本發(fā)明涉及用于檢測JAG2基因突變的試劑盒，具體涉及用于檢測JAG2基因SNP位點rs2238286基因型的方法。

背景技術：

JAG2基因是NOTCH信號通路的配體之一，它的主要作用是參與了次級腭的形成和發(fā)育過程，被認為是唇腭裂的候選基因之一。JAG2基因rs2238286（n.66+11354A>G）位點位于該基因的5’端附近，在研究中該位點AG、GG基因型表現出與非綜合征性唇腭裂有顯著性相關性。

作為常見的出生缺陷和顱面發(fā)育缺陷，唇腭裂是一種復雜的異質性疾病，國際上將其分為綜合征性（syndromic cleft lip or palate，SCLP）和非綜合征性唇腭裂（non-syndromic cleft lip or palate，NSCLP）。全球唇腭裂的發(fā)生率為3-22/10000，而我國的發(fā)生率約為1.82/1000。NSCLP的發(fā)病原因有很多，其中遺傳和環(huán)境的影響占據了主要作用。研究發(fā)現許多信號通路參與了唇腭的發(fā)育，不同染色體區(qū)間在唇腭裂發(fā)病中具有一定作用。目前已知的NSCLP易感區(qū)有Iq32，2p，2q，3q27-28，4q，6p23-p25，8q24，9q21，12p11，14q21-24, 16q24 和 19q13，可能的易感基因有IRF6、SATB2、TP63、FQXE1、PVRL1、MSX1、GABRB3、CRISPLD2、MAFB 和 ABCA4等。

高分辨率熔解曲線（high resolution melting, HRM)的分析原理是在常規(guī)聚合酶鏈式反應（PCR）過程中飽和熒光染枓與雙鏈DNA結合，當通過加熱升溫使DNA雙鏈解離時，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，由于突變、SNP位點雙鏈堿基間不匹配會使雙鏈DNA在此位點首先解開，通過實時監(jiān)測升溫過程中的熒光強度，從熒光強度與時間軸曲線上便可判斷是否存在突變或SNP，而且不同位點、雜合子與否、GC含量、擴增子長度等都會影響熔解曲線的峰形。所以，HRM分析能夠有效區(qū)分不同突變位點、SNP位點和擁有不同GC含量的擴增片段。

技術實現要素：

本發(fā)明提供了用于檢測JAG2基因突變的試劑盒，具體提供了用于檢測JAG2基因SNP位點rs2238286基因型的試劑盒，該試劑盒可用于非綜合唇腭裂易患性的輔助分析。

本發(fā)明的第一個目的是提供用于檢測JAG2基因SNP位點rs2238286基因型的試劑盒，所述試劑盒包括引物對和PCR檢測反應試劑；其中，所述引物對為（1）或（2）中的一種：

（1）上游引物：JAG2-F 5'- AGGAGCTAGGGGGAGAGAAGAC-3'

下游引物：JAG2-R 5'- AGGGGTCACCTTGGTGGTTA-3'；

（2）與（1）中的互補序列。

作為優(yōu)選，所述PCR檢測反應試劑包括含EvaGreen的Green-2-Go qPCRMastermix。

作為優(yōu)選，所述PCR擴增時的反應體系為：

Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl

引物F（10μM） 0.1μl

引物R（10μM） 0.1μl

模板（50ng/μl） 0.5μl

ddH₂O 4.3μl

總體積 10μl。

作為進一步優(yōu)選，所述試劑盒還包括標準品，所述標準品為重組陰性質粒和重組陽性質粒，所述重組陰性質粒的核苷酸序列為序列表SEQ ID No.1，所述重組陽性質粒的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.2。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種檢測JAG2基因SNP位點rs2238286基因型的方法，步驟如下：

（1）構建重組陰性質粒和重組陽性質粒：所述重組陰性質粒的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.1，所述重組陽性質粒的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID No.2；

（2）構建PCR擴增時的引物對，所述引物對為a或b中的一種：

a、上游引物：JAG2-F 5'- AGGAGCTAGGGGGAGAGAAGAC-3'

