本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微藻藻種長(zhǎng)期保藏方法。

背景技術(shù)：
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微藻種類(lèi)繁多，是世界上生物量最大、最古老的一類(lèi)生物(比三葉蟲(chóng)還早)；微藻的光合利用效率較高，地球每年固定的生物質(zhì)中有40％來(lái)源于微藻；同時(shí)，微藻的存在決定著生命起始至今地球的大氣成分與變化。

微藻因其生長(zhǎng)周期短、生長(zhǎng)速率快、光合作用效率高、可生產(chǎn)豐富多樣的生物質(zhì)(特別是具有生物活性的高附加值產(chǎn)品)、不與糧食生產(chǎn)競(jìng)爭(zhēng)資源、環(huán)境效益顯著(可回收廢水廢氣中的碳氮硫元素)等優(yōu)勢(shì)，成為了全球新型生物質(zhì)能源領(lǐng)域的研究前沿和熱點(diǎn)。

地球上已知的微藻種類(lèi)超過(guò)40,000種，它們的種間甚至株系間的生長(zhǎng)特性、含有的生物質(zhì)種類(lèi)及含量和在環(huán)境中的功能差異很大。藻類(lèi)的生境類(lèi)型廣闊多樣，可在淡水、海水、咸水、半咸水、高鹽度水及土壤等環(huán)境中生存。許多微藻細(xì)胞內(nèi)含有30％～50％DW的脂類(lèi)，有的甚至高達(dá)80％DW，其中綠藻門(mén)和硅藻門(mén)種類(lèi)較多；一些門(mén)類(lèi)的微藻可以積累一定量的高附加值生物活性物質(zhì)，如雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是天然蝦青素的理想來(lái)源(最高可達(dá)干重的8％)；鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)在逆境條件下可大量積累具有抗氧化活性的β-胡蘿卜素；紫球藻含有抗腫瘤活性的紫球藻多糖；波氏藻富含人體的必需脂肪酸二十碳五烯酸(腦黃金)等。因此，不論是基于生態(tài)環(huán)境(物種多樣性)保護(hù)，還是藻類(lèi)生物質(zhì)的生產(chǎn)，藻株的選育工作具有重要意義，藻種的保藏十分關(guān)鍵。微藻藻種的保藏方法應(yīng)該要具備：(1)操作簡(jiǎn)單、快速，工作量適宜；(2)培養(yǎng)條件穩(wěn)定、清潔，不易污染(可抵抗環(huán)境中細(xì)菌、雜藻、真菌)和變異；(3)細(xì)胞易于復(fù)蘇；(4)保藏工作節(jié)能環(huán)保，成本低廉；(5)方便運(yùn)輸，運(yùn)輸條件常規(guī)不苛刻。

目前微藻藻種保藏方法存在的問(wèn)題主要包括：1)微藻繁殖生長(zhǎng)快速，生物量大，用常規(guī)的液體培養(yǎng)基或是固體瓊脂平板涂布保藏，為了保證藻種的特性，需要1-2個(gè)月進(jìn)行一次傳代工作。傳代操作的前期準(zhǔn)備工作繁雜，工作量大，耗時(shí)耗力；2)利用液體培養(yǎng)基保藏微藻藻種極易污染細(xì)菌和真菌，影響微藻的生長(zhǎng)，也明顯影響微藻生理機(jī)制的研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)，長(zhǎng)期液體培養(yǎng)的藻種不進(jìn)行定期活化，容易發(fā)生性狀變異；3)目前，采用固體培養(yǎng)基保藏藻種的方法借鑒于菌類(lèi)保藏的方法，例如添加一些保護(hù)劑與藻種混合，然后經(jīng)過(guò)超低溫真空排水，安瓿管低溫環(huán)境保存。這種保藏方法，由于微藻與菌類(lèi)有很大的區(qū)別，其生命活動(dòng)類(lèi)似于高等植物，所以低溫會(huì)造成細(xì)胞的凍傷，易出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷或功能喪失等現(xiàn)象，藻種復(fù)蘇極其困難，甚至不能復(fù)蘇；4)采用低溫保藏的方法耗能大，保存條件苛刻；5)藻種運(yùn)輸不夠便捷，在運(yùn)輸過(guò)程中，藻種樣品易損壞，且運(yùn)輸條件有特殊要求。

