本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及PCV2型衣殼蛋白基因、表達菌株及可溶性表達方法。

背景技術(shù)：

斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)是由PCV2為主要病原體而引起的一種嚴重的豬疾病，感染的主要對象是大約6-15周齡的仔豬，主要的臨床癥狀是體弱、生長緩慢、呼吸困難、貧血、腹瀉、淋巴腫大、黃疸等等，以及淋巴細胞缺失、炎癥粒細胞浸潤等病理變化，在臨床上常與豬高致病性呼吸與繁殖綜合征、豬細小病毒以及豬口蹄疫病毒等混合感染豬仔，以及由此引起的繼發(fā)感染等。自從豬圓環(huán)病毒發(fā)病以來，豬圓環(huán)病毒疫苗的研制便已經(jīng)開始提上日程。豬圓環(huán)病毒疫苗于2006年研制成功并率先在北美應(yīng)用。2009年勃林格亞單位疫苗是在中國首次注冊成功的豬圓環(huán)病毒亞單位疫苗。2010年下半年國產(chǎn)疫苗才陸續(xù)上市。目前的亞單位疫苗多數(shù)采用桿狀病毒表達系統(tǒng)，表達出蛋白可以自發(fā)形成病毒樣顆粒，且表現(xiàn)出較好的免疫學(xué)活性。目前，國內(nèi)注冊的圓環(huán)病毒疫苗大部分為全病毒滅活疫苗。例如，哈爾濱獸醫(yī)研究所和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)研制的“圓克清”，上海海利公司生產(chǎn)的“圓畢凈”，江蘇南農(nóng)高科技公司生產(chǎn)的SH株全病毒滅活疫苗以及2011年北京大北農(nóng)集團研發(fā)的“誅歡泰”。盡管人們對PCV2疫苗做了很多研究，但是仍有很多問題亟待解決，桿狀病毒表達系統(tǒng)的成本昂貴，設(shè)備要求苛刻。全病毒滅活疫苗的效價低，效果略差。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，DNA疫苗是疫苗研究的熱點，DNA疫苗佐劑也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，但是因為其免疫活性低等諸多因素制約其發(fā)展。

豬圓環(huán)病毒2型的ORF2是構(gòu)成病毒衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，含有233個氨基酸，分子量約為27.8KDa。在Cap蛋白的N端含有41個氨基酸的核定位序列(NLS)。N端1-16個氨基酸里面含有9個精氨酸殘基，這對于大腸桿菌來說是稀有密碼子，因此，在大腸桿菌里面很難實現(xiàn)對PCV2-Cap蛋白的可溶表達。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的為提供能夠在大腸桿菌中成功得到表達的優(yōu)化的豬圓環(huán)病毒ORF2截短基因。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

優(yōu)化后的PCV2型衣殼蛋白基因，所述基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示。

所述基因在大腸桿菌中表達。

所述大腸桿菌為大腸桿菌BL-21(DE3)。

一種可溶表達PCV2型衣殼蛋白基因的菌株，宿主菌為大腸桿菌BL-21(DE3)，表達載體為含有權(quán)利要求1所述PCV2型衣殼蛋白基因的pET32a質(zhì)粒。

本發(fā)明還提供了所述PCV2型衣殼蛋白基因的可溶性表達方法，使用終濃度為0.01-0.2mM的IPTG在誘導(dǎo)溫度16-37℃下誘導(dǎo)8-24h。

優(yōu)選的，所述PCV2型衣殼蛋白基因的可溶性表達方法，使用終濃度為0.08mM的IPTG在誘導(dǎo)溫度32.5℃下誘導(dǎo)16h。

所述可溶性表達過程使用的裂解液組成如下：終濃度10-100mMNa₂HPO₄，終濃度1-3mM KH₂PO₄，終濃度200-500mM NaCl，終濃度2-3mMKCl，終濃度25-100mM咪唑，終濃度1-15mM EDTA。

進一步，所述裂解液組成如下：終濃度10-100mM Na₂HPO₄，終濃度1.8mM KH₂PO₄，終濃度200-500mM NaCl，終濃度2-3mM KCl，終濃度50mM咪唑，終濃度10mM EDTA。

優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)過程使用的裂解液組成如下：終濃度10mM Na₂HPO₄，終濃度1.8mM KH₂PO₄，終濃度240mM NaCl，終濃度2.7mM KCl，終濃度50mM咪唑，終濃度10mM EDTA。

所述裂解液pH為8.0。

本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，利用生物信息學(xué)手段，通過自主設(shè)計，對豬圓環(huán)病毒2型的ORF2基因進行優(yōu)化，并人工合成適合在大腸桿菌高效表達的PCV2衣殼蛋白基因。

