本發(fā)明涉及酰胺酶PCR領(lǐng)域，具體涉及一種酰胺酶PCR的方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)代工業(yè)產(chǎn)生大量的酰胺類物質(zhì)。據(jù)報(bào)道丙烯酰胺的年需求量從1999年內(nèi)的1.79億磅增加到2003年的2.05億磅，而且其年需求量仍在逐年增加。而酰胺類物質(zhì)的排放量則隨著工業(yè)需求量的增加而增加。然而，酰胺類物質(zhì)對(duì)人體均具有毒性，如丙烯酰胺對(duì)動(dòng)物和人類的毒性作用主要表現(xiàn)在對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用，其中對(duì)末梢神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用尤其明顯，對(duì)中樞神經(jīng)的毒性作用也有報(bào)道。因此，對(duì)酰胺類工業(yè)廢水的處理意義重大且刻不容緩。目前對(duì)于酰胺類物質(zhì)處理方法有內(nèi)電解、高級(jí)氧化、水解酸化等技術(shù)。事實(shí)上，自然界中存在一些植物和微生物可降解酰胺，酶催化的反應(yīng)具有高效、作用條件溫和的特點(diǎn)。但是由于原生植物、微生物中酶的含量很低，提取原生植物和微生物的酶十分困難，并且價(jià)格高昂導(dǎo)致成本高，不利于工業(yè)化處理。而采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造大腸桿菌等，使酰胺酶高效表達(dá)，則能大大降低酶的價(jià)格，便于酰胺類物質(zhì)污染的治理。

由于PCR是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的第一步，而實(shí)驗(yàn)條件對(duì)于PCR的進(jìn)行至關(guān)重要，尤其是對(duì)于G-C含量高的DNA片段?，F(xiàn)有技術(shù)中已有采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化PCR反應(yīng)條件的報(bào)道，但其運(yùn)算繁雜，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)，不利于整個(gè)試驗(yàn)操作的連續(xù)進(jìn)行。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種酰胺酶PCR的方法，旨在對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，以解決現(xiàn)有技術(shù)中優(yōu)化PCR反應(yīng)條件運(yùn)算繁雜，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)，不利于整個(gè)試驗(yàn)操作連續(xù)進(jìn)行的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種酰胺酶PCR的方法，其中，包括以下步驟：

A、在PCR反應(yīng)管中加入模板DNA 0.4 uL、5*快速高保真PCR 緩沖溶液2 uL、 20*快速 PCR 增強(qiáng)劑0.5 uL、引物1 0.3 uL、引物2 0.3 uL、DMSO 0.6 uL、快速高保真聚合酶0.2 uL、水5.7 uL，組成10 uL反應(yīng)體系；

其中，所述引物1與所述引物2之和為反應(yīng)體系的總引物量；

B、升溫至95℃，保持2min，95℃ 下DNA 變性 ，保持30s，然后于56℃下退火20 s，最后于72℃ 下引物延伸，保持2min；如此進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，于72℃下保持10min，最后于12℃保存樣品。

所述的酰胺酶PCR的方法，其中，還包括：

C、量取2.5 uL樣品稀釋至15uL，然后取7uL進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，并于凝膠成像系統(tǒng)成像，保存結(jié)果。

所述的酰胺酶PCR的方法，其中，所述所述模板DNA 為稀有海洋放線菌Salinispora arenicola。

所述的酰胺酶PCR的方法，其中，

所述引物1的序列為：

Salinispora arenicola CNS-205-L: 5'GGGCATATGGCGGTGCAGGACATCA 3' (NdeI)；

所述引物2的序列為：

Salinispora arenicola CNS-205-R: 5'CAGGAATTCCAGTTTCGTCATGCCC 3'(EcoRI)。

所述的酰胺酶PCR的方法，其中，所述反應(yīng)在型號(hào)為Bio-rad伯樂T100型的PCR儀中進(jìn)行。

所述的酰胺酶PCR的方法，其中，所述電泳實(shí)驗(yàn)電壓為60V，電泳時(shí)間為1h。

有益效果：本發(fā)明采用簡便的酰胺酶PCR的方法，操作簡單，可參考性強(qiáng)，對(duì)于快速獲得較佳PCR的條件具有很強(qiáng)的可操作性。此外，對(duì)于G-C堿基對(duì)含量較高的放線菌的PCR條件的探究也具有較高的參考價(jià)值，且經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證所述酰胺酶PCR的方法能大大提高目標(biāo)條帶擴(kuò)增量，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述的酰胺酶PCR的方法中不同反應(yīng)體系的電泳結(jié)果。