目前已公開(kāi)的與微藻藻種保藏相關(guān)的專(zhuān)利主要包括：

1)一種有利于長(zhǎng)期儲(chǔ)存雨生紅球藻藻種的固態(tài)培養(yǎng)基及其制備方法(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺篊N201610369738.4)，該發(fā)明公開(kāi)了一種有利于長(zhǎng)期儲(chǔ)存雨生紅球藻藻種的固態(tài)培養(yǎng)基，按照申請(qǐng)人提供的新配方以及制備方法，解決現(xiàn)有配方抑制雨生紅球藻繁殖，生長(zhǎng)因子不夠或過(guò)量，易污染細(xì)菌等弊端，達(dá)到延長(zhǎng)雨生紅球藻藻種保存時(shí)間的效果。

2)微藻藻種的保藏方法(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺篊N201610333908.3)，本發(fā)明涉及一種微藻藻種的保藏方法。該方法將微藻培養(yǎng)到穩(wěn)定生長(zhǎng)階段后，微藻的藻液與保存液按照1:1等體積比例混合，將混合液保存在溫度20℃、光照強(qiáng)度20μE/mol/s、光照時(shí)間4小時(shí)/天的條件下，方法提供的保護(hù)液包括了氮鹽、磷鹽、鐵鹽、EDTA-Na₂、NaHCO₃、Gly、甘油、VB₁₀、VB₁₂、抗生素、和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。

3)一種保藏微藻藻種的方法(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺篊N201010222005.0)，本發(fā)明公開(kāi)了一種保藏微藻藻種的方法，其方法為將所要保藏藻種收集獲得藻泥，然后將藻泥與保護(hù)劑混合制成藻種細(xì)胞懸液，上述藻種細(xì)胞懸液經(jīng)過(guò)程序預(yù)凍過(guò)程，最終完全凍結(jié)。凍結(jié)后的藻種細(xì)胞懸液在減壓的條件下使水分升華，形成固形海綿體狀物質(zhì)保藏即可。保護(hù)劑為脫脂乳和維生素的復(fù)合保護(hù)劑，以重量計(jì)脫脂乳的含量為5％～20％，維生素0.5％～2％。

通過(guò)對(duì)現(xiàn)有的微藻藻種保藏方法進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的微藻藻種保藏方法，多數(shù)為藻類(lèi)常規(guī)保藏方法(各方法沒(méi)有明顯差異及有意義的關(guān)鍵技術(shù))或是借鑒菌類(lèi)保藏的方法，這些方法并沒(méi)有在保持微藻細(xì)胞活性的條件下減少傳代的工作量，特別是對(duì)于擁有種類(lèi)數(shù)量龐大的藻種種質(zhì)資源庫(kù)，難以進(jìn)行推廣應(yīng)用；同時(shí)這些方法，耗能大，易污染，易凍傷微藻細(xì)胞，難以復(fù)蘇及維持馴化后的生長(zhǎng)和遺傳特性；運(yùn)輸不便捷，易損壞，且有的還需要特殊的環(huán)境條件；這些方法中有一些還僅提供為專(zhuān)一藻種所用，應(yīng)用范圍較窄。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種適用范圍廣，簡(jiǎn)單便捷，能在常溫下有效長(zhǎng)期保持微藻細(xì)胞活性的微藻藻種長(zhǎng)期保藏方法。

本發(fā)明的微藻藻種長(zhǎng)期保藏方法，其特征在于，將微藻接種于固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，無(wú)菌條件下將攜帶有微藻細(xì)胞的固體培養(yǎng)基風(fēng)干，弱光條件下保藏。

具體步驟如下：將微藻接種于固體培養(yǎng)基上，15～30℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度為20～100μmol photons m^-2s^-1，培養(yǎng)7～14d，無(wú)菌條件下將攜帶有微藻細(xì)胞的固體培養(yǎng)基風(fēng)干，15～30℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度20～100μmol photons m^-2s^-1條件下保藏。

所述的微藻優(yōu)選為淡水微藻或海洋微藻。

所述的淡水微藻優(yōu)選為綠球藻。

所述的海洋微藻優(yōu)選為海洋小球藻。

當(dāng)所述的微藻為淡水微藻時(shí)，所述的固體培養(yǎng)基為BG-11固體培養(yǎng)基，當(dāng)所述的微藻為海洋微藻時(shí)，所述的固體培養(yǎng)基為F/2固體培養(yǎng)基。

