本發(fā)明涉及分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，進(jìn)一步涉及篩查MPN相關(guān)基因突變的檢測試劑盒及其醫(yī)學(xué)解讀數(shù)據(jù)庫，具體涉及一種檢測MPN相關(guān)基因群的檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：骨髓增殖性腫瘤(MPN)，是一類骨髓增生過多細(xì)胞而形成的疾病。此類疾病與骨髓增生異常綜合征或急性骨髓性白血病有關(guān)或產(chǎn)生，而骨髓增生性疾病在與其他疾病相比有更良好預(yù)后。骨髓增殖性腫瘤是一種少見病，發(fā)生率0.02-2.8/10萬人，最常見于60-70歲，診斷時年輕病例約20％。發(fā)病沒有特點(diǎn)，一半患者診斷時無癥狀。其屬于惰性腫瘤，WHO嚴(yán)格定義的ET生存期接近正常人，ET15年生存率80％，10年轉(zhuǎn)化AML或MF風(fēng)險(xiǎn)小于1％，PV10年預(yù)計(jì)生存率大于75％，白血病轉(zhuǎn)化與纖維化進(jìn)展，分別小于5％和10％。主要并發(fā)癥為血管事件(血栓形成和血管異常)目前檢測MPN的方法主要涉及細(xì)胞形態(tài)、流式細(xì)胞學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)。其中分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法主要有巢式PCR、一代測序等。PCR方法不能直觀的得到具體的突變序列，而一代測序的方法受到測序通量的影響，無法一次性檢測多個基因的全部外顯子區(qū)域。而二代測序作為一種高通量的檢測方法，可以一次性準(zhǔn)確測量多個基因的外顯子序列，使精準(zhǔn)治療成為可能。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種檢測MPN相關(guān)基因群的檢測試劑盒，以解決現(xiàn)有技術(shù)中MPN的診斷方法較為局限，缺乏從分子生物學(xué)的角度診斷MPN的依據(jù)。本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的MPN的診斷方法準(zhǔn)確性較低。為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種檢測MPN相關(guān)基因群的檢測試劑盒，該試劑盒包括以下17個基因：JAK2，CALR，CBL，TP53，SETBP1，NRAS，SF3B1，DNMT3A，ASXL1，TET2，PTPN11，KRAS，SRSF2，KIT，NPM1，MPL，F(xiàn)LT3。上述17個基因由28個熱點(diǎn)突變組成，其突變位點(diǎn)為本領(lǐng)域常規(guī)的突變位點(diǎn)，較佳地包括了indel突變位點(diǎn)(插入或缺失引起的序列改變insertionordeletion，indel)、無義突變位點(diǎn)、拼接區(qū)突變位點(diǎn)或錯義突變位點(diǎn)，更佳地本發(fā)明所述的17個基因外顯子區(qū)域的熱點(diǎn)突變?nèi)绫?所示。表1熱點(diǎn)突變列表突變基因突變位點(diǎn)突變基因突變位點(diǎn)突變基因突變位點(diǎn)JAK2p.V617FSETBP1p.D868NASXL1p.Y591XCALRp.L367fsSETBP1p.G870SPTPN11p.A72TCALRp.K385fsNRASp.Q61RKRASp.A146TCBLp.H398QNRASp.G12DSRSF2p.95_103delCBLp.F418LSF3B1p.L747WKITp.D816VCBLp.R420QSF3B1p.N626HNPM1p.W288fsTP53R248WDNMT3Ap.R882HMPLp.W515KTP53p.Y220CDNMT3Ap.R882CFLT3ITDTP53p.V173MTET2p.N1266STP53p.P151STET2p.P1962S本發(fā)明所述的17個基因外顯子區(qū)域的熱點(diǎn)突變可用于對MPN做出輔助診斷，本領(lǐng)域MPN常規(guī)的診斷方法有形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和流式細(xì)胞學(xué)，本發(fā)明所述方法較佳地從分子生物學(xué)角度對MPN做出診斷。本發(fā)明提供一組檢測本發(fā)明所述MPN相關(guān)基因外顯子區(qū)域的多重PCR引物，所述引物的擴(kuò)增范圍包括17個與MPN相關(guān)基因的外顯子區(qū)域，擴(kuò)增得到的單個片段長度為250bp左右。利用本發(fā)明提供的多重PCR引物，結(jié)合二代測序技術(shù)，能夠檢測本發(fā)明所述突變基因群中的全部外顯子區(qū)域。