本發(fā)明涉及用于檢測CYP2C19基因SNP位點rs4986893基因型的試劑盒。

背景技術(shù)：

目前已證實CYP2C19不但參與抗癲癇藥物的代謝，而且很多的臨床重要藥物都是它的底物。人類對藥物的氧化代謝能力可分為2種表型，一種為強代謝型，另一種為弱代謝型，后者主要是由于CYP2C19*2和CYP2C19*3這兩個缺陷型等位基因引起的。由于不同個體存在藥物代謝方面的差異，因而給藥后可能會出現(xiàn)嚴重的不良反應(yīng)或藥物劑量不足，從而導(dǎo)致治療的失敗。CYP2C19 在體內(nèi)可催化一系列藥物，如 S-美芬妥英(S-mephenytoin，S-MP)、奧美拉唑（omeprazole，OPZ）、地西汁(diazepam，DZ)、去甲地西汁（demethyldiazepam )、丙米嗪（imipramine，IMI)、甲苯磺丁脲(tolbutamide，D860)、苯巴比妥(phenobarbital，PB)，氯胍(proguanil)和二氯胍(chlorproguanil)等。

CYP2C19 rs4986893（CYP2C19*3）是第四外顯子第636位處的堿基發(fā)生變異（G>A），使212位原來編碼色氨酸的密碼子變?yōu)榻K止密碼子，從而只產(chǎn)生CYP2C19前4個外顯子的編碼產(chǎn)物：僅由211個氨基酸組成的沒有活性的蛋白質(zhì)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了用于檢測CYP2C19基因SNP位點rs4986893基因型的試劑盒，檢測結(jié)果能夠用于CYP2C19 rs4986893相關(guān)的藥物個體化治療。

本發(fā)明的第一個目的是提供用于檢測CYP2C19基因SNP位點rs4986893基因型的試劑盒，所述試劑盒包括引物對和PCR檢測反應(yīng)試劑；其中，所述引物對為（1）或（2）中的一種：

（1）上游引物：CYP2C19-F 5'- CATCAGGATTGTAAGCACCCCC-3'

下游引物：CYP2C19-R 5'- TTTCTCAGGAAGCAAAAAACTTGG-3'；

（2）與（1）中的互補序列。

上述引物的衍生序列也在本發(fā)明的保護范圍，所述衍生序列為向5’端和/或3’端方向延伸一致數(shù)個堿基或刪減一致數(shù)個堿基得到的序列。

作為優(yōu)選，所述PCR檢測反應(yīng)試劑包括含EvaGreen 的Green-2-Go qPCRMastermix。

作為優(yōu)選，所述PCR擴增時的反應(yīng)體系為：

Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl

引物F（10μM） 0.1μl

引物R（10μM） 0.1μl

模板（50ng/μl） 0.5μl

ddH₂O 4.3μl

總體積 10μl。

作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括標準品，所述標準品為重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒，所述重組陰性質(zhì)粒的核苷酸序列為序列表SEQ ID No.1，所述重組陽性質(zhì)粒的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.2。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種檢測CYP2C19基因SNP位點rs4986893基因型的方法，步驟如下：

（1）構(gòu)建重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒：所述重組陰性質(zhì)粒的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.1，所述重組陽性質(zhì)粒的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID No.2；

（2）構(gòu)建PCR擴增時的引物對，所述引物對為a或b中的一種：

a、上游引物：CYP2C19-F 5'- CATCAGGATTGTAAGCACCCCC-3'

下游引物：CYP2C19-R 5'- TTTCTCAGGAAGCAAAAAACTTGG-3'；

b、與a中的互補序列；

（3）提取待測樣本的外周血基因組DNA，對重組陰性質(zhì)粒、重組陽性質(zhì)粒和待測樣本的DNA均使用步驟（2）所述引物，且在同一條件下進行PCR擴增和HRM分析，收集數(shù)據(jù)；