本發(fā)明采用的受體菌BL-21(DE3)系大腸桿菌，具有大腸桿菌的一般生物學(xué)特性；能在富營養(yǎng)培養(yǎng)成分的LB培養(yǎng)基，pH中性，溫度37℃時迅速生長繁殖。該受體菌是經(jīng)過改造的，缺乏降解蛋白的lon蛋白酶及ompT外膜蛋白酶。BL-21(DE3)是噬菌體的溶源菌，噬菌體DE3是一種衍生噬菌體，帶有噬菌體21抗性區(qū)和lac I基因，lac UV5啟動子，以及T7RNA聚合酶基因。這一區(qū)段被插入int基因，因此阻止了DE3在沒有輔助噬菌體時整合到染色體上或從染色體切出。一旦形成DE3溶源狀態(tài)，就只有IPTG誘導(dǎo)的lac UV5啟動子指導(dǎo)的T7RNA聚合酶基因轉(zhuǎn)錄，在溶源體系里加入IPTG誘導(dǎo)T7RNA聚合酶產(chǎn)生，繼而啟動質(zhì)粒上的目的基因開始轉(zhuǎn)錄。

本發(fā)明采用的表達載體pET載體最初由Studier及其同事構(gòu)建，經(jīng)過Navagen公司多年的開發(fā)，形成了一系列新的pET載體。目的基因被克隆到pET質(zhì)粒上，受噬菌體T7強轉(zhuǎn)錄及(可選擇)翻譯信號控制；表達有宿主細胞(BL-21)提供的T7RNA聚合酶誘導(dǎo)；調(diào)控方式為化學(xué)誘導(dǎo)型，類似于Lac表達系統(tǒng)，可以通過在細菌培養(yǎng)基中加入IPTG來啟動表達。

附圖說明

圖1為重組的Pet32a-ORF2-Cap(702bp)表質(zhì)粒圖譜；

圖2為pET32a-ORF2-Cap(702bp)的驗證結(jié)果(1：誘導(dǎo)菌體；2：未誘導(dǎo)菌體；3：Western-blot結(jié)果)；

圖3為pET32a-ORF2-Cap(702bp)的可溶表達結(jié)果(1：未誘導(dǎo)菌體；2：誘導(dǎo)菌體；3：超聲波破碎后上清；4：超聲波破碎后沉淀)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例1 目的基因(PCV2型衣殼蛋白基因)的合成

將用分子生物學(xué)設(shè)計的ORF2序列，送于上海生工生物公司進行全序列合成，合成后基因測序正確，序列以質(zhì)粒形式存在。

優(yōu)化后的ORF2基因，即PCV2型衣殼蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

實施例2 目的基因與表達載體連接

1)將目的基因利用Nco1和Xho1雙酶切，酶切條件：37℃，酶切2h，酶切產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收目的基因?；厥詹襟E按上海生工膠回收試劑盒進行，具體步驟參見產(chǎn)品說明書。

2)表達載體利用常見的pET32a質(zhì)粒，在大腸桿菌中是氨芐抗性。先利用上海生工質(zhì)粒提取試劑盒，提取質(zhì)粒，具體步驟參見產(chǎn)品說明書。然后也利用Nco1和Xho1雙酶切，酶切條件：37℃，酶切2.5h。酶切產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收目的基因。具體方法同上。

3)目的基因與表達載體相連

表達載體與目的基因的比例在1:3-1:10之間。

2μL表達載體

6μL目的基因

1μL T4 DNA Ligase

1μL T4 DNA Ligase buffer

總體積10μL

16℃酶連過夜，得到帶有目的基因片段的重組質(zhì)粒。

4)大腸桿菌的Top10感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化

1、挑取Top10單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；

2、第二天，按1:100的比例轉(zhuǎn)接到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.5左右；

3、取1mL菌液，冰浴20min，8000rpm離心1min；

4、棄上清，加入1mL 0.1M的CaCl₂，重懸并充分混勻，冰浴30min；

5、1000rpm離心1min，棄上清，加入100μL 0.1M的CaCl₂，充分混勻，即為Top10感受態(tài)細胞；

6、將上述帶有目的基因片段的重組質(zhì)粒立即加入100μL制備好的Top10感受態(tài)細胞中，冰浴30min；

7、取出冰浴的Top10感受態(tài)細胞，立即42℃熱激90S，冰浴2min，再加入500μL不含抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基，整個過程需要輕拿輕放，37℃復(fù)蘇1h；