圖2為本發(fā)明所述的酰胺酶PCR的方法所得產(chǎn)物的電泳結(jié)果。

圖3為本發(fā)明所述的酰胺酶PCR的方法所得產(chǎn)物的梯度倍數(shù)稀釋電泳結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種酰胺酶PCR的方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明提供了一種酰胺酶PCR的方法，所述PCR為Polymease Chain Reaction (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的縮寫，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。PCR利用DNA在體外95℃時(shí)變性成為單鏈，低溫 (常在60°C左右)時(shí)引物與單鏈然后按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度(72°C左右)，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈。

本發(fā)明中采用的模板DNA為稀有海洋放線菌Salinispora arenicola，引物1的序列為：Salinispora arenicola CNS-205-L: 5'GGGCATATGGCGGTGCAGGACATCA 3' (NdeI)，引物2的序列為：Salinispora arenicola CNS-205-R: 5'CAGGAATTCCAGTTTCGTCATGCCC 3'(EcoRI)，且所述引物1與所述引物2之和為反應(yīng)體系的引物總量。本發(fā)明所述酰胺酶PCR的方法，包括以下步驟：

（一）在PCR反應(yīng)管中加入模板DNA （Template ）0.4 uL、5*快速高保真PCR 緩沖溶液（5*FAST HiFidelity PCR Buffer）2 uL、 20*快速 PCR 增強(qiáng)劑（20* FAST PCR Enhancer ）0.5 uL、引物1 （Primer 1）0.3 uL、引物2 （Primer 2）0.3 uL、DMSO（二甲基亞砜） 0.6 uL、快速高保真聚合酶（FAST HiFidelity polymerase）0.2 uL、水5.7 uL，組成10 uL反應(yīng)體系；其中，所述引物1與所述引物2比例為1:1，所述引物1與所述引物2之和為反應(yīng)體系的引物總量，即10 uL反應(yīng)體系中的引物總量為0.6 uL，所述引物1與所述引物2各加0.3 uL。另外，5*、20*分別表示該試劑占反應(yīng)體系的5‰、20‰，但本實(shí)驗(yàn)加樣時(shí)做了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。以上試劑均購自天根生化科技(北京)有限公司；

（二）加樣完成后，將反應(yīng)管放置于PCR儀，其中，所述PCR儀采用型號(hào)為Bio-rad伯樂T100型?；诰酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)而制造的PCR儀是一款溫控設(shè)備，能在DNA 變性溫度、復(fù)性溫度、延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。設(shè)置PCR儀，使其按照以下程序進(jìn)行：升溫至95℃，保持2min，95℃ 下DNA 變性 ，保持30s，然后于56℃下退火20 s，最后于72℃ 下引物延伸，保持2min；如此進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，于72℃下保持10min，最后于12℃保存樣品；

（三）為了驗(yàn)證以上條件下所得樣品的品質(zhì)，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。具體為：量取2.5 uL樣品稀釋至15uL，然后取7uL進(jìn)行電泳，并于凝膠成像系統(tǒng)成像，保存結(jié)果。

當(dāng)然，本發(fā)明所述的酰胺酶PCR的方法是經(jīng)大量的實(shí)驗(yàn)探究結(jié)合理論分析所得到，下面以基于正交試驗(yàn)法對(duì)酰胺酶PCR的方法的探究過程為例進(jìn)行說明。

正交試驗(yàn)法是利用排列整齊的表，即正交表來對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行整體設(shè)計(jì)、綜合比較、統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)現(xiàn)通過少量的實(shí)驗(yàn)次數(shù)找到較好的生產(chǎn)條件，以達(dá)到最高生產(chǎn)工藝效果。正交表能夠在因素變化范圍內(nèi)均衡抽樣，使每次試驗(yàn)都具有較強(qiáng)的代表性，由于正交表具備均衡分散的特點(diǎn)，保證了全面實(shí)驗(yàn)的要求，這些試驗(yàn)往往能夠較好或更好的達(dá)到實(shí)驗(yàn)的目的。具體實(shí)驗(yàn)過程如下：

1、試劑

模板DNA：稀有海洋放線菌Salinispora arenicola

引物序列1：

Salinispora arenicolaCNS-205-L:5'GGGCATATGGCGGTGCAGGACATCA 3' (NdeI)

引物序列2：

Salinispora arenicola CNS-205-R: 5' CAGGAATTCCAGTTTCGTCATGCCC 3'(EcoRI)。其中，所述模板DNA是以稀有海洋放線菌Salinispora arenicola的總DNA作為研究材料，所述引物1和所述引物2由金斯瑞生物科技有限公司合成。