作為優(yōu)選，所述HRM分析的條件為：94℃ 90s；60℃ 30s；83-94℃收集數(shù)據(jù)，溫度上升速率為0.06℃/s；

（4）根據(jù)收集數(shù)據(jù)繪制高分辨率熔解曲線，根據(jù)重組陰性質(zhì)粒、重組陽性質(zhì)粒的熔解曲線判斷待測樣本CYP2C19基因SNP位點rs4986893的基因型：

與重組陰性質(zhì)粒的熔解曲線重合則CYP2C19基因SNP位點rs4986893的基因型為GG；

與重組陽性質(zhì)粒的熔解曲線重合則CYP2C19基因SNP位點rs4986893的基因型為AA；

在重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒之間的則CYP2C19基因SNP位點rs4986893的基因型為GA。

作為優(yōu)選，所述PCR擴增時的反應(yīng)體系為：

Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl

引物F（10μM） 0.1μl

引物R（10μM） 0.1μl

模板（50ng/μl） 0.5μl

ddH₂O 4.3μl

總體積 10μl。

作為優(yōu)選，所述PCR擴增時的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性10s；60℃退火/延伸20s；40個循環(huán)。

本發(fā)明的第三個目的是提供上述試劑盒的使用方法，步驟如下：

（1）提取待測樣本的外周血基因組DNA，對重組陰性質(zhì)粒、重組陽性質(zhì)粒和待測樣本的DNA均使用相同引物，且在同一條件下進行PCR擴增和HRM分析，收集數(shù)據(jù)；

所述HRM分析的條件為：94℃ 90s；60℃ 30s；83-94℃收集數(shù)據(jù)，溫度上升速率為0.06℃/s；

（2）根據(jù)收集數(shù)據(jù)繪制高分辨率熔解曲線，根據(jù)重組陰性質(zhì)粒、重組陽性質(zhì)粒的熔解曲線判斷待測樣本CYP2C19基因SNP位點rs4986893的基因型：

與重組陰性質(zhì)粒的熔解曲線重合則CYP2C19基因SNP位點rs4986893的基因型為GG；

與重組陽性質(zhì)粒的熔解曲線重合則CYP2C19基因SNP位點rs4986893的基因型為AA；

在重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒之間的則CYP2C19基因SNP位點rs4986893的基因型為GA。

本發(fā)明的第四個目的是提供上述試劑盒在制備與CYP2C19 rs4986893相關(guān)的藥物個體化治療試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的試劑盒能夠準確檢測CYP2C19基因SNP位點rs4986893的基因型，靈敏度高，特異性好，檢測快速；應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒對CYP2C19基因SNP位點rs4986893基因型的分型與測序結(jié)果完全一致，能夠用于CYP2C19 rs4986893相關(guān)的藥物個體化治療，對后續(xù)研究具有重要意義。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為本發(fā)明的HRM方法靈敏度實驗結(jié)果。

圖2為樣本用本發(fā)明的HRM方法分析結(jié)果。

圖3為樣本的CYP2C19 rs4986893（c.636G>A）位點的測序結(jié)果；其中a代表野生型序列，b代表純合突變型序列，c為雜合突變序列。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。本申請所用引物和所用序列合成及測序工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

實施例1 CYP2C19 rs4986893標準品的制備

要建立HRM分析方法，首先必須制備方法所需的外部標準品，標準品應(yīng)包含高度保守和特異性的序列，要保證反應(yīng)的高特異性。本發(fā)明合成包含CYP2C19 rs4986893（c.636G>A）位點的野生型和純合突變型DNA序列，利用基因重組技術(shù)將其克隆到pMD18-T載體中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pMD18-T-rs4986893的野生型和純合突變型，并進行相應(yīng)的PCR鑒定和測序鑒定，最后經(jīng)定量作為待建立方法的標準品：野生型重組質(zhì)粒為重組陰性質(zhì)粒，純合突變型重組質(zhì)粒為重組陽性質(zhì)粒，為下一步的方法及評估奠定基礎(chǔ)。

一、重組陰性和陽性質(zhì)粒pMD18-T-rs4986893的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

