本發(fā)明涉及一種在有機(jī)相中酶催化合成硫辛酸甾醇酯的方法，屬于食品、醫(yī)藥和化妝品等
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：植物甾醇是一類來(lái)源豐富并且具有多種生理功能的天然產(chǎn)物，屬于甾體類化合物，分子C-3位連有一個(gè)羥基，C-17位連著一個(gè)9-10個(gè)碳原子組成的疏水側(cè)鏈。植物甾醇是一類重要的食品功能因子，具有很多重要的生理功能，如有效預(yù)防心血管疾病、抗氧化衰老、抗癌、消炎等多種重要的生理功能。植物甾醇獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)決定了其水不溶性和低油溶性，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。此外，人體內(nèi)對(duì)游離植物甾醇的吸收率僅為3％，攝入過(guò)多的植物甾醇會(huì)出現(xiàn)新的病癥，即高植物甾醇血癥，所以如何提高植物甾醇的溶解度和生物利用率是首要問(wèn)題。在不影響植物甾醇生理功能的前提下對(duì)其進(jìn)行改性，提高其生物利用度成為研究的熱點(diǎn)。甾醇酯化后稱為甾醇酯，是植物甾醇衍生物中研究最多的一類，相比于植物甾醇，化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化并不影響其生理功能，有的還有一定的增強(qiáng)作用。近年來(lái)有不少文獻(xiàn)報(bào)道以改善甾醇的溶解度為目的對(duì)植物甾醇進(jìn)行改性研究，如將甾醇與月桂酸、谷氨酸等進(jìn)行酯化或者制備微膠囊等。但這些方法大多存在能耗高，步驟繁瑣，安全性未知等問(wèn)題，使其實(shí)際應(yīng)用受到了限制。因此，若能選擇一些可安全應(yīng)用于食品領(lǐng)域的功能性物質(zhì)與植物甾醇進(jìn)行溫和的一步反應(yīng)，不但可以改善各自理化性質(zhì)上的缺陷，提高其生物利用度，而且又可保留各自的功能或者發(fā)生協(xié)同作用，從而實(shí)現(xiàn)改性增效提質(zhì)。硫辛酸是一種抗氧化能力非常強(qiáng)的天然抗氧化劑，并且在多種代謝過(guò)程中起重要作用，因此在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域得到了廣泛的研究和應(yīng)用，如作為治療糖尿病的藥物、抗氧化保健食品等。甾醇與硫辛酸酯化后產(chǎn)生的硫辛酸甾醇酯經(jīng)人體吸收分解后理論上可以同時(shí)發(fā)揮這兩種物質(zhì)的功能。目前還鮮有關(guān)于硫辛酸植物甾醇酯的相關(guān)報(bào)道，只有SamanthiR.P.Madawala等人在2012年報(bào)道過(guò)硫辛酸甾醇酯的化學(xué)制備方法，具體方法為：將1g的甾醇溶解于9mL二氯甲烷和64mg的DMAP后，在通入氮?dú)獾那闆r下，于0℃下攪拌加入580mg的硫辛酸和468mg的EDCI，然后在室溫下攪拌反應(yīng)一夜，最終得到的產(chǎn)率為60％。該方法最后以正己烷為溶劑，使用固相萃取柱來(lái)進(jìn)行分離純化，并且通過(guò)DPPH·自由基清除實(shí)驗(yàn)證明了合成的硫辛酸甾醇酯具有一定的抗氧化性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為改善植物甾醇的理化性質(zhì)、功效和提高生物利用度而提供一種酶法制備、純化硫辛酸甾醇酯的方法。本方法反應(yīng)條件溫和、步驟簡(jiǎn)單、所得產(chǎn)物純度和收率高，可安全應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)。本發(fā)明提供的制備方法，是一種在有機(jī)相中酶催化合成硫辛酸甾醇酯，是在恒溫振蕩的條件下，在有機(jī)相中，以植物甾醇、硫辛酸為底物，用脂肪酶作為催化劑合成硫辛酸甾醇酯；所述有機(jī)相是以體積比1：1混合的正己烷、丙酮，或者以體積比1：1混合的叔戊醇、正己烷；所述脂肪酶為Novozyme435或CandidaRugosa；所述植物甾醇的初始濃度為100～200mmol/L，脂肪酶添加量為60～80g/L，酸醇摩爾比為(2～3)：1；反應(yīng)溫度為50℃～60℃，反應(yīng)時(shí)間為72～120h。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述植物甾醇的初始濃度為100～150mmol/L。