下游引物：JAG2-R 5'- AGGGGTCACCTTGGTGGTTA-3'；

b、與a中的互補序列；

（3）提取待測樣本的外周血基因組DNA，對重組陰性質粒、重組陽性質粒和待測樣本的DNA均使用步驟（2）所述引物，且在同一條件下進行PCR擴增和HRM分析，收集數據；

作為優(yōu)選，所述HRM分析的條件為：94℃ 90s；60℃ 30s；83-94℃收集數據，溫度上升速率為0.06℃/s；

（4）根據收集數據繪制高分辨率熔解曲線，根據重組陰性質粒、重組陽性質粒的熔解曲線判斷待測樣本JAG2基因SNP位點rs2238286的基因型：

與重組陰性質粒的熔解曲線重合則JAG2基因SNP位點rs2238286的基因型為AA；

與重組陽性質粒的熔解曲線重合則JAG2基因SNP位點rs2238286的基因型為GG；

在重組陰性質粒和重組陽性質粒之間的則JAG2基因SNP位點rs2238286的基因型為AG。

作為優(yōu)選，所述PCR擴增時的反應體系為：

Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl

引物F（10μM） 0.1μl

引物R（10μM） 0.1μl

模板（50ng/μl） 0.5μl

ddH₂O 4.3μl

總體積 10μl。

作為優(yōu)選，所述PCR擴增時的反應條件為：94℃預變性3min；94℃變性10s；60℃退火/延伸20s；40個循環(huán)。

本發(fā)明的第三個目的是提供上述試劑盒的使用方法，步驟如下：

（1）提取待測樣本的外周血基因組DNA，對重組陰性質粒、重組陽性質粒和待測樣本的DNA均使用相同引物，且在同一條件下進行PCR擴增和HRM分析，收集數據；

所述HRM分析的條件為：94℃ 90s；60℃ 30s；83-94℃收集數據，溫度上升速率為0.06℃/s；

（2）根據收集數據繪制高分辨率熔解曲線，根據重組陰性質粒、重組陽性質粒的熔解曲線判斷待測樣本JAG2基因SNP位點rs2238286的基因型：

與重組陰性質粒的熔解曲線重合則JAG2基因SNP位點rs2238286的基因型為AA；

與重組陽性質粒的熔解曲線重合則JAG2基因SNP位點rs2238286的基因型為GG；

在重組陰性質粒和重組陽性質粒之間的則JAG2基因SNP位點rs2238286的基因型為AG。

本發(fā)明的第四個目的是提供上述試劑盒在制備輔助診斷非綜合征唇腭裂的試劑中應用。

本發(fā)明的試劑盒能夠準確檢測JAG2基因SNP位點rs2238286的基因型，靈敏度高，特異性好，檢測迅速；應用本發(fā)明的方法對JAG2基因SNP位點rs2238286基因型的分型與測序結果完全一致，能夠用于非綜合征唇腭裂的易患性分析。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為本發(fā)明的HRM方法靈敏度實驗結果；

圖2為樣本用本發(fā)明的HRM方法分析結果；

圖3為樣本的JAG2 rs2238286（n.66+11354A>G）位點的測序結果；其中a代表野生型序列，b代表純合突變型序列，c為雜合突變序列。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。本申請所用引物和所用序列合成及測序工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

實施例1 JAG2 rs2238286標準品的制備

要建立HRM分析方法，首先必須制備方法所需的外部標準品，標準品應包含高度保守和特異性的序列，要保證反應的高特異性。本發(fā)明合成包含JAG2 rs2238286（n.66+11354A>G）位點的野生型和純合突變型DNA序列，利用基因重組技術將其克隆到pMD18-T載體中，構建出重組質粒pMD18-T-rs2238286的野生型和純合突變型，并進行相應的PCR鑒定和測序鑒定，最后經定量后作為待建立方法的標準品，野生型重組質粒為重組陰性質粒，純合突變型重組質粒為重組陽性質粒，為下一步的方法及評估奠定基礎。