1.合成CYP2C19 rs4986893（c.636G>A）野生型和純合突變型DNA序列，本發(fā)明合成的序列200bp，序列如下：

（1）野生型序列

ATAAAGATCAGCAATTTCTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGGATCCAGGTAAGGCCAAGTTTTTTGCTTCCTGAGAAACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGAAATCCAAAATTCTATATTGACCAAGCCCTGAAGTACATTTTTGAATACTACAGTCTTGCCTAGACAGC

其中標有下劃線的堿基為基因突變位點。

（2）純合突變型序列

ATAAAGATCAGCAATTTCTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGAATCCAGGTAAGGCCAAGTTTTTTGCTTCCTGAGAAACCACTTACAGTCTTTTTTTCTGGGAAATCCAAAATTCTATATTGACCAAGCCCTGAAGTACATTTTTGAATACTACAGTCTTGCCTAGACAGC

其中標有下劃線的堿基為基因突變位點。

2.連接反應(yīng)：將上述合成的DNA片段與pMD18-T進行連接，采用如下連接體系進行配制：

pMD18-T 1μL

DNA 2μL

SolutionI 5μL

ddH₂O 2μL

總體積 10μL

配制完成后置于16℃進行過夜連接反應(yīng)。

3. pMD18-T-rs4986893質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化以及PCR鑒定

（1）從-80℃的超低溫冰箱中取出凍存的DH5α感受態(tài)細胞，置于冰盒上使其解凍；

（2）取步驟2得到的連接產(chǎn)物10μL加入50μL的DH5α感受態(tài)細胞中，輕輕搖勻后置冰浴30分鐘；

（3）42℃水浴熱激90秒，熱激后立即置冰上冷卻2min；

（4）于1.5ml EP管中加入預(yù)冷的1ml的不含抗性的LB液體培養(yǎng)基吹打混勻后，37℃ 120轉(zhuǎn)/分輕搖培養(yǎng)90min；

（5）將上述培養(yǎng)液短暫離心吸去900μl后取剩余的100μl涂布于含Amp抗生素的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜；

（6）從平板上挑取單克隆菌落于500μL Amp抗性LB液體培養(yǎng)基的1.5ml EP管中，37℃ 220rpm振蕩培養(yǎng)5-6小時；

（7）取1μL作為模板進行菌液PCR鑒定。將鑒定為陽性的菌液加入到20ml的LB液體培養(yǎng)基中進行擴搖；

（8）用引物CYP2C19-F和CYP2C19-R擴增上述稀釋菌液，PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳，通過檢測PCR產(chǎn)物鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。

引物序列為HRM分析所用引物，序列如下：

上游引物：CYP2C19-F 5^'- CATCAGGATTGTAAGCACCCCC-3^'

下游引物：CYP2C19-R 5^'- TTTCTCAGGAAGCAAAAAACTTGG-3^'

體系如下：

10×PCR buffer 2μL

dNTP（2.5μM） 2μL

引物F（5μM） 1.5μL

引物R（5μM） 1.5μL

模板 2μL

Taq酶（5U） 0.5μL

ddH₂O 10.5μL

總體積 20μL。

擴增程序/反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30sec，35個循環(huán)；72℃ 10min。

4.重組陰性和陽性質(zhì)粒的提取

采用北京百泰克公司生產(chǎn)的質(zhì)粒制備試劑盒提取重組質(zhì)粒，測定濃度和純度，同時吸取一部分純化質(zhì)粒送至上海生物工程有限公司進行測序，確定插入片段的基因序列與目的序列一致。

二、標準品的獲取和定量

（1）將步驟一得到的凍存的含有重組質(zhì)粒pMD18-T-rs4986893的大腸桿菌DH5α100μl接種于15ml氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 220rpm培養(yǎng)14-16h；