8、將復(fù)蘇后的菌液涂布在含相應(yīng)氨芐抗性的平板上，37℃培養(yǎng)過夜。

5)陽性克隆的驗證

1、挑取平板上過夜生長的具有本發(fā)明所述PCV2型衣殼蛋白基因的單菌落，過夜培養(yǎng)，溫度37℃，轉(zhuǎn)速200rpm；

2、取1μL過夜培養(yǎng)的菌液進行PCR驗證；

3、PCR反應(yīng)條件如下：

PCR程序設(shè)定如下：94℃預(yù)變性10min；94℃變性30s，60℃退火30s；72℃延伸60s；并設(shè)置30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。不同基因的擴增差異主要在于退火溫度和延伸時間，根據(jù)公司合成的引物合成單上面的建議溫度進行適當(dāng)調(diào)整，擴增的延伸時間根據(jù)擴增基因序列長度來確定，對于Taq酶來說，合成1000bp需要大約1min。

PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的條帶的長度約702b。

將陽性克隆菌株進行過夜培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒。質(zhì)粒提取方法按上海生工的質(zhì)粒提取試劑盒進行，具體方法參見產(chǎn)品說明書。將提取的質(zhì)粒進行雙酶切驗證。將雙酶切正切的質(zhì)粒，進行測序。測序結(jié)果如SEQ ID NO.1所示。

經(jīng)過測序后證明序列正確。pET32a-PCV2質(zhì)粒圖譜如圖1所示。

實施例3 表達菌株的構(gòu)建

1、大腸桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化，其步驟參考分子克隆手冊。挑取BL-21單菌落于LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；

2、第二天，按1:100的比例轉(zhuǎn)接到新鮮的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.5左右，取1mL菌液，冰浴30min，8000rpm離心1min；

3、棄上清，加入1mL 0.1M的CaCl₂，充分混勻，冰浴30min；

4、8000rpm離心1min，棄上清，加入100μL 0.1M的CaCl₂，充分混勻，即為感受態(tài)細胞；

5、將測序正確的陽性質(zhì)粒加入100μL制備好的BL-21感受態(tài)細胞中，冰浴30min；

6、42℃熱激60s，冰浴2min，再加入500μL不含抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基，整個過程要輕拿輕放，37℃復(fù)蘇1h；

7、將復(fù)蘇后的菌液涂布在含氨芐抗性的平板上，37℃培養(yǎng)過夜；

實施例4 SDS-PAGE以及Western-blot檢測目的蛋白的表達

將陽性表達菌株按1:100的接種量接入加入氨芐抗生素的新鮮LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD₆₀₀約為0.5時，加入IPTG(終濃度約為0.8mM)誘導(dǎo)8小時左右，收集菌體。利用SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白是否表達。兔抗組氨酸標(biāo)簽為抗原，利用Western-blot檢測目的蛋白是否有活性。檢測結(jié)果如圖2。通過簡單誘導(dǎo)條件優(yōu)化，實現(xiàn)目的蛋白的表達。

(1)SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達：

1、清洗蛋白電泳槽以及玻璃板，按照說明書安裝蛋白電泳裝置；

2、配制分離膠，迅速加入夾板間，保持上層液面和梳子下緣相距1cm左右，停止加入分離膠；

3、迅速加入無水乙醇封住液面，輕輕搖動，使得無水乙醇均勻分散在液面，并防止氣泡產(chǎn)生，室溫放置30-60min左右，分離膠即凝固；

4、倒掉無水乙醇，用去離子水洗滌分離膠頂部數(shù)次，以除去未聚合的丙烯酰胺以及無水乙醇，然后用濾紙吸干殘余液體；

5、配制濃縮膠，迅速加入夾板間，垂直插入梳子，在室溫下放置30-60min左右，濃縮膠即可完全凝固；

6、去掉玻璃夾板，將配制好的凝膠放入電泳槽，在電泳槽中加入電泳緩沖液，小心拔出梳子；

7、取100μL蛋白樣品加入100μL的2×上樣緩沖液，在沸水浴中加熱變性5-10min后，冷卻至室溫，12000rpm離心2min，取50μL上清加入凝膠空中；

8、電泳條件設(shè)置為電壓100V，時間2h；

9、當(dāng)指示劑跑到凝膠底時停止電泳，拆下玻璃夾板，取出凝膠，加入適量考馬斯亮藍染液進行染色；

10、將染色后的膠塊用去離子水清洗數(shù)次，加入脫色液脫色直到條帶明顯。

(2)Western-blot檢測目的蛋白的表達：

1、將上述步驟得到的SDS-PAGE電泳凝膠與PVDF膜在甲醇中浸泡約1min，并按照凝膠大小裁剪的濾紙浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，并將凝膠與PVDF膜浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中；