其中所述的二代測序試劑為本領(lǐng)域常規(guī)使用的試劑，只要能夠滿足對所得序列進(jìn)行二代測序的要求即可。所述試劑制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，較佳地為市售可得。本發(fā)明所述檢測試劑盒更佳地還包括將檢測對象中提取的基因組DNA制成可供測序使用的文庫的試劑，該種試劑為本領(lǐng)域常規(guī)使用試劑，只要能夠滿足多重PCR對基因組DNA質(zhì)量的要求即可。所述試劑制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，較佳地為市售可得。本發(fā)明所述檢測試劑盒較佳地還包括：dNTP溶液，DNA聚合酶，用于分離或純化核酸的是Backman磁珠。本發(fā)明所述的樣本為檢測對象的組織，只要能從檢測樣本中抽提檢測對象的基因組DNA即可。所述檢測樣本較佳地為骨髓、血液、實(shí)體瘤樣本中的一種或幾種，優(yōu)選地為骨髓樣本。一種本發(fā)明所述試劑盒的使用方法，其包括以下步驟：(1)利用本發(fā)明所述檢測試劑盒抽提檢測對象的骨髓，提取基因組DNA；(2)用多重PCR引物對基因組DNA中發(fā)明中所述17個MPN相關(guān)基因的外顯子區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增；(3)將步驟(2)中擴(kuò)增所得的片段制成可供IonTorrent測序平臺測序的文庫；(4)對步驟(3)中所得DNA文庫進(jìn)行測序，得到下機(jī)數(shù)據(jù)；(5)對(4)中的下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，而后利用醫(yī)學(xué)解讀數(shù)據(jù)庫進(jìn)行解讀做出診斷即可。以上各個步驟的具體操作方法詳見試劑盒說明書。本發(fā)明所用的試劑和原料均市售可得。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：利用本發(fā)明提供的可用于篩查MPN相關(guān)基因突變的基因群，結(jié)合高通量測序技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)在形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞學(xué)之外對MPN進(jìn)行輔助診斷，特別是對于疾病預(yù)后做出評估和針對相關(guān)靶藥的作用效果做出預(yù)判具有特殊的優(yōu)勢。本發(fā)明提供的用于篩查MPN相關(guān)基因突變的基因群的檢測試劑盒具有檢測效率高、檢出率高等優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施方式以下將對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實(shí)施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。材料和方法：在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院和協(xié)和華美醫(yī)學(xué)診斷中心2015年8月至2016年7月診斷的患者中，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)，我們進(jìn)行連續(xù)性入組(63名)。入選標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞學(xué)診斷為骨髓增殖性腫瘤(MPN)的患者。63名患者的診斷結(jié)果如表2所示：表2患者診斷結(jié)果列表收集3mL患者骨髓提取基因組DNA待測，該檢測經(jīng)過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。樣本處理：樣本中基因組利用天根DNA提取試劑盒(貨號：DP318-03)進(jìn)行抽提，具體操作方法參見試劑盒的使用說明書。用多重PCR引物對基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作方法參見Life公司試劑盒的使用說明書。文庫的構(gòu)建：對擴(kuò)增得到的DNA片段使用Life公司生產(chǎn)的IonTorrent平臺建庫試劑盒進(jìn)行測序文庫的構(gòu)建，實(shí)驗(yàn)操作方法參見Life公司試劑盒的使用說明書。高通量測序：將構(gòu)建好的測序文庫經(jīng)油包水處理后在IonTorrent平臺上進(jìn)行高通量測序，油包水處理方法和高通量測序方法請參考高通量測序儀IonTorrent以及其配套設(shè)備OneTouch的使用說明書。