（2）采用北京百泰克生物科技有限公司生產(chǎn)的質(zhì)粒制備試劑盒提取重組質(zhì)粒；

（3）利用北京百泰克生物科技有限公司的超微量紫外可見分光光度計（ND5000）對提取的質(zhì)粒測定濃度，根據(jù)A₂₆₀/A₂₈₀判斷質(zhì)粒的純度。A₂₆₀/A₂₈₀=1.78。

實施例2 HRM-PCR檢測CYP2C19rs4986893方法的建立

一、待測樣本的制備

提取30例樣本的血液基因組DNA，用作CYP2C19基因PCR擴增的模板。血液基因組DNA的提取步驟如下：

（1）取1ml全血，加入3ml TE，顛倒混勻后靜置10min，8000rpm離心5分鐘，棄上清液；

（2）重復(fù)上述步驟2-3次至沉淀為白色；

（3）加入900μl 10%SDS和10μl 10mg/ml蛋白酶K，55℃水浴1h；

（4）將離心管冷卻至室溫，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）混勻，12000rpm離心10min；

（5）小心吸取上清后再加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）混勻，12000rpm離心10min；

（6）取上清，加入兩倍體積的無水乙醇，上下顛倒混勻，12000rpm離心10min，棄上清；

（7）加500μl 70%的乙醇洗滌沉淀，短暫離心后棄上清，開蓋干燥至乙醇完全揮發(fā)；

（8）加50μl雙蒸水或TE溶解DNA，-20℃保存。

二、特異性引物的設(shè)計與合成

本發(fā)明通過對NCBI數(shù)據(jù)庫中CYP2C19rs4986893基因序列進行檢索，選取適合設(shè)計引物的片段序列為靶目標，設(shè)計了一組HRM-PCR引物。

本發(fā)明選取的擴增序列如下：

其中標有下劃線的堿基為基因突變位點。

該引物序列如下：

上游引物：CYP2C19-F 5'- CATCAGGATTGTAAGCACCCCC-3'

下游引物：CYP2C19-R 5'- TTTCTCAGGAAGCAAAAAACTTGG-3'

擴增片段大小為：61bp。擴增的核苷酸序列為：

三、HRM-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

分別以待測樣本DNA、重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒為模板，以上述引物CYP2C19-F和CYP2C19-R為擴增引物，采用如下述體系和反應(yīng)條件進行PCR擴增。

PCR體系：

Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl

引物F（10μM） 0.1μl

引物R（10μM） 0.1μl

模板（50ng/μl） 0.5μl

ddH₂O 4.3μl

總體積 10μl。

其中引物采用CYP2C19-F和CYP2C19-R，HRM-PCR采用生工生物（上海）Green-2-Go qPCRMastermix試劑盒。HRM分析儀為百源基因ASA-9600實時熒光定量PCR儀。

PCR擴增程序：

94℃預(yù)變性3min；94℃變性10s；60℃退火/延伸20s；40個循環(huán)。

HRM分析：

94℃ 90s

60℃ 30sec

83-94℃收集數(shù)據(jù)，溫度上升速率為0.06℃/s。

四、結(jié)果分析

根據(jù)收集數(shù)據(jù)繪制高分辨率熔解曲線，根據(jù)重組陰性質(zhì)粒、重組陽性質(zhì)粒的熔解曲線判斷待測樣本CYP2C19基因SNP位點rs4986893的基因型：

與重組陰性質(zhì)粒的熔解曲線重合則CYP2C19基因SNP位點rs4986893的基因型為GG；

與重組陽性質(zhì)粒的熔解曲線重合則CYP2C19基因SNP位點rs4986893的基因型為AA；在重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒之間的則CYP2C19基因SNP位點rs4986893的基因型為GA。

五、HRM靈敏度實驗

將重組陽性質(zhì)粒和重組陰性質(zhì)粒均稀釋至50ng/μl，然后二者混合，以重組陽性質(zhì)粒占比例依次為50%、25%、12.5%、5%、2%和1%進行梯度稀釋，按照上述HRM-PCR反應(yīng)體系和參數(shù)進行擴增，分析突變檢出范圍，即靈敏度。