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述植物甾醇的初始濃度為150mmol/L。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所用的脂肪酶添加量為60g/L。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，酸醇摩爾比為2.5：1在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所用的反應(yīng)濃度為55℃。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，反應(yīng)體系中還添加了0～20g/L的分子篩；分子篩的種類為3A或4A。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所用脂肪酶為CandidaRugosa。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所用的分子篩添加量為10g/L，分子篩的種類為4A。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所用的反應(yīng)時(shí)間為96h。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，在按體積比1：1混合的正己烷與叔戊醇的混合溶液中，添加60g/L的CandidaRugosa，分子篩濃度為10g/L，甾醇初始濃度150mmol/L，酸醇摩爾比為2.5：1，于55℃、150rpm條件下反應(yīng)96h。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，還包括對(duì)產(chǎn)物的分離純化，先去除酶和分子篩，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑后，用薄層色譜的展開劑溶解溶質(zhì)，再經(jīng)硅膠柱層析后，通過(guò)薄層色譜檢測(cè)，收集不同段的組分，即可得到純化的硫辛酸甾醇酯；所述硅膠柱層析流動(dòng)相為按體積比15：1混合的石油醚∶乙酸乙酯；所述薄層色譜檢測(cè)的展開劑為按體積比15：1混合的石油醚∶乙酸乙酯。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，還包括利用高效液相法(HPLC)測(cè)定純度和產(chǎn)率，紅外光譜(FT-IR)和質(zhì)譜(MS)鑒定結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明合成了硫辛酸甾醇酯，改善了甾醇的溶解度，提高了甾醇的生物利用度，并有益于成為一種具有功能性的抗氧化劑。(2)采用本發(fā)明在有機(jī)溶劑中利用脂肪酶催化制備硫辛酸甾醇酯的方法，可以大大提高酯的轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率超過(guò)71.2％，純度均達(dá)到99.3％以上。(3)本發(fā)明方法使用的酶法生產(chǎn)反應(yīng)條件溫和、步驟簡(jiǎn)單、所得產(chǎn)物純度和收率高等特點(diǎn)，無(wú)需官能團(tuán)保護(hù)，只需一步反應(yīng)，選用的原料、催化劑和溶劑也都可安全應(yīng)用于食品中，對(duì)環(huán)境友好，產(chǎn)品安全性高。附圖說(shuō)明圖1為硫辛酸植物甾醇酯的結(jié)構(gòu)式。圖2為硫辛酸豆甾醇酯的HPLC圖譜。圖3為硫辛酸豆甾醇酯的紅外光譜圖。圖4為硫辛酸豆甾醇酯的質(zhì)譜圖。具體實(shí)施方式產(chǎn)物的鑒定方法：采用傅里葉變換紅外光譜和質(zhì)譜鑒定硫辛酸甾醇酯的結(jié)構(gòu)。FT-IR分析采用ThermoScientificNicoletiS10傅里葉變換紅外光譜儀，選用KBr壓片法，掃描次數(shù)：32次，分辨率：4cm-1。質(zhì)譜分析采用WatersUPLC-TQD質(zhì)譜儀，將分離純化的樣品經(jīng)0.22μm微孔濾膜后進(jìn)樣，離子源為電噴霧(ESI)離子源，毛細(xì)管電壓3.5kV，脫溶劑溫度250℃，脫溶劑氣流速500L/h，錐孔氣流速50L/h，錐孔電壓20V，碰撞能量6V，檢測(cè)器電壓1700V，質(zhì)量范圍50～1000m/z。