酵罐用糖重量，其中發(fā)酵罐用糖重量包括，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的糖和發(fā)酵過程中流加的糖。
糖酸轉(zhuǎn)化率(％)＝總酸量/總耗糖量×100％。
實(shí)施例1
本實(shí)施例中L-賴氨酸的發(fā)酵方法包括賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)、賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)和賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)三個(gè)步驟。每個(gè)步驟的具體操作如下：
1、賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)
配制賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基。本實(shí)施例中賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基包括蔗糖20g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸銨9g/L，酵母浸粉5g/L，蘇氨酸0.5g/L，蛋氨酸0.5g/L，味精7g/L，丙酮酸鈉0.5g/L，醋酸鈣1g/L。
將配制好的賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基，用20％(體積比)氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值為6.0，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至36℃并維持恒定。開攪拌300rpm，按照通風(fēng)比1：0.4通入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓為0.05Mpa，并用氨水調(diào)節(jié)pH至6.7并維持恒定，校溶氧100％。
將產(chǎn)賴氨酸大腸桿菌搖瓶種子按賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基體積的1‰接到賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧30-50％，培養(yǎng)10h后，每隔2h取樣鏡檢并測(cè)總糖，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且總糖下降至10g/L時(shí)停止培養(yǎng)，得到賴氨酸成熟一級(jí)種子液。
2、賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)
配制賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基。本實(shí)施例中賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基包括葡萄糖70g/L，硫酸鎂1g/L，磷酸二氫鉀1g/L，硫酸銨10g/L，玉米漿水解液1g/L，毛發(fā)水解液1g/L，甜菜糖蜜10ml/L，蘇氨酸0.4g/L，蛋氨酸0.4g/L，醋酸鈣2g/L。
將配制好的賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基，用氨水調(diào)節(jié)其pH值為6.2，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至37℃并維持恒定。開攪拌300rpm，按照通風(fēng)比1：0.4通入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓為0.05Mpa，用氨水調(diào)節(jié)pH值為6.6并維持恒定，校溶氧100％。將步驟(1)得到的成熟賴氨酸一級(jí)種子液按賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基體積的2％接到賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧30-50％，培養(yǎng)10h后，每隔2h取樣鏡檢并測(cè)還原糖，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且還原糖下降至8g/L時(shí)停止培養(yǎng)，得到賴氨酸成熟二級(jí)種子液。
3、賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)
配制賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基。本實(shí)施例中賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖20g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸0.3/L，硫酸銨9g/L，玉米漿水解液0.5g/L，毛發(fā)水解液0.5g/L，甜菜糖蜜10ml/L，甜菜堿0.5g/L，醋酸鈣1g/L。
將配制好的賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基，用20％氫氧化鉀調(diào)節(jié)其pH指為5.6，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至36℃并維持恒定。開攪拌400rpm，按照通風(fēng)比1：0.3通入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓為0.07Mpa，用氨水調(diào)節(jié)pH值為6.7并維持恒定，校溶氧100％。將步驟(2)得到的成熟賴氨酸二級(jí)種子液按賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10％接到賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧25-40％。
培養(yǎng)過程中每2h取樣測(cè)發(fā)酵液的還原糖濃度和氨氮濃度，當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖濃度下降至4g/L時(shí)，開始流加60％(m/v)葡萄糖溶液并維持發(fā)酵液的還原糖濃度為4g/L左右，當(dāng)發(fā)酵液中的氨氮濃度下降至1g/L時(shí)，開始流加40％(m/v)硫酸銨溶液并維持發(fā)酵液中的氨氮濃度為1g/L左右。賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)40h放罐時(shí)，測(cè)放罐賴氨酸含量和中間排料的賴氨酸含量，計(jì)算總酸量、總糖量和糖酸轉(zhuǎn)化率見表1。
實(shí)施例2
本實(shí)施例中L-賴氨酸的發(fā)酵方法包括賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)、賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)和賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)三個(gè)步驟。每個(gè)步驟的具體操作如下：
1、賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)
配制賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基。本實(shí)施例中賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基包括蔗糖40g/L，硫酸鎂1.5g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸銨10g/L，酵母浸粉8g/L，蘇氨酸0.4g/L，蛋氨酸0.4g/L，味精9g/L，丙酮酸鈉0.6g/L，醋酸鈣3g/L。將配制好的賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基，用20％氫氧化鉀調(diào)pH6.0，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至37℃并維持恒定。開攪拌350rpm，按照通風(fēng)比1：0.5通入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓為0.05Mpa，并用氨水調(diào)節(jié)pH至6.7并維持恒定，校溶氧100％。