所述的固體培養(yǎng)基的厚度優(yōu)選為2～3mm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1)本發(fā)明的微藻藻種長(zhǎng)期保藏方法，適用于絕大部分的微藻種類(lèi)，培養(yǎng)基具有廣譜性。同時(shí)，該方法可以讓微藻細(xì)胞在常溫光照條件下，生長(zhǎng)較慢，保藏時(shí)間延長(zhǎng)。

2)本發(fā)明的微藻藻種長(zhǎng)期保藏方法，減少了培養(yǎng)基中水分的含量，且培養(yǎng)過(guò)程中利用透氣膜封存樣品，既能有效隔離污染，大大減小了滋生細(xì)菌和真菌的條件，又使細(xì)胞能正常呼吸。

3)本發(fā)明的微藻藻種長(zhǎng)期保藏方法，操作過(guò)程耗能小，不需要超低溫抽真空脫水，藻細(xì)胞不會(huì)受到損傷，結(jié)構(gòu)與功能不會(huì)被破壞，色素體完整，保藏過(guò)程中持續(xù)低水平的光合作用，細(xì)胞復(fù)蘇方法簡(jiǎn)單。

4)本發(fā)明的微藻藻種長(zhǎng)期保藏方法，在運(yùn)輸過(guò)程中，較液體或者瓊脂保藏的藻種樣品不易損壞，也不用低溫保藏的特殊條件，且樣品體積小，重量輕，十分便捷。

5)本發(fā)明的微藻藻種長(zhǎng)期保藏方法，操作簡(jiǎn)單，不需要頻繁傳代，工作量大大減少，并且可以有效的保持細(xì)胞的活性及生物學(xué)特性，不易變異。

本發(fā)明的微藻藻種長(zhǎng)期保藏方法，具有操作簡(jiǎn)單，工作量小，保存時(shí)間長(zhǎng)，不易污染，能很好的維持藻細(xì)胞活性及特性，易復(fù)蘇，耗能低，運(yùn)輸便捷等優(yōu)點(diǎn)，為實(shí)驗(yàn)及生產(chǎn)保藏微藻藻種具有非常重要的意義。

附圖說(shuō)明：

圖1是保藏1年的綠球藻藻種；

圖2是保藏1年的綠球藻在新鮮固體培養(yǎng)基復(fù)培的狀態(tài)；

圖3是保藏1年的綠球藻在新鮮液體培養(yǎng)基復(fù)培的狀態(tài)；

圖4是保藏1年的海洋小球藻藻種；

圖5是保藏1年的海洋小球藻在新鮮固體培養(yǎng)基復(fù)培的狀態(tài)；

圖6是保藏1年的海洋小球藻在新鮮液體培養(yǎng)基復(fù)培的狀態(tài)。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例1：淡水微藻藻種保藏及復(fù)培(以淡水綠球藻為例)

1.微藻藻種：

綠球藻是一類(lèi)種類(lèi)較多，生境較廣，極為常見(jiàn)的淡水微藻。實(shí)驗(yàn)中的這株淡水綠球藻分離自廣東省廣州市內(nèi)大型人工湖泊，在實(shí)驗(yàn)室純化保藏。

2.培養(yǎng)條件：

適宜生長(zhǎng)溫度為15～30℃，光照強(qiáng)度為10～1000μmol photons m^-2s^-1，淡水微藻培養(yǎng)基(BG-11培養(yǎng)基)培養(yǎng)。

BG-11液體培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基含有NaNO₃ 1.5g、K₂HPO₄ 0.04g、MgSO₄^.7H₂O0.075g、CaCl₂^.7H₂O 0.036g、Na₂CO₃ 0.02g、Citric acid(檸檬酸)0.006g、Ammonium ferric citrategreen(檸檬酸鐵銨)0.006g、EDTA 0.001g、和微量元素溶液A5 1mL(每升微量元素溶液含有H₃BO₃ 2.86g、MnCl₂^.4H₂O 1.81g、ZnSO₄^.7H₂O 0.222g、Na₂MoO₄0.39g、CuSO₄^.5H₂O0.079g和Co(NO₃)₂.6H₂O 0.049g，余量為水)，余量為水，滅菌備用。BG-11固體培養(yǎng)基的配方為：每升BG-11液體培養(yǎng)基中加入25g瓊脂，滅菌后倒平板備用。