酯化率和產(chǎn)物純度的計(jì)算方法：本發(fā)明采用HPLC測(cè)定硫辛酸植物甾醇酯的純度和產(chǎn)率，HPLC-ELSD分析系統(tǒng)包括Waters1525高效液相色譜儀、Alltech3300蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)和Empower數(shù)據(jù)處理軟件。色譜柱為WaterssymmetryC18反相柱(4.6×250mm，5μm)，柱溫：45℃，流動(dòng)相∶100％甲醇，流速：1mL/min，等速洗脫，進(jìn)樣量：10μL；ELSD參數(shù)：溫度為55℃，載氣為氮?dú)猓魉贋?.5L/min，增益為1。具體酯化率的計(jì)算方法為：將分離純化的硫辛酸甾醇酯分別配制一系列不同濃度的溶液，利用HPLC測(cè)定各峰面積，根據(jù)樣品峰面積的對(duì)數(shù)值與濃度的對(duì)數(shù)值的線性關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程為lgA＝1.41lgC+6.77。將酯化后的反應(yīng)液進(jìn)樣后，再根據(jù)峰面積計(jì)算出反應(yīng)液中硫辛酸植物甾醇酯的濃度，再根據(jù)下列公式即可算出酯化率。XPSE(％)＝CPSE/CPS×100，式中XPSE為硫辛酸甾醇酯的酯化率，CPSE為硫辛酸甾醇酯的濃度(mol/L)，CPS為反應(yīng)開始植物甾醇的濃度(mol/L)。硫辛酸甾醇酯的純度(％)＝硫辛酸甾醇酯的峰面積/所有樣品的總峰面積×100實(shí)施例1反應(yīng)溶劑和酶的種類對(duì)合成硫辛酸甾醇酯的影響分別在叔丁醇、叔戊醇、正己烷、丙酮/正己烷(體積比為1:1)、正己烷/叔丁醇(體積比為1:1)和叔戊醇/正己烷(體積比為1:1)中，分別添加20g/L的Novozyme435(10000PLU/g，購(gòu)自北京高瑞森科技有限公司)、LipasefromCandidaRugosa(847U/mg，購(gòu)自Sigma)、LipozymeTLIM(250IUN/g，購(gòu)自北京高瑞森科技有限公司)、LipozymeRMIM(275IUN/g，購(gòu)自北京高瑞森科技有限公司)，40g/L的4A分子篩、50mmol/L的植物甾醇，酸醇摩爾比為1.5：1，于45℃、150rpm條件下反應(yīng)72h。酯化率如下表1所示：表1反應(yīng)溶劑和酶的種類對(duì)合成硫辛酸甾醇酯的影響實(shí)施例2植物甾醇初始濃度對(duì)合成硫辛酸甾醇酯的影響在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，選用有機(jī)相為正己烷/叔戊醇，酶為CandidaRugosa，再分別將植物甾醇的初始濃度調(diào)整為25mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L和200mmol/L，結(jié)果表明當(dāng)甾醇濃度為150mmol/L時(shí)，酯化率最高。不同植物甾醇濃度條件下的酯化率如下表2所示：表2植物甾醇初始濃度對(duì)合成硫辛酸甾醇酯的影響甾醇初始濃度(mmol/L)酯化率(％)255.6506.81008.615010.22007.8實(shí)施例3酸醇摩爾比對(duì)合成硫辛酸甾醇酯的影響在實(shí)施例2的基礎(chǔ)上，選用甾醇濃度為150mmol/L，再分別將硫辛酸和植物甾醇的摩爾比調(diào)整為1：1.5、1：1、1.5：1、2：1、2.5：1、3：1和3.5：1。一開始隨著酸醇摩爾比的增加，轉(zhuǎn)化率不斷升高，但當(dāng)酸醇摩爾比大于2.5：1時(shí)，產(chǎn)率略有下降。不同酸醇摩爾比條件下的酯化率如下表3所示：表3酸醇摩爾比對(duì)合成硫辛酸甾醇酯的影響酸醇摩爾比酯化率(％)1:1.58.31:15.61.5:19.72:113.12.5:116.13:111.3實(shí)施例4分子篩種類和添加量對(duì)合成硫辛酸甾醇酯的影響在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，選用酸醇摩爾比為2.5：1，再分別將3A和4A型的分子篩濃度分別調(diào)整為0g/L、10g/L、20g/L、30g/L和40g/L。添加3A型分子篩的樣品酯化率要明顯低于添加4A型分子篩的樣品，且當(dāng)4A型分子篩濃度為10g/L時(shí)，產(chǎn)率最高，隨著分子篩添加量的增加，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率逐漸降低。