將產(chǎn)賴氨酸谷氨酸棒桿菌搖瓶種子按賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基體積的2‰接到賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧30-50％，培養(yǎng)10h后，每隔2h取樣鏡檢并測(cè)總糖，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且總糖下降至12g/L時(shí)停止培養(yǎng)，得到賴氨酸成熟一級(jí)種子液。
2、賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)
配制賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基。本實(shí)施例中賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基包括葡萄糖80g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，硫酸銨10g/L，玉米漿水解液1.2g/L，毛發(fā)水解液1.2g/L，甜菜糖蜜12ml/L，蘇氨酸0.5g/L，蛋氨酸0.5g/L，醋酸鈣1g/L。
將配制好的賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基，用氨水調(diào)pH至6.0，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至37℃并維持恒定。開攪拌350rpm，按照通風(fēng)比1：0.5通入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓為0.05Mpa，用氨水調(diào)節(jié)pH至6.7并維持恒定，校溶氧100％。將步驟(1)得到的成熟賴氨酸一級(jí)種子液按賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基體積的2％接到賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧30-50％，培養(yǎng)10h后，每隔2h取樣鏡檢并測(cè)還原糖，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且還原糖下降至5g/L時(shí)停止培養(yǎng)，得到賴氨酸成熟二級(jí)種子液。
3、賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)
配制賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基。本實(shí)施例中賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖20-40g/L，硫酸鎂0.5-1.5g/L，磷酸0.3-0.5ml/L，硫酸銨9-14g/L，玉米漿水解液0.5-1g/L，毛發(fā)水解液0.5-1g/L，甜菜糖蜜10-15ml/L，甜菜堿0.5-0.8g/L，醋酸鈣1-3g/L。將配制好的賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基，用20％氫氧化鉀調(diào)pH至5.6，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至37℃并維持恒定。開攪拌400rpm，按照通風(fēng)比1：0.4通入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓為0.08Mpa，用氨水調(diào)節(jié)pH至6.7并維持恒定，校溶氧100％。將步驟(2)得到的成熟賴氨酸二級(jí)種子液按賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10％接到賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧25-40％，培養(yǎng)過程中每4h取樣測(cè)發(fā)酵液的還原糖濃度和氨氮濃度，當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖濃度下降至6g/L時(shí)，開始流加60％(m/v)葡萄糖溶液并維持發(fā)酵液的還原糖濃度為6g/L左右，當(dāng)發(fā)酵液中的氨氮濃度下降至1.5g/L時(shí)，開始流加40％(m/v)硫酸銨溶液并維持發(fā)酵液中的氨氮濃度為1.5g/L左右。賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)39.5h放罐時(shí)，測(cè)放罐賴氨酸含量和中間排料的賴氨酸含量，計(jì)算總酸量、總糖量和糖酸轉(zhuǎn)化率見表1。
實(shí)施例3
本實(shí)施例中L-賴氨酸的發(fā)酵方法包括賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)、賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)和賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)三個(gè)步驟。每個(gè)步驟的具體操作如下：
1、賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)
配制賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基。本實(shí)施例中賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基包括蔗糖35g/L，硫酸鎂0.7g/L，磷酸二氫鉀0.7g/L，硫酸銨11g/L，酵母浸粉7g/L，蘇氨酸0.6g/L，蛋氨酸0.46g/L，味精7g/L，丙酮酸鈉0.5g/L，醋酸鈉1.5g/L。
將配制好的賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基，用20％氫氧化鉀調(diào)pH6.3，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至37℃并維持恒定。開攪拌300rpm，按照通風(fēng)比1:0.6通入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓為0.06Mpa，并用氨水調(diào)節(jié)pH至6.7并維持恒定，校溶氧100％。
將產(chǎn)賴氨酸黃色短桿菌搖瓶種子按賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基體積的2‰接到賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧30-50％，培養(yǎng)10h后，每隔2h取樣鏡檢并測(cè)總糖，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且總糖下降至9g/L時(shí)停止培養(yǎng)，得到賴氨酸成熟一級(jí)種子液。
2、賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)
配制賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基。本實(shí)施例中賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基包括葡萄糖60g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，硫酸銨11g/L，玉米漿水解液1.3g/L，毛發(fā)水解液1.3g/L，甜菜糖蜜11ml/L，蘇氨酸0.4g/L，蛋氨酸0.4g/L，醋酸鈉1g/L。