一、pMD18-T-rs2238286重組陰性質粒和重組陽性質粒的構建和轉化

1.合成JAG2 rs2238286（n.66+11354A>G）野生型和純合突變型DNA序列，本發(fā)明合成的序列長250bp，序列如下：

（1）野生型序列

ACCCAGCTCCGGGCACAGGGCAAATTTGCGAGAGGAGCTAGGGGGAGAGAAGACAGCTCAGTTATCATGGGGATGGGTTGAGGACCCCTCTGGACCATATGGGGATCTTTAACCACCAAGGTGACCCCTAGCTCTGGAAAGGACCGTGCTCACTGGAGGAGAGGAAGGTGCCATTGGTTTTGACCCTGTGGAGGAGCTGCGAGGTCACCCAGGGAGAGGGCAAGGAGGTGACCGCAGAGGATGGGGTGTG

（2）純合突變型序列

ACCCAGCTCCGGGCACAGGGCAAATTTGCGAGAGGAGCTAGGGGGAGAGAAGACAGCTCAGTTATCATGGGGATGGGTTGAGGACCCCTCTGGACCATGTGGGGATCTTTAACCACCAAGGTGACCCCTAGCTCTGGAAAGGACCGTGCTCACTGGAGGAGAGGAAGGTGCCATTGGTTTTGACCCTGTGGAGGAGCTGCGAGGTCACCCAGGGAGAGGGCAAGGAGGTGACCGCAGAGGATGGGGTGTG

其中標有下劃線的堿基為基因突變位點。

2.連接反應：將上述合成的DNA片段與pMD18-T進行連接，采用如下連接體系進行配制：

pMD18-T 1μL

DNA 2μL

SolutionI 5μL

ddH₂O 2μL

總體積 10μL。

配制完成后置于16℃進行過夜連接反應。

3. pMD18-T-rs2238286質粒的轉化以及PCR鑒定

（1）從-80℃的超低溫冰箱中取出凍存的DH5α感受態(tài)細胞，置于冰盒上使其解凍；

（2）取步驟2得到的連接產物10μL加入50μL的DH5α感受態(tài)細胞中，輕輕搖勻后置冰浴30分鐘；

（3）42℃水浴熱激90秒，熱激后立即置冰上冷卻2min；

（4）于1.5ml EP管中加入預冷的1ml的不含抗性的LB液體培養(yǎng)基吹打混勻后，37℃ 120轉/分輕搖培養(yǎng)90min；

（5）將上述培養(yǎng)液短暫離心吸去900μl后取剩余的100μl涂布于含Amp抗生素的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜；

（6）從平板上挑取單克隆菌落于500μL Amp抗性LB液體培養(yǎng)基的1.5ml EP管中，37℃ 220rpm振蕩培養(yǎng)5-6小時；

（7）取1μL作為模板進行菌液PCR鑒定。將鑒定為陽性的菌液加入到20ml的LB液體培養(yǎng)基中進行擴搖；

（8）用引物JAG2-F和JAG2-R擴增上述稀釋菌液，PCR產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳，通過檢測PCR產物鑒定陽性轉化子。

引物序列為HRM分析所用引物，序列如下：

上游引物：JAG2-F 5'- AGGAGCTAGGGGGAGAGAAGAC-3'

下游引物：JAG2-R 5'- AGGGGTCACCTTGGTGGTTA-3'

體系如下：

10×PCR buffer 2μL

dNTP（2.5μM） 2μL

引物F（5μM） 1.5μL

引物R（5μM） 1.5μL

模板 2μL

Taq酶（5U） 0.5μL

ddH₂O 10.5μL

總體積 20μL。

擴增程序/反應條件：94℃預變性5min；94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30sec，35個循環(huán)；72℃ 10min。

提取重組陰性質粒和重組陽性質粒采用北京百泰克公司生產的質粒制備試劑盒提取重組質粒，測定濃度和純度，同時吸取一部分純化質粒送至上海生物工程有限公司進行測序，確定插入片段的基因序列與目的序列一致。