2、按從負極到正極的順序放置濾紙、凝膠與膜，順序為濾紙—凝膠—PVDF膜—濾紙，輕輕按壓去除氣泡；

3、轉(zhuǎn)膜電流為100mA，時間為40min；

4、TBST緩沖液清洗膜三次，每次三分鐘；

5、封閉液封閉1h，溫度為37℃；

6、將膜放入一抗中，4℃孵育過夜，一抗的稀釋比例參照說明書進行操作；一抗為兔抗PCV2抗體；

7、TBST洗膜三次，每次3min，繼續(xù)孵育二抗，孵育溫度為37℃，二抗稀釋按照1:2000比例參照說明書進行，二抗為羊抗兔IgG抗體；

8、TBST洗膜三次，加入DAB顯色液，避光顯色10min，觀察結(jié)果。

實驗結(jié)果如圖2所示，由圖2可知，在SDS-PAGE凝膠上，誘導(dǎo)的菌體和未誘導(dǎo)的菌體相比明顯多一條帶，說明實現(xiàn)了目的基因在大腸桿菌里面表達，然后利用Western-blot方法，證明表達的PCV2衣殼蛋白是有活性的，能夠識別PCV2特異性抗體。

實施例5 目的蛋白的可溶表達

利用單因素實驗設(shè)計，分別對誘導(dǎo)時間(8-24h)、誘導(dǎo)劑IPTG濃度(0.01-0.2mM)、誘導(dǎo)溫度(16-37℃)設(shè)置不同的水平，對培養(yǎng)條件實驗優(yōu)化，并且對裂解液以及裂解方法也進行一定條件的優(yōu)化，從而實現(xiàn)PCV2-cap蛋白的可溶表達。

將陽性表達菌株按1:100的接種量接入加入氨芐抗生素的新鮮LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600約為0.5時，用終濃度為0.08mM的IPTG在誘導(dǎo)溫度32.5℃下誘導(dǎo)16h，收集菌體。

然后將誘導(dǎo)后的菌液在12000rpm，4℃下離心20min，收集菌體，菌體用PBS(pH＝7.2)洗滌兩次，然后重懸于裂解液中，用超聲波細胞破碎儀進行菌體破碎，破碎程序為：破碎總時間30min，超聲3s，停4.3s，破碎溫度16℃，破碎功率900×0.3＝270W。破碎后對破碎液進行離心，12000rpm，30min，然后將沉淀和上清進行SDS-PAGE電泳驗證。

上述過程采用的裂解液組成如下；終濃度10-100mM Na₂HPO₄，終濃度1-3mM KH₂PO₄，終濃度200-500mM NaCl，終濃度2-3mM KCl，終濃度25-100mM咪唑，終濃度1-15mM EDTA，用高濃度NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0。

優(yōu)選的，裂解液組成如下：終濃度10mM Na₂HPO₄，終濃度1.8mMKH₂PO₄，終濃度240mM NaCl，終濃度2.7mM KCl，終濃度50mM咪唑，終濃度10mM EDTA，用高濃度NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0

驗證結(jié)果如圖3所示，從圖3可以看出，目的蛋白大部分在上清溶液中，而且表達量特別高，上清中的表達量占總目的蛋白表達量的80％以上。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大學(xué)

<120> PCV2型衣殼蛋白基因、表達菌株及可溶性表達方法

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgacgtatc caaggaggcg ttaccggaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60

cagatcctcc gcagaaggcc atggctggtt catccgcggc accgttaccg ctggagaagg 120

aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactat caagcgaacg 180

acggttaaaa cgccaagctg ggccgtcgac atgatgagat tcaatattaa cgactttttg 240

ccgccaggag ggggctcaaa cccccgctct gtgccatttg agtactacag aataagaaag 300

gtgaaggtcg aattttggcc ctgttcgcct atcacccaag gcgacagagg ggtcggcagt 360

tcggcggtga ttttggacga caatttcgtg acaaaggcta cggctttaac ttacgaccca 420

tacgtcaact actcctcccg ccataccata acacagccat tcagctacca ctcccgctac 480

tttacgccta aacctgtctt ggattcaact atcgactact tccaaccaaa caacaaaaga 540

aatcagctgt ggctgagact acaaacggct ggaaacgttg accatgtcgg cctcggcacg 600

gctttcgaaa acagtattta cgaccaggag tataatatcc gggtgaccat gtatgtacaa 660

ttcagagaat ttaatcttaa agacccgcca ttgaaccctt aa 702