生物信息學(xué)分析：首先，使用IonReport軟件(v4.6,ThermoFisher,Carlsbad,CA,USA)過濾低質(zhì)量的測序片段，并將合格的測序片段比對到人類參考基因組hg19(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html)，使用TorrentVariantCaller(v4.6.0.7)子程序檢測突變位點(diǎn)，軟件參數(shù)使用的是默認(rèn)的設(shè)置。此軟件已經(jīng)被優(yōu)化用于處理IonTorrent測序平臺特有的錯誤類型。最后對找出的突變包括SNP和Indel使用ANNOVAR(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)軟件進(jìn)行注釋，注釋內(nèi)容包括突變在基因組中的位置，關(guān)聯(lián)的基因，基因外顯子編號，核苷酸水平變異，對應(yīng)的蛋白水平變異，該突變在dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，1000Genomes數(shù)據(jù)庫(http://www.1000genomes.org/)和癌癥突變數(shù)據(jù)庫COSMIC(http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)中的注釋，PolyPhen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和SIFT(http://sift.jcvi.org/)功能預(yù)測結(jié)果等。進(jìn)一步使用一下原則篩選致病突變位點(diǎn)：(1)根據(jù)突變所在的基因組位置和類型，過濾掉對蛋白產(chǎn)物序列不產(chǎn)生影響的突變；(2)利用1000Genomes數(shù)據(jù)，注釋每個突變在人群中的比例，如果比例小于等于1％則不認(rèn)為是多態(tài)性位點(diǎn)；(3)檢索癌癥數(shù)據(jù)庫COSMIC，查詢一個突變在COSMIC中是否有記載，其出現(xiàn)在血液系統(tǒng)腫瘤中；(4)利用蛋白質(zhì)功能預(yù)測軟件PolyPhen-2預(yù)測該突變是否影響蛋白功能；(5)如果經(jīng)過(2)(3)(4)后，一個突變滿足“非多態(tài)性”、“在血液系統(tǒng)腫瘤中記載過”和“影響蛋白功能”這三條中至少兩條的，將被判為與疾病可能相關(guān)。最后，如果一個突變雖然不滿足(5)但是在COSMIC中記錄為在腫瘤中檢測到過，則被判讀為意義不明的突變。最后如果一個突變在文獻(xiàn)中被明確記載未與疾病高度相關(guān)，則直接判為熱點(diǎn)突變。統(tǒng)計(jì)分析：統(tǒng)計(jì)每個基因攜帶致病突變的比例，篩選出突變率最高的基因，使用的軟件為Excel。醫(yī)學(xué)解讀：用醫(yī)學(xué)解讀數(shù)據(jù)庫對生物信息學(xué)分析得出的基因突變型做出分子病理診斷。所用的醫(yī)學(xué)解讀數(shù)據(jù)庫如下：(1)目前已知JAK2exon12/14突變檢測有助于MPN診斷，V617F突變可見于90-95％的PV患者以及50-60％的ET和PMF患者。JAK2蛋白是與細(xì)胞因子受體信號通路相關(guān)的非受體型酪氨酸激酶，參與細(xì)胞的生長，發(fā)育，分化。ruxolitinib為JAK2抑制劑，能夠改善MPN患者脾大等癥狀。(PMID：24740812)(2)CALR基因突變多見于ET以及骨髓纖維化的MPN患者，已知CALR-Exon9突變檢測有助于MPN診斷。有研究表明CALR突變的患者白血病轉(zhuǎn)化和血栓形成的可能性較低，因而是預(yù)后較好的指標(biāo)。(PMID：27376361)(3)CBL是一個腫瘤抑制基因，該基因突變在AML,MDS,MPN患者中均有報(bào)道。有報(bào)道表明CBL基因突變的AML患者的總生存率較好(PMID：23783394)。(4)TP53基因突變主要見于MDS,AML,CLL等血液系統(tǒng)疾病以及實(shí)體瘤。TP53基因突變的MDS患者生存率降低且大多預(yù)后不良。作用于TP53及其通路相關(guān)的藥物有Cisplatin，F(xiàn)luorouracil，Docetaxel，Paclitaxel，Aspirin。(PMID：21714648)(5)SETBP1基因編碼蛋白參與DNA復(fù)制的調(diào)控。SETBP1體細(xì)胞突變與髓系白血病轉(zhuǎn)化相關(guān)，在MDS和CMML中預(yù)后不良。(PMID：23832012)(6)NRAS基因突變主要見于AML,CML,ALL,MPN等血液系統(tǒng)疾病以及實(shí)體瘤。RAS蛋白NRAS主要參與RAS信號通路。在AML中，如果患者同時攜帶NRAS,DNMT3A和NPM1突變，則提示預(yù)后良好。RAS突變尚不足以成為AML中的獨(dú)立預(yù)后因素。但是最近的研究提示，對于攜帶RAS突變的AML患者，在緩解后使用高劑量的阿糖胞苷進(jìn)行鞏固治療可能是有益的。