二、標準品的獲取和定量

（1）將步驟一得到的凍存的含有重組質粒pMD18-T-rs2238286的大腸桿菌DH5a 100μl接種于15ml氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 220rpm培養(yǎng)14-16h；

（2）采用北京百泰克生物科技有限公司生產的質粒制備試劑盒提取重組質粒；

（3）利用北京百泰克生物科技有限公司的超微量紫外可見分光光度計（ND5000）對提取的質粒測定濃度，根據A₂₆₀/A₂₈₀判斷質粒的純度。A₂₆₀/A₂₈₀=1.78。

實施例2 HRM-PCR檢測JAG2 rs2238286方法的建立

一、待測樣本DNA的制備

提取30例樣本的外周血基因組DNA，用作JAG2基因PCR擴增的模板。具體提取方法如下：

（1）取1ml全血，加入3ml TE，顛倒混勻后靜置10min，8000rpm離心5分鐘，棄上清液；

（2）重復上述步驟2-3次至沉淀為白色；

（3）加入900μl 10%SDS和10μl 10mg/ml蛋白酶K，55℃水浴1h；

（4）將離心管冷卻至室溫，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）混勻，12000rpm離心10min；

（5）小心吸取上清后再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）混勻，12000rpm離心10min；

（6）取上清，加入兩倍體積的無水乙醇，上下顛倒混勻，12000rpm離心10min，棄上清；

（7）加500μl 70%的乙醇洗滌沉淀，短暫離心后棄上清，開蓋干燥至乙醇完全揮發(fā)；

（8）加50μl雙蒸水或TE溶解DNA中，-20℃保存。

二、特異性引物的設計與合成

本發(fā)明通過對NCBI數據庫中JAG2rs2238286基因序列進行檢索，選取適合設計引物的片段序列為靶目標，設計了一組HRM-PCR引物。

本發(fā)明選取的擴增序列如下：

其中標有下劃線的堿基為基因突變位點。

設計的引物序列如下：

上游引物：JAG2-F 5'- AGGAGCTAGGGGGAGAGAAGAC-3'

下游引物：JAG2-R 5'- AGGGGTCACCTTGGTGGTTA-3'

擴增片段大小為：97bp。擴增的核苷酸序列為：

三、HRM-PCR反應體系和反應條件

分別以待測樣本DNA、重組陰性質粒和重組陽性質粒為模板，以上述引物JAG2-F和JAG2-R為擴增引物，采用下述體系和反應條件進行PCR擴增和HRM分析。

PCR體系：

Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl

引物F（10μM） 0.1μl

引物R（10μM） 0.1μl

模板（50ng/μl） 0.5μl

ddH₂O 4.3μl

總體積 10μl。

其中引物采用JAG2-F和JAG2-R，HRM-PCR采用生工生物（上海），Green-2-Go qPCRMastermix試劑盒。HRM分析儀為百源基因ASA-9600實時熒光定量PCR儀。

PCR擴增程序：

94℃預變性3min；94℃變性10s；60℃退火/延伸20s；40個循環(huán)；

HRM分析：

94℃ 90s

60℃ 30sec

83-94℃收集數據，溫度上升速率為0.06℃/s。

四、結果分析

根據收集數據繪制高分辨率熔解曲線，根據重組陰性質粒、重組陽性質粒的熔解曲線判斷待測樣本JAG2基因SNP位點rs2238286的基因型：

與重組陰性質粒的熔解曲線重合則JAG2基因SNP位點rs2238286的基因型為AA；

與重組陽性質粒的熔解曲線重合則JAG2基因SNP位點rs2238286的基因型為GG；

在重組陰性質粒和重組陽性質粒之間的則JAG2基因SNP位點rs2238286的基因型為AG。

五、靈敏度實驗

將重組陽性質粒和重組陰性質粒均稀釋至50ng/μl后，將二者混合進行梯度稀釋，重組陽性質粒比例依次為50%、25%、12.5%、5%、2%和1%，按照上述HRM-PCR反應體系和參數進行擴增，分析突變檢出范圍，即靈敏度。