3.保藏操作：

首先配置好新鮮的BG-11固體培養(yǎng)基，將綠球藻細(xì)胞接種于BG-11固體培養(yǎng)基上，放入光照培養(yǎng)箱，25℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度60μmol photons m^-2s^-1，培養(yǎng)約10天后，可看見(jiàn)該綠球藻的藻落星星點(diǎn)點(diǎn)分布于培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)普通光學(xué)顯微鏡(Olympus)確定為純種。然后再制作新鮮的BG-11固體培養(yǎng)基，此時(shí)制作的這個(gè)固體培養(yǎng)基，在倒瓊脂時(shí)控制體積，使固體培養(yǎng)基厚度僅為3mm，將純化的綠球藻細(xì)胞涂布于該薄固體培養(yǎng)基上，生物封口膜封好，放置于光照培養(yǎng)箱，25℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度為60μmol photons m^-2s^-1，培養(yǎng)7d(可見(jiàn)大量綠球藻細(xì)胞)，把帶有綠球藻細(xì)胞的平板轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)，光照鼓風(fēng)放置3～5天，固體培養(yǎng)基風(fēng)干，取出放于光照培養(yǎng)箱，25℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度60μmol photons m^-2s^-1條件下長(zhǎng)期保藏。經(jīng)該方法保藏3～5年后，該藻細(xì)胞仍具有活力且無(wú)污染，不需要重新傳代。

4.復(fù)培實(shí)驗(yàn)：

將保藏1年的附著綠球藻細(xì)胞的固體培養(yǎng)基薄片(圖1)取出，在超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌操作，裁剪一小塊帶有綠球藻細(xì)胞的薄片，剩下的置于原容器封存好放回培養(yǎng)箱保藏。將裁剪下來(lái)的薄片放入裝有新鮮無(wú)菌BG-11液體培養(yǎng)基的50mL透明離心管中，生物膜封口后于光照培養(yǎng)箱中，25℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度為60μmol photons m^-2s^-1條件下培養(yǎng)3天后，用接種環(huán)從軟化的附著綠球藻細(xì)胞的固體培養(yǎng)基薄片上刮取呈綠色的藻細(xì)胞，接種到新鮮的BG-11固體培養(yǎng)基上，放于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，25℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度為60μmol photons m^-2s^-1條件下培養(yǎng)13天，即可見(jiàn)瓊脂上大量綠色健康的綠球藻藻落(圖2)，用光學(xué)顯微鏡觀察確定為保藏的綠球藻。用接種環(huán)刮取綠球藻細(xì)胞接種到新鮮的BG-11液體培養(yǎng)基中，25℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度為60μmol photons m^-2s^-1條件下培養(yǎng)15天，即可見(jiàn)細(xì)胞密度較高的綠色微藻液體培養(yǎng)物(圖3)，用光學(xué)顯微鏡觀察到健康完整的該藻細(xì)胞。

實(shí)施例2：海洋微藻藻種保藏及復(fù)培(以海洋小球藻為例)

1.微藻藻種：

海洋小球藻是極為常見(jiàn)的海水微藻，其產(chǎn)品應(yīng)用廣泛。實(shí)驗(yàn)中的這株海洋小球藻分離自中國(guó)海南省內(nèi)海域，在實(shí)驗(yàn)室純化保藏。

2.培養(yǎng)條件：

適宜生長(zhǎng)溫度為15～30℃，光照強(qiáng)度為10～1000μmol photons m^-2s^-1，海水微藻培養(yǎng)基(F/2培養(yǎng)基)培養(yǎng)。

F/2液體培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基含有NaNO₃ 75mg、NaH₂PO₄^.H₂O 5mg、Na₂SiO₃^.9H₂O 20mg、Na₂EDTA 4.36mg、FeCl₃^.6H₂O 3.16mg、CuSO₄^.5H₂O 0.01mg、ZnSO₄^.7H₂O 0.023mg、CoCl₂.6H₂O 0.012mg、MnCl.4H₂O 0.18mg、Na₂MoO₄^.2H₂O 0.07mg、維生素B1 0.1mg、維生素B12 0.5mg和生物素0.5mg，余量為經(jīng)0.45μm孔徑濾膜過(guò)濾的海水，滅菌備用。F/2固體培養(yǎng)基配方為：每升F/2液體培養(yǎng)基中加入25g瓊脂，滅菌后倒平板備用。