(PMID：26376137)(7)SF3B1基因突變主要見于CLL,MDS以及MPN患者，在CLL患者中預(yù)后不良。在MDS中，SF3B1突變最常見的亞型為難治性貧血伴環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞增多(RARS)，且總體生存率提高。(PMID：21995386)(8)DNMT3A基因突變主要見于AML，尤其是正常核型的AML，亦可見于其他血液疾病，或者正常的老年人(發(fā)生在正常人中，一般負(fù)荷較低，且獨(dú)立突變)。DNMT3A作為一個表觀遺傳相關(guān)的基因，一般發(fā)生在前白血病階段，其突變負(fù)荷一般較高。DNMT3A基因主要突變形式為點(diǎn)突變，多常見于R882位的氨基酸，最常見的突變形式為R882H。DNMT3A基因突變患者大多預(yù)后不良。DNMT3A突變患者使用高劑量的柔紅霉素可能獲益，對DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱有良好反應(yīng)。(PMID：25426837；26755712；22417203；19776405)(9)TET2基因突變主要見于AML患者，在CML,MDS,MPN及淋巴瘤患者中亦存在，目前TET2基因突變在CMML中是預(yù)后較好的指標(biāo)，而在MDS/MPN、繼發(fā)性AML中預(yù)后不良。(10)ASXL1基因突變在AML,CML,MDS,MPN患者中均有報(bào)道，與AML患者總體生存率降低相關(guān)(PMID:22417203)。(11)PTPN11基因突變主要見于CML,AML,ALL和MPN患者。PTPN11是蛋白酪氨酸磷酸酶，在細(xì)胞生長、分化、有絲分裂周期和致癌轉(zhuǎn)化中均有重要作用。Dodecane-Trimethylamine可以靶定PTPN11(在研中)。(12)KRAS突變可見于MDS,AML,MPN,MM等血液系統(tǒng)疾病以及實(shí)體瘤。RAS蛋白KRAS主要參與RAS信號通路。KRAS突變不會誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和遷移能力的改變，但會增強(qiáng)ERK、PDK1和AKT的磷酸化。RAS突變尚不足以成為AML中的獨(dú)立預(yù)后因素。但是最近的研究提示，對于攜帶RAS突變的AML患者，在緩解后使用高劑量的阿糖胞苷進(jìn)行鞏固治療可能是有益的。(13)SRSF2突變主要見于MDS,t-AML以及CML等疾病，SRSF2突變的MDS患者總體生存率降低，向AML轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)提高。(PMID：22389253)(14)KIT突變主要見于AML，KIT突變被認(rèn)為發(fā)生在MDS的進(jìn)展期，KIT基因編碼的酪氨酸激酶受體在造血細(xì)胞的生長和增殖中有重要作用。KITExon17/8突變的AML患者大多預(yù)后不良，對于核型為t(8；21)的患者，KIT突變預(yù)后亦不良。imatinib為KIT激酶的靶向抑制劑，可用于治療攜帶KIT激活突變的患者。(PMID：26376137)(15)NPM1突變主要見于AML，尤其是正常核型的AML。NPM1突變多為Exon12的移碼突變，以A型突變最為常見。NPM1單獨(dú)突變提示患者預(yù)后良好；當(dāng)合并其它預(yù)后不良基因突變時(如FLT3、DNMT3A)，患者預(yù)后不良；文獻(xiàn)報(bào)道對于超過65歲的老年AML患者，NPM1突變不再提示預(yù)后良好。NPM1突變還可用于微小殘留疾病的監(jiān)測。NPM1突變的患者使用大劑量柔紅霉素治療可能獲益。(PMID：26755712；22417203；26376137；25713434)(16)MPLW515L突變可見于9％的JAK2突變陰性的MF患者。血小板受體MPL是一個原癌蛋白，參與血小板生成有關(guān)的信號通路。MPLexon10突變有助于MPN的診斷。(PMID：16834459)(17)FLT3基因突變主要見于AML，尤其是正常核型的AML。FLT3基因突變最常見的形式為FLT3-ITD以及FLT3-TKD(比如D835Y)突變。FLT3基因突變提示預(yù)后不良，且可獨(dú)立于核型之外。目前Sunitinib是FLT3最常用的靶向藥物。另文獻(xiàn)報(bào)道，高劑量的柔紅霉素對于FLT3-ITD突變的AML患者可能有益。(PMID：26755712；27268085)使用本發(fā)明試劑盒檢測結(jié)果：63名患者所檢測出17個基因的陽性率如下表3所示：表317個基因陽性率列表經(jīng)統(tǒng)計(jì)后表明：(根據(jù)上述表格進(jìn)行總結(jié))由此可見，使用二代測序的方法對骨髓增殖性腫瘤進(jìn)行輔助診斷，具有診斷準(zhǔn)確、獲得信息量大的特點(diǎn)。以上對本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3