本發(fā)明涉及植物DNA指紋圖譜技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蔓越桔的一種DNA指紋圖譜及其獲取方法與專用引物。

背景技術(shù)：

蔓越桔(Vacciniium macrocarpon)是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium spp.)植物，喜強酸性的濕潤土壤，抗寒能力強，集中分布在美國馬薩諸塞和新澤西州。蔓越桔是具有很高經(jīng)濟回報率的小漿果，近年來被加工成果汁、果干和果醬等多種產(chǎn)品，供全世界幾百萬人享用，并且還具有特殊的醫(yī)療價值。醫(yī)學調(diào)查表明，蔓越桔制劑成為預防尿道感染的首選保健藥物。目前關(guān)于蔓越桔保健功能的研究國外主要集中在抗感染、抗氧化、抗腫瘤等方面。蔓越桔是一種生長在矮藤上、小而圓、表皮富于彈性的鮮紅果子，也有人稱它為小紅莓。蔓越桔需要特殊的環(huán)境及氣候條件栽培，全球的蔓越桔產(chǎn)區(qū)較少，產(chǎn)量有限，又因其具有多種保健功能，從而具有“北美紅寶石”之美稱。蔓越桔與葡萄、藍莓并稱為北美三大水果，對大多數(shù)中國人而言尚且陌生，不過，在學術(shù)界卻早已盛名在外。蔓越桔一直就是北美地區(qū)的一種傳統(tǒng)健康食品，近20年來，一系列科學研究證實了蔓越桔的各種保健作用。

目前，我國對于蔓越桔的研究還處于初級研究階段，剛剛起步，但在蔓越桔產(chǎn)業(yè)發(fā)展方面已經(jīng)呈現(xiàn)良好的勢頭，有越來越多的企業(yè)家開始投資蔓越桔產(chǎn)業(yè)，也有更多的國內(nèi)科研人員開始注重蔓越桔各方面的研究。據(jù)統(tǒng)計，迄今，我國從北美和加拿大地區(qū)引進蔓越桔品種有9個(大連大學育種基地-大連森茂現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司種質(zhì)資源圃保存)，由于目前我國還沒有系統(tǒng)完善的鑒定方法，致使出現(xiàn)同種多名或同名多種現(xiàn)象，品種混亂問題給蔓越桔產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來很大的經(jīng)濟損失。雖然蔓越桔的鑒定可以基于傳統(tǒng)的形態(tài)學特征，但這些性狀易受環(huán)境因素的影響，所以對其進行形態(tài)學鑒定和分類相當困難。因此，如何快速準確鑒別蔓越桔品種種質(zhì)資源,已成為當前蔓越桔生產(chǎn)及科研中急需解決的問題。

與形態(tài)標記相比，分子標記是建立在基因組基礎(chǔ)之上，其能對各發(fā)育時期的生物個體、組織、器官甚至細胞進行檢測，不受基因表達的影響，具有操作簡便、數(shù)量豐富及多態(tài)性高等特點。實踐證明，分子標記可對種質(zhì)資源進行準確、科學的鑒定和評價，為育種工作者提供直接、可靠的依據(jù)。為了充分有效地利用蔓越桔的種質(zhì)資源，需要建立高效的蔓越桔分子標記技術(shù)體系并利用其對蔓越桔種質(zhì)資源進行鑒定和評價。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供蔓越桔的一種DNA指紋圖譜及其獲取方法與其專用引物，更充分地、有效地利用蔓越桔豐富的種質(zhì)資源。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供技術(shù)方案如下：

一種獲取蔓越桔DNA指紋圖譜的專用引物，專用引物序列為：

CA112-F-Joe：TCGTCGGCAGCGTCAGATTCCACCCACTTCACAGTTCA，如序列表SEQNO：1所示；

CA112-R：GTTTATTGGGAGGGAATTGGAAAC，如序列表SEQ NO：2所示；

linna-Joe：AGCAGCCGTCGCAGTCTA，如序列表SEQ NO：3所示。

一種獲取蔓越桔DNA指紋圖譜的方法，包括如下步驟：

步驟A：提取蔓越桔的基因組DNA；

步驟B：以步驟A的基因組DNA為模板，采用權(quán)利要求1所述的專用引物進行SSR-PCR擴增；

步驟C：對步驟B中得到的SSR-PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將擴增成功的PCR產(chǎn)物利用毛細管電泳技術(shù)(CE)進行分離，即將PCR產(chǎn)物稀釋10倍，取1ul，加入甲酰胺，內(nèi)標Liz500，利用ABI3730xI全自動基因分析儀進行分析；