3.保藏操作：

首先配置好新鮮的F/2固體培養(yǎng)基，將海洋小球藻細(xì)胞接種于F/2固體培養(yǎng)基上，放入光照培養(yǎng)箱，25℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度為60μmol photons m^-2s^-1條件下培養(yǎng)約10天后，可看見(jiàn)該海洋小球藻的藻落星星點(diǎn)點(diǎn)分布于培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)普通光學(xué)顯微鏡(Olympus)確定為純種。然后再制作新鮮的F/2固體培養(yǎng)基，此時(shí)制作的這個(gè)固體培養(yǎng)基，在倒瓊脂時(shí)控制體積，使固體培養(yǎng)基厚度僅為2-3mm，將純化的海洋小球細(xì)胞涂布于該薄固體培養(yǎng)基上，生物封口膜封好，放置于光照培養(yǎng)箱，15℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度為20μmol photons m^-2s^-1條件下培養(yǎng)14d(可見(jiàn)大量海洋小球藻細(xì)胞)，把帶有海洋小球藻細(xì)胞的平板轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)，光照鼓風(fēng)放置3～5天，固體培養(yǎng)基風(fēng)干，與BG-11固體培養(yǎng)基不同，海水由于含有大量的鹽，在風(fēng)干后，表面會(huì)析出大量白色粉末狀的鹽，用接種環(huán)刮除掉表面的白色粉末狀的鹽，避免藻細(xì)胞高鹽分脫水，封好、取出放于光照培養(yǎng)箱，15℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度20μmol photons m^-2s^-1條件下長(zhǎng)期保藏。經(jīng)該方法保藏3～5年后，該藻細(xì)胞仍具有活力且無(wú)污染，不需要重新傳代。

4.復(fù)培實(shí)驗(yàn)：

將保藏1年的附著海洋小球藻細(xì)胞的固體培養(yǎng)基薄片(圖4)取出，在超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌操作，裁剪一小塊帶有海洋小球藻細(xì)胞的薄片，剩下的置于原容器封存好放回培養(yǎng)箱保藏。將裁剪下來(lái)的薄片放入裝有新鮮無(wú)菌F/2液體培養(yǎng)基的50mL透明離心管中，生物膜封口后于光照培養(yǎng)箱中25℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度為60μmol photons m^-2s^-1條件下培養(yǎng)3天后，用接種環(huán)從軟化的附著海洋小球藻細(xì)胞的固體培養(yǎng)基薄片上刮取呈綠色的藻細(xì)胞，接種到新鮮的F/2固體培養(yǎng)基上，放于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，25℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度為60μmol photons m^-2s^-1條件下培養(yǎng)15天，即可見(jiàn)瓊脂上大量綠色健康的海洋小球藻藻落(圖5)，用光學(xué)顯微鏡觀察確定為保藏的海洋小球藻。用接種環(huán)從軟化的附著海洋小球藻細(xì)胞的固體培養(yǎng)基薄片上刮取呈綠色的藻細(xì)胞接種到新鮮的F/2液體培養(yǎng)基上，25℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度為60μmol photons m^-2s^-1條件下培養(yǎng)20天，即可見(jiàn)細(xì)胞密度較高的綠色微藻液體培養(yǎng)物(圖6)，用光學(xué)顯微鏡觀察到健康完整的該藻細(xì)胞。

實(shí)施例3：海洋微藻藻種保藏及復(fù)培(以海洋小球藻為例)

1.微藻藻種：

海洋小球藻是極為常見(jiàn)的海水微藻，其產(chǎn)品應(yīng)用廣泛。實(shí)驗(yàn)中的這株海洋小球藻分離自中國(guó)海南省內(nèi)海域，在實(shí)驗(yàn)室純化保藏。

2.培養(yǎng)條件：

適宜生長(zhǎng)溫度為15～30℃，光照強(qiáng)度為10～1000μmol photons m^-2s^-1，海水微藻培養(yǎng)基(F/2培養(yǎng)基)培養(yǎng)。