將配制好的賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基，用氨水調(diào)pH至6.4，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至37℃并維持恒定。開攪拌300rpm，按照通風(fēng)比1:0.4入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓為0.06Mpa，用氨水調(diào)節(jié)pH至6.7并維持恒定，校溶氧100％。將步驟(1)得到的成熟賴氨酸一級(jí)種子液按賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基體積的2％接到賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧30-50％，培養(yǎng)10h后，每隔2h取樣鏡檢并測(cè)還原糖，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且還原糖下降至6g/L時(shí)停止培養(yǎng)，得到賴氨酸成熟二級(jí)種子液。
3、賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)
配制賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基。本實(shí)施例中賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖30g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸0.3ml/L，硫酸銨11g/L，玉米漿水解液1g/L，毛發(fā)水解液1g/L，甜菜糖蜜10ml/L，甜菜堿0.6g/L，醋酸鈉1g/L。將配制好的賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基用20％氫氧化鉀調(diào)pH至6.0，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至37℃并維持恒定。開攪拌350rpm，按照通風(fēng)比1：0.4通入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓為0.08Mpa，用氨水調(diào)節(jié)pH至6.7并維持恒定，校溶氧100％。將步驟(2)得到的成熟賴氨酸二級(jí)種子液按賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基體積的15％接到賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧25-40％。
培養(yǎng)過程中每2h取樣測(cè)發(fā)酵液的還原糖濃度和氨氮濃度，當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖濃度下降至8g/L時(shí)，開始流加60％(m/v)葡萄糖溶液并維持發(fā)酵液的還原糖濃度為8g/L左右，當(dāng)發(fā)酵液中的氨氮濃度下降至2g/L時(shí)，開始流加40％(m/v)硫酸銨溶液并維持發(fā)酵液中的氨氮濃度為2g/L左右。賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)40.6h放罐時(shí)，測(cè)放罐賴氨酸含量和中間排料的賴氨酸含量，計(jì)算總酸量、總糖量和糖酸轉(zhuǎn)化率見表1。
實(shí)施例4
本實(shí)施例中L-賴氨酸的發(fā)酵方法包括賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)、賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)和賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)三個(gè)步驟。每個(gè)步驟的具體操作如下：
1、賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)
配制賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基。本實(shí)施例中賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基包括蔗糖20g/L，硫酸鎂0.6g/L，磷酸二氫鉀0.6g/L，硫酸銨8g/L，酵母浸粉9g/L，蘇氨酸0.45g/L，蛋氨酸0.45g/L，味精7.5g/L，丙酮酸鈉0.7g/L，醋酸鈉1g/L。
將配制好的賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基，用20％氫氧化鉀調(diào)pH6.1，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至37℃并維持恒定。開攪拌320rpm，按照通風(fēng)比1:0.44通入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓為0.05Mpa，并用氨水調(diào)節(jié)pH至6.7并維持恒定，校溶氧100％。將產(chǎn)賴氨酸大腸桿菌搖瓶種子按賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基體積的1.2‰接到賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧30-50％，培養(yǎng)10h后，每隔2h取樣鏡檢并測(cè)總糖，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且總糖下降至10g/L時(shí)停止培養(yǎng)，得到賴氨酸成熟一級(jí)種子液。
2、賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)
配制賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基。本實(shí)施例中賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基包括葡萄糖60g/L，硫酸鎂0.58g/L，磷酸二氫鉀0.8g/L，硫酸銨11g/L，玉米漿水解液1g/L，毛發(fā)水解液1g/L，甜菜糖蜜13ml/L，蘇氨酸0.4g/L，蛋氨酸0.4g/L，醋酸鈉1g/L。
將配制好的賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基，滅菌前用氨水調(diào)pH至6.1，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至37℃并維持恒定。開攪拌350rpm，按照通風(fēng)比1:0.4入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓為0.05Mpa，用氨水調(diào)節(jié)pH至6.7并維持恒定，校溶氧100％。將步驟(1)得到的成熟賴氨酸一級(jí)種子液按賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基體積的2％接到賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧30-50％，培養(yǎng)10h后，每隔2h取樣鏡檢并測(cè)還原糖，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且還原糖下降至5g/L時(shí)停止培養(yǎng)，得到賴氨酸成熟二級(jí)種子液。
3、賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)
配制賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基。本實(shí)施例中賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖25g/L，硫酸鎂0.55g/L，磷酸0.34ml/L，硫酸銨9g/L，玉米漿水解液0.5g/L，毛發(fā)水解液0.5g/L，甜菜糖蜜10-ml/L，甜菜堿0.7g/L，醋酸鈉1g/L。
將配制好的賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基，用20％氫氧化鉀調(diào)pH至5.6，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至37℃并維持恒定。開攪450rpm，按照通風(fēng)比1：0.4通入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓為0.08Mpa，用氨水調(diào)節(jié)pH至6.7并維持恒定，校溶氧100％。將步驟(2)得到的成熟賴氨酸二級(jí)種子液按賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基體積的14％接到賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧25-40％。