步驟D：將ABI3730xI的結(jié)果導入Genemarker V2.2.0軟件進行分析，記錄各樣品的條帶大小情況，并獲得相應(yīng)的峰圖，即構(gòu)建蔓越桔的DNA指紋圖譜。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，步驟B中，所述SSR-PCR擴增程序為：包括95℃預變性5min，95℃變性30s，54℃退火15s，72℃延伸30s，其中，變性、退火和延伸三個步驟循環(huán)35次，72℃最后一步延伸15min，4℃保存。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，步驟B中，所述SSR-PCR的擴增體系為20μl，包括：2×Phanta buffer 10μl，10uM dNTP 0.4μl，Phanta max super-fidelity DNA polymerase，專用引物CA112-F-Joe 0.3μl，專用引物CA112-R 1.2μl，linna-Joe 1μl，20ng/μl的DNA模板1μl，ddH₂O補足。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述蔓越桔的基因組DNA來自蔓越桔植株的幼嫩葉片。

一種獲取蔓越桔DNA指紋圖譜的試劑盒，所述試劑盒包括專用引物、Phanta buffer、dNTP、Phanta max super-fidelity DNA polymerase以及marker，其中專用引物序列見序列表的序列SEQ NO：1～3。

本發(fā)明的專用引物可以應(yīng)用于獲取蔓越桔DNA指紋圖譜。

利用所述的方法得到的蔓越桔DNA指紋圖譜也屬于本發(fā)明的保護范圍。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：獲得的蔓越桔DNA指紋圖譜多態(tài)性高、指紋豐富、重復性好，在提高蔓越桔選擇育種的準確性和效率，縮短育種周期，以及蔓越桔的分子標記輔助育種中發(fā)揮重要作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明應(yīng)用所述專用引物SEQ NO：1～3獲得的蔓越桔品種C1的DNA指紋圖譜。

圖2為本發(fā)明應(yīng)用所述專用引物SEQ NO：1～3獲得的蔓越桔品種C2的DNA指紋圖譜。

圖3為本發(fā)明應(yīng)用所述專用引物SEQ NO：1～3獲得的蔓越桔品種C3的DNA指紋圖譜。

圖4為本發(fā)明應(yīng)用所述專用引物SEQ NO：1～3獲得的蔓越桔品種C4的DNA指紋圖譜。

圖5為本發(fā)明應(yīng)用所述專用引物SEQ NO：1～3獲得的蔓越桔品種C5的DNA指紋圖譜。

圖6為本發(fā)明應(yīng)用所述專用引物SEQ NO：1～3獲得的蔓越桔品種C6的DNA指紋圖譜。

圖7為本發(fā)明應(yīng)用所述專用引物SEQ NO：1～3獲得的蔓越桔品種C7的DNA指紋圖譜。

圖8為本發(fā)明應(yīng)用所述專用引物SEQ NO：1～3獲得的蔓越桔品種C8的DNA指紋圖譜。

圖9為本發(fā)明應(yīng)用所述專用引物SEQ NO：1～3獲得的蔓越桔品種C9的DNA指紋圖譜。

圖10為本發(fā)明具體實施方式中的9個蔓越桔品種的聚類樹狀圖。

具體實施方式

結(jié)合具體實施方式和說明書附圖對本發(fā)明做進一步說明。

供試材料為蔓越桔的9個品種，即C1：半藍(Benlear)；C2：早黑(Early Black)；C3：朝圣者(Pilgrim)；C4：克勞利(Crowley)；C5：史蒂文(Stevens)；C6：博蔓(Bergman)；C7：奧斯通(Austoncross Black)；C8：森特維爾(Centre Ville)；C9：豪斯(Howes)，這些材料均來自于大連大學藍莓科研育種基地大連森茂現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司。

一、利用專用引物獲取蔓越桔的DNA指紋圖譜

操作流程：提取蔓越桔基因組→擴增→瓊脂糖凝膠電泳→分離擴增成功的SSR-PCR產(chǎn)物→利用ABI3730xI全自動基因分析儀進行分析→將ABI3730xI的結(jié)果導入Genemarker V2.2.0軟件進行統(tǒng)計→統(tǒng)計條帶大小→獲得蔓越桔DNA指紋圖譜。