反應(yīng)體系如下：

Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl

引物F（10μM） 0.1μl

引物R（10μM） 0.1μl

模板（50ng/μl） 0.5μl

ddH₂O 4.3μl

總體積 10μl。

PCR擴增程序：

94℃預(yù)變性3min；94℃變性10s；60℃退火/延伸20s；40個循環(huán)；

HRM分析：

94℃ 90s

60℃ 30sec

83-94℃收集數(shù)據(jù)，溫度上升速率為0.06℃/s。

結(jié)果見圖1，實驗數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)陽性質(zhì)粒與陰性質(zhì)粒體積比分別為1:1、1:3、1:7、1:19、1:49和1:99時，均能檢測出陽性質(zhì)粒，所以本發(fā)明所用HRM檢測方法的靈敏度為1%。

實施例3 應(yīng)用本發(fā)明的檢測方法檢測樣本CYP2C19 rs4986893基因型

以實施例2步驟中的檢測試劑盒和檢測方法，對30例樣本進行HRM分析，與重組陽性質(zhì)粒和重組陰性質(zhì)粒熔解曲線對照比較，依此確定樣本中的突變類型，并根據(jù)HRM分析結(jié)果針對每種基因型隨機挑選1個樣本在生工生物（上海）進行Sanger測序驗證。

HRM分析結(jié)果參見表1和圖2，數(shù)據(jù)顯示30例樣本中CYP2C19基因rs4986893為G>A雜合突變型有7例，G>A純合突變型6例，其余16例為野生型。

Sanger測序結(jié)果參見圖3：其中a為樣本編號2的測序結(jié)果，b為樣本編號11的測序結(jié)果，c為樣本編號20的測序結(jié)果；Sanger測序結(jié)果與本發(fā)明方法檢測的結(jié)果完全一致。

表1應(yīng)用本發(fā)明的方法對樣本CYP2C19基因rs4986893的分析結(jié)果

實施例4 用于檢測CYP2C19基因SNP位點rs4986893基因型的試劑盒

本發(fā)明的用于檢測CYP2C19基因SNP位點rs4986893基因型的試劑盒包括以下組分：

（1）CYP2C19rs4986893標準品：重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒，按照實施例1中的方法制備；

（2）引物：該引物序列為：

上游引物：CYP2C19-F 5'- CATCAGGATTGTAAGCACCCCC-3'

下游引物：CYP2C19-R 5'- TTTCTCAGGAAGCAAAAAACTTGG-3'；

（3）含飽和熒光染料Eva Green的PCR擴增試劑。

應(yīng)用該試劑盒檢測CYP2C19基因SNP位點rs4986893基因型的方法與實施例2相同。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 蘇州百源基因技術(shù)有限公司

<120> 用于檢測CYP2C19基因SNP位點rs4986893基因型的試劑盒

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ataaagatca gcaatttctt aacttgatgg aaaaattgaa tgaaaacatc aggattgtaa 60

gcaccccctg gatccaggta aggccaagtt ttttgcttcc tgagaaacca cttacagtct 120

ttttttctgg gaaatccaaa attctatatt gaccaagccc tgaagtacat ttttgaatac 180

tacagtcttg cctagacagc 200

<210> 2

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ataaagatca gcaatttctt aacttgatgg aaaaattgaa tgaaaacatc aggattgtaa 60

gcaccccctg aatccaggta aggccaagtt ttttgcttcc tgagaaacca cttacagtct 120

ttttttctgg gaaatccaaa attctatatt gaccaagccc tgaagtacat ttttgaatac 180

tacagtcttg cctagacagc 200

<210> 3

<211> 144

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatcagcaat ttcttaactt gatggaaaaa ttgaatgaaa acatcaggat tgtaagcacc 60

ccctggatcc aggtaaggcc aagttttttg cttcctgaga aaccacttac agtctttttt 120

tctgggaaat ccaaaattct atat 144

<210> 4

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catcaggatt gtaagcaccc cctggatcca ggtaaggcca agttttttgc ttcctgagaa 60

a 61