培養(yǎng)過程中每3h取樣測(cè)發(fā)酵液的還原糖濃度和氨氮濃度，當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖濃度下降至8g/L時(shí)，開始流加50％(m/v)葡萄糖溶液并維持發(fā)酵液的還原糖濃度為6g/L左右，當(dāng)發(fā)酵液中的氨氮濃度下降至2g/L時(shí)，開始流加40％(m/v)硫酸銨溶液并維持發(fā)酵液中的氨氮濃度為1g/L左右。賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)40.3h放罐時(shí)，測(cè)放罐賴氨酸含量和中間排料的賴氨酸含量，計(jì)算總酸量、總糖量和糖酸轉(zhuǎn)化率見表1。
實(shí)施例5
本實(shí)施例中L-賴氨酸的發(fā)酵方法包括賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)、賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)和賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)三個(gè)步驟。每個(gè)步驟的具體操作如下：
1、賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)
配制賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基。本實(shí)施例中賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基包括蔗糖20g/L，硫酸鎂0.6g/L，磷酸二氫鉀0.6g/L，硫酸銨8.5g/L，酵母浸粉6g/L，蘇氨酸0.55g/L，蛋氨酸0.55g/L，味精7g/L，丙酮酸鈉0.55g/L，醋酸鈣1g/L。
將配制好的賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基，用20％氫氧化鉀調(diào)pH6.0，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至37℃并維持恒定。開攪拌300rpm，按照通風(fēng)比1:0.48通入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓為0.05Mpa，并用氨水調(diào)節(jié)pH至6.7并維持恒定，校溶氧100％。將產(chǎn)賴氨酸大腸桿菌搖瓶種子按賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基體積的1‰接到賴氨酸一級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧30-50％，培養(yǎng)10h后，每隔2h取樣鏡檢并測(cè)總糖，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且總糖下降至8g/L時(shí)停止培養(yǎng)，得到賴氨酸成熟一級(jí)種子液。
2、賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)
配制賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基。本實(shí)施例中賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基包括葡萄糖80g/L，硫酸鎂1.5g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸銨15g/L，玉米漿水解液1.5g/L，毛發(fā)水解液1.5g/L，甜菜糖蜜15ml/L，蘇氨酸0.6g/L，蛋氨酸0.6g/L，醋酸鈣3g/L。
將配制好的賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基，用氨水調(diào)pH至6.0，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至37℃并維持恒定。開攪拌350rpm，按照通風(fēng)比1:0.4入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓為0.05Mpa，用氨水調(diào)節(jié)pH至6.7并維持恒定，校溶氧100％。將步驟(1)得到的成熟賴氨酸一級(jí)種子液按賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基體積的4％接到賴氨酸二級(jí)種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧30-50％，培養(yǎng)10h后，每隔2h取樣鏡檢并測(cè)還原糖，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且還原糖下降至8g/L時(shí)停止培養(yǎng)，得到賴氨酸成熟二級(jí)種子液。
3、賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)
配制賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基。本實(shí)施例中賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖40g/L，硫酸鎂1.5g/L，磷酸0.5ml/L，硫酸銨14g/L，玉米漿水解液1g/L，毛發(fā)水解液1g/L，甜菜糖蜜15ml/L，甜菜堿0.8g/L，醋酸鈣3g/L。
將配制好的賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基，用20％氫氧化鉀調(diào)pH至6.0，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至37℃并維持恒定。開攪拌450rpm，按照通風(fēng)比1：0.4通入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓0.08Mpa，用氨水調(diào)節(jié)pH至6.7并維持恒定，校溶氧100％。將步驟(2)得到的成熟賴氨酸二級(jí)種子液按賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基體積的15％接到賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧25-40％。
培養(yǎng)過程中每2h取樣測(cè)發(fā)酵液的還原糖濃度和氨氮濃度，當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖濃度下降至7g/L時(shí)，開始流加60％(m/v)葡萄糖溶液并維持發(fā)酵液的還原糖濃度為7g/L左右，當(dāng)發(fā)酵液中的氨氮濃度下降至2g/L時(shí)，開始流加40％(m/v)硫酸銨溶液并維持發(fā)酵液中的氨氮濃度為2g/L左右。賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)39h放罐時(shí)，測(cè)放罐賴氨酸含量和中間排料的賴氨酸含量，計(jì)算總酸量、總糖量和糖酸轉(zhuǎn)化率見表1。
對(duì)比例1
按照實(shí)施例1的方法制備賴氨酸，不同的是，賴氨酸種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)基中均不添加醋酸鹽。賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)42h放罐時(shí)，測(cè)放罐賴氨酸含量和中間排料的賴氨酸含量，計(jì)算總酸量、總糖量和糖酸轉(zhuǎn)化率見表1。
表1發(fā)酵終點(diǎn)的總酸量、總糖量、糖酸轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵周期
從表1可以看出，采用本發(fā)明方法發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸，能夠顯著提高終點(diǎn)賴氨酸含量、總酸量和糖酸轉(zhuǎn)化率，同時(shí)減少發(fā)酵周期。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。