具體方法和過程如下：

1.采用試劑盒(新型植物基因組DNA提取試劑盒DP320-03)提取蔓越桔的基因組DNA

1)處理材料：

取植物新鮮組織100mg或干重組織20mg，加入液氮充分研磨，加入400μl緩沖液LP1和6μl RNase A(10mg/ml)，漩渦振蕩1min，室溫放置10min。

2)加入130緩沖液LP2，充分混勻，漩渦振蕩1min。

3)12000rpm(～13400*g)離心5min，將上清移至新的離心管中。

4)加入4.5倍體積的緩沖液LP3(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，立即充分振蕩混勻15sec，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。

5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13400*g)離心30sec，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中。

6)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)12000rpm(～13400*g)離心30sec，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中。

注意：如果吸附柱膜呈現(xiàn)綠色，向吸附柱CB3中加入500μl無水乙醇，12000rpm(～13400*g)離心30sec，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中。

7)重復操作步驟6。

8)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(～13400*g)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

注意：這一步驟的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、PCR等)實驗。

9)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12000rpm(～13400*g)離心2min，將溶液收集到離心管中。

注意：為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2min，12000rpm(～13400*g)離心2min。洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μl，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用ddH₂O做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)。pH值低于7.0會降低洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。

2.SSR-PCR擴增

1)以步驟1中得到的蔓越桔樣本的基因組DNA為模板，分別采用專用引物SEQ NO：1～3進行SSR-PCR擴增。

2)所述專用引物的序列為：

①CA112-F-Joe：TCGTCGGCAGCGTCAGATTCCACCCACTTCACAGTTCA；如SEQ IDNo：1所示。(5,端利用FAM標記)

②CA112-R：GTTTATTGGGAGGGAATTGGAAAC；如SEQ ID No：2所示。

③linna-Joe：AGCAGCCGTCGCAGTCTA；如SEQ ID No：3所示。

3)PCR擴增的程序為：包括95℃預變性5min，95℃變性30s，54℃退火15s，72℃延伸30s，其中，變性、退火和延伸三個步驟循環(huán)35次，72℃最后一步延伸15min，4℃保存。

4)PCR擴增體系為：20μl，包括：2×Phanta buffer 10μl，10uM dNTP 0.4μl，Phanta maxsuper-fidelity DNA polymerase，專用引物CA112-F-Joe 0.3μl，專用引物CA112-R 1.2μl，linna-Joe 1μl，20ng/μl的DNA模板1μl，ddH₂O補足。

3.SSR-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測與分離擴增

1)對步驟中2得到的SSR-PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分離。擴增結(jié)束后，擴增產(chǎn)物中加入4μl電泳上樣緩沖液(6×Loading Buffer)混勻，取6μl混合樣品在2％瓊脂糖凝膠中電泳，電泳緩沖液為1×TAE，電泳條件為的120V的電壓下電泳1h。

2)將擴增成功的PCR產(chǎn)物利用毛細管電泳技術(shù)(CE)進行分離，即將PCR產(chǎn)物稀釋10倍，取1ul，加入甲酰胺，內(nèi)標Liz500，利用ABI3730xI全自動基因分析儀進行分析。

4.條帶讀取與結(jié)果分析

將ABI3730xI的結(jié)果導入Genemarker V2.2.0軟件進行分析，記錄各樣品的條帶大小情況，并獲得相應(yīng)的峰圖，即構(gòu)建了蔓越桔的DNA指紋圖譜，具體結(jié)果如圖1～圖9和表1所示。

表1蔓越桔9個品種的SSR-PCR產(chǎn)物條帶大小統(tǒng)計情況

二、蔓越桔DNA指紋圖譜的應(yīng)用

對步驟一獲得的蔓越桔指紋圖譜進行聚類分析，得到聚類樹狀圖，如圖10所示，可以看出，在遺傳距離的閾值約為0.62時，可將份蔓越桔品種分成兩大組：第一大組包括C1～C8，共8個蔓越桔品種；第二大組只包括C9，1個品種。在遺傳距離的閾值約為0.73時，可將第一大組分成兩個小組。在遺傳距離的閡值約為0.77時，又可進一步劃分。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 大連大學

<120> 蔓越桔的一種DNA指紋圖譜及其獲取方法與專用引物

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tcgtcggcag cgtcagattc cacccacttc acagttca 38

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gtttattggg agggaattgg aaac 24

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

agcagccgtc gcagtcta 18