反應體系如下：

Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl

引物F（10μM） 0.1μl

引物R（10μM） 0.1μl

模板（50ng/μl） 0.5μl

ddH₂O 4.3μl

總體積 10μl。

PCR擴增程序：

94℃預變性3min；94℃變性10s；60℃退火/延伸20s

HRM分析：

94℃ 90s

60℃ 30sec

83-94℃收集數據，溫度上升速率為0.06℃/s。

結果參見圖1，實驗數據顯示，當重組陽性質粒與重組陰性質粒體積比分別為1:1、1:3、1:7、1:19、1:49、1:99時，均能檢測出重組陽性質粒，所以本發(fā)明的HRM檢測方法的靈敏度為1%。

實施例3 應用本發(fā)明的檢測試劑盒檢測樣本基因突變

以實施例2步驟中的檢測試劑盒和檢測方法，對30例樣本進行HRM分析，與重組陽性質粒和重組陰性質粒的熔解曲線對照比較，依此確定樣本中的突變類型，并根據HRM分析結果針對每種基因型隨機挑選1個樣本在生工生物（上海）進行Sanger測序驗證。

HRM分析結果參見表1和圖2，數據顯示30例樣本中JAG2基因SNP位點rs2238286野生型有21例，A>G雜合突變型有6例，A>G純合突變型3例。

Sanger測序結果參見圖3：其中a為樣本編號5的測序結果，b為樣本編號9的測序結果，c為樣本編號20的測序結果；與本發(fā)明方法檢測的結果完全一致。

表1應用本發(fā)明的方法對樣本的分析結果

實施例4 用于檢測JAG2基因SNP位點rs2238286基因型的試劑盒

本發(fā)明的用于檢測JAG2基因SNP位點rs2238286基因型的試劑盒包括以下組分：

（1）JAG2 rs2238286標準品：重組陰性質粒和重組陽性質粒，按照實施例1中的方法制備；

（2）引物：該引物序列為：

上游引物：JAG2-F 5'- AGGAGCTAGGGGGAGAGAAGAC-3'

下游引物：JAG2-R 5'- AGGGGTCACCTTGGTGGTTA-3'

（3）含有飽和熒光染料Eva Green的PCR擴增試劑。

應用該試劑盒檢測JAG2基因SNP位點rs2238286基因型的方法與實施例2相同。

最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

序列表

<110> 蘇州百源基因技術有限公司

<120> 用于檢測JAG2基因SNP位點rs2238286基因型的試劑盒

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acccagctcc gggcacaggg caaatttgcg agaggagcta gggggagaga agacagctca 60

gttatcatgg ggatgggttg aggacccctc tggaccatat ggggatcttt aaccaccaag 120

gtgaccccta gctctggaaa ggaccgtgct cactggagga gaggaaggtg ccattggttt 180

tgaccctgtg gaggagctgc gaggtcaccc agggagaggg caaggaggtg accgcagagg 240

atggggtgtg 250

<210> 2

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acccagctcc gggcacaggg caaatttgcg agaggagcta gggggagaga agacagctca 60

gttatcatgg ggatgggttg aggacccctc tggaccatgt ggggatcttt aaccaccaag 120

gtgaccccta gctctggaaa ggaccgtgct cactggagga gaggaaggtg ccattggttt 180

tgaccctgtg gaggagctgc gaggtcaccc agggagaggg caaggaggtg accgcagagg 240

atggggtgtg 250

<210> 3

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctccgggca cagggcaaat ttgcgagagg agctaggggg agagaagaca gctcagttat 60

catggggatg ggttgaggac ccctctggac catatgggga tctttaacca ccaaggtgac 120

ccctagctct ggaaaggacc gtgctcactg gaggagagga aggtgccatt ggttttgacc 180

ctgtggagga gctgcgaggt 200

<210> 4

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aggagctagg gggagagaag acagctcagt tatcatgggg atgggttgag gacccctctg 60

gaccatatgg ggatctttaa ccaccaaggt gacccct 97