F/2液體培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基含有NaNO₃ 75mg、NaH₂PO₄^.H₂O 5mg、Na₂SiO₃^.9H₂O 20mg、Na₂EDTA 4.36mg、FeCl₃^.6H₂O 3.16mg、CuSO₄^.5H₂O 0.01mg、ZnSO₄^.7H₂O 0.023mg、CoCl₂.6H₂O 0.012mg、MnCl.4H₂O 0.18mg、Na₂MoO₄^.2H₂O 0.07mg、維生素B1 0.1mg、維生素B12 0.5mg和生物素0.5mg，余量為經(jīng)0.45μm孔徑濾膜過(guò)濾的海水，滅菌備用。F/2固體培養(yǎng)基配方為：每升F/2液體培養(yǎng)基中加入25g瓊脂，滅菌后倒平板備用。

3.保藏操作：

首先配置好新鮮的F/2固體培養(yǎng)基，將海洋小球藻細(xì)胞接種于F/2固體培養(yǎng)基上，放入光照培養(yǎng)箱，25℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度為60μmol photons m^-2s^-1條件下培養(yǎng)約10天后，可看見(jiàn)該海洋小球藻的藻落星星點(diǎn)點(diǎn)分布于培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)普通光學(xué)顯微鏡(Olympus)確定為純種。然后再制作新鮮的F/2固體培養(yǎng)基，此時(shí)制作的這個(gè)固體培養(yǎng)基，在倒瓊脂時(shí)控制體積，使固體培養(yǎng)基厚度僅為2-3mm，將純化的海洋小球細(xì)胞涂布于該薄固體培養(yǎng)基上，生物封口膜封好，放置于光照培養(yǎng)箱，30℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度為100μmol photons m^-2s^-1條件下培養(yǎng)14d(可見(jiàn)大量海洋小球藻細(xì)胞)，把帶有海洋小球藻細(xì)胞的平板轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)，光照鼓風(fēng)放置3～5天，固體培養(yǎng)基風(fēng)干，與BG-11固體培養(yǎng)基不同，海水由于含有大量的鹽，在風(fēng)干后，表面會(huì)析出大量白色粉末狀的鹽，用接種環(huán)刮除掉表面的白色粉末狀的鹽，避免藻細(xì)胞高鹽分脫水，封好、取出放于光照培養(yǎng)箱，30℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度100μmol photons m^-2s^-1條件下長(zhǎng)期保藏。經(jīng)該方法保藏3～5年后，該藻細(xì)胞仍具有活力且無(wú)污染，不需要重新傳代。

4.復(fù)培實(shí)驗(yàn)：

將保藏1年的附著海洋小球藻細(xì)胞的固體培養(yǎng)基薄片取出，在超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌操作，裁剪一小塊帶有海洋小球藻細(xì)胞的薄片，剩下的置于原容器封存好放回培養(yǎng)箱保藏。將裁剪下來(lái)的薄片放入裝有新鮮無(wú)菌F/2液體培養(yǎng)基的50mL透明離心管中，生物膜封口后于光照培養(yǎng)箱中25℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度為60μmol photons m^-2s^-1條件下培養(yǎng)3天后，用接種環(huán)從軟化的附著海洋小球藻細(xì)胞的固體培養(yǎng)基薄片上刮取呈綠色的藻細(xì)胞，接種到新鮮的F/2固體培養(yǎng)基上，放于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，25℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度為60μmol photons m^-2s^-1條件下培養(yǎng)15天，即可見(jiàn)瓊脂上大量綠色健康的海洋小球藻藻落，用光學(xué)顯微鏡觀察確定為保藏的海洋小球藻。用接種環(huán)從軟化的附著海洋小球藻細(xì)胞的固體培養(yǎng)基薄片上刮取呈綠色的藻細(xì)胞接種到新鮮的F/2液體培養(yǎng)基上，25℃，持續(xù)光照，光照強(qiáng)度為60μmol photons m^-2s^-1條件下培養(yǎng)20天，即可見(jiàn)細(xì)胞密度較高的綠色微藻液體培養(yǎng)物，用光學(xué)顯微鏡觀察到健康完整的該藻細(xì)胞。