不同分子篩添加量條件下的酯化率如下表4所示：表4分子篩種類和添加量對(duì)合成硫辛酸甾醇酯的影響實(shí)施例5脂肪酶添加量對(duì)合成硫辛酸甾醇酯的影響在實(shí)施例4的基礎(chǔ)上，選用分子篩添加量為10g/L，再將脂肪酶添加量分別調(diào)整為20g/L、40g/L、60g/L和80g/L。結(jié)果表明，脂肪酶添加量越多，轉(zhuǎn)化率越高，當(dāng)添加量大于60g/L時(shí)，產(chǎn)率趨于穩(wěn)定。不同酶添加量條件下的酯化率如下表5所示：表5脂肪酶添加量對(duì)合成硫辛酸甾醇酯的影響實(shí)施例6反應(yīng)溫度對(duì)合成硫辛酸甾醇酯的影響在實(shí)施例5的基礎(chǔ)上，選用脂肪酶添加量為60g/L，再將反應(yīng)溫度分別調(diào)整為40℃、45℃、50℃、55℃和60℃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)55℃時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。不同反應(yīng)溫度條件下的酯化率如下表6所示：表6反應(yīng)溫度對(duì)合成硫辛酸甾醇酯的影響反應(yīng)溫度(℃)酯化率(％)4041.84546.75051.45556.26050.3實(shí)施例7反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成硫辛酸甾醇酯的影響在實(shí)施例6的基礎(chǔ)上，選用反應(yīng)溫度為55℃，再將反應(yīng)時(shí)間分別調(diào)整為24h、48h、72h、96h和120h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)達(dá)到96h時(shí)，反應(yīng)逐漸趨于平衡。不同反應(yīng)時(shí)間條件下的酯化率如下表7所示：表7反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成硫辛酸甾醇酯的影響反應(yīng)時(shí)間(h)酯化率(％)2421.64842.57255.69671.212068.9實(shí)施例8在按體積比1：1混合的正己烷與叔戊醇的混合溶液中，添加60g/L的CandidaRugosa，10g/L的分子篩、150mmol/L的植物甾醇，酸醇摩爾比為2.5：1，于55℃、150rpm條件下反應(yīng)96h。待反應(yīng)結(jié)束，先去除酶和分子篩，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑后，用薄層色譜的展開劑(石油醚∶乙酸乙酯＝體積比15：1)溶解溶質(zhì)，再經(jīng)硅膠柱層析后(流動(dòng)相條件為石油醚∶乙酸乙酯＝體積比15：1)，通過(guò)薄層檢測(cè)，收集不同段的組分，即可得到純化的硫辛酸植物甾醇酯。在此條件下，產(chǎn)品得率為71.2％，純度為99.3％。硫辛酸甾醇酯的紅外光譜如圖2所示，分析如下：2949cm-1為-CH3的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收(νas-CH3)，2866cm-1為-CH2-的對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收(νs-CH2-)，1732cm-1強(qiáng)吸收峰為酯基官能團(tuán)上C＝O的伸縮振動(dòng)吸收(νC＝O)，1462cm-1為-CH2的彎曲振動(dòng)吸收峰，1366cm-1為-CH3的彎曲振動(dòng)吸收(ν-CH3)，1173cm-1和1131cm-1為C-O的伸縮振動(dòng)吸收(νC-O)。硫辛酸甾醇酯的質(zhì)譜圖譜如圖4所示，分析如下：豆甾醇的相對(duì)分子質(zhì)量為412.69，硫辛酸的相對(duì)分子質(zhì)量為206.32，因此硫辛酸甾醇酯的相對(duì)分子質(zhì)量為601。硫辛酸豆甾醇酯在ES+電離下，可能存在硫辛酸甾醇酯的[M+H]+和[M+Na]+的分子離子峰，圖3中601.4為硫辛酸豆甾醇酯的質(zhì)譜信號(hào)，624.4為硫辛酸豆甾醇酯的[M+Na]+的質(zhì)譜信號(hào)。因此，產(chǎn)物為硫辛酸豆甾醇酯。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3