2、試驗(yàn)過程

選取影響PCR反應(yīng)結(jié)果的4個(gè)重要因素及其各3個(gè)量化水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并選用L⁹（3⁴）正交表。所述4個(gè)因素是指引物總量、DMSO用量、退火溫度和退火時(shí)間，所述引物總量為引物1和引物2之和，所述引物1和引物2體積比為1:1。將影響因素-水平表示為表1，將根據(jù)探究反應(yīng)體系的實(shí)驗(yàn)序號(hào)與4個(gè)影響因素的3個(gè)量化水平對(duì)應(yīng)關(guān)系的L₉（3⁴）正交表示為表2。

依照表1和表2準(zhǔn)備9個(gè)PCR反應(yīng)管，并標(biāo)記實(shí)驗(yàn)序號(hào)1-9，按照10 uL反應(yīng)體系一一加樣，其中，9個(gè)反應(yīng)體系可以概括為：模板DNA：0.4uL; 5*快速高保真PCR 緩沖溶液：2uL; 20*快速 PCR 增強(qiáng)劑：0.5uL; 引物1：B uL; 引物2： B uL；DMSO ：A uL；H2O ：(6.9-A-2B)uL；快速高保真聚合酶：0.2uL。（例如，實(shí)驗(yàn)序號(hào)為1的反應(yīng)體系，加入模板DNA：0.4uL; 5*快速高保真PCR 緩沖溶液：2uL; 20*快速 PCR 增強(qiáng)劑：0.5uL; 引物1：0.2 uL; 引物2： 0.2 uL；DMSO ：0.2 uL；則水為6.9-0.2-2*0.2=6.1uL。）

加樣完成后，設(shè)置設(shè)置PCR儀，使其按照以下程序進(jìn)行：升溫至95℃，保持2min；95℃ 下DNA 變性 ，保持30s，然后于56℃下退火20 s，最后于72℃ 下引物延伸，2min；30個(gè)循環(huán)后，于72℃下保持10min，最后于12℃保存樣品，其中，D s中D代表數(shù)字，即退火的時(shí)間，s是秒的縮寫。

3、電泳

電泳實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證酰胺酶PCR的方法所得樣品的品質(zhì)。首先，取樣，分別取9個(gè)反應(yīng)體系所得的樣品各2.5uL，加水稀釋至15uL，所述稀釋液的PCR樣品含量為16.7%，然后上樣7uL于瓊脂糖凝膠，在60V電壓下進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，電泳1h。完成試驗(yàn)后，取下凝膠放在凝膠成像系統(tǒng)成像，保存結(jié)果。

進(jìn)一步地，所述電泳實(shí)驗(yàn)的具體操作如下：

（1）安裝電泳槽

將有機(jī)玻璃的電泳凝膠床洗凈，晾干，用膠帶將兩端的開口封好，放在水平的工作臺(tái)上，插上樣品梳；

（2）瓊脂糖凝膠的制備

稱取瓊脂糖0.8g溶解在100ml電泳緩沖液中，置微波爐中加熱至完全溶化（無需加熱至沸騰），取出搖勻；

（3）灌膠

將冷卻到60℃的瓊脂糖溶液輕輕倒入電泳槽水平板上；

（4）待瓊脂糖膠凝固后，在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，然后拔出梳子；

（5）加樣

量取PCR樣品2.5ul，加水12.5ul混勻，然后取7ul樣品，將所述樣品與加樣緩沖液溴酚藍(lán)按4：1混勻后，用微量移液器將混合液加到樣品槽中，并記錄樣品的點(diǎn)樣次序和加樣量；

（6）電泳

安裝好電極導(dǎo)線，點(diǎn)樣孔一端接負(fù)極，另一端接正極，打開電源，調(diào)電壓至60V，電泳1h，當(dāng)溴酚藍(lán)移到距凝膠前沿1-2cm時(shí)，停止電泳；

（7）染色和觀察

取出凝膠，放在含有溴化乙錠的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外燈下觀察，有橙紅色熒光條帶的位置，即為DNA條帶，或在紫外燈下照相記錄電泳圖譜。

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果方便分析，以擴(kuò)增條帶依目標(biāo)條帶（1500bp）的清晰度（70分；記為A）、雜帶擴(kuò)增數(shù)量（30分；記為B）為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。A分?jǐn)?shù)越高表示目標(biāo)條帶亮度越強(qiáng)，越清晰；B分?jǐn)?shù)越高則表示擴(kuò)增條帶越淺，雜帶擴(kuò)增數(shù)量越少。正交試驗(yàn)法探究酰胺酶PCR的方法的電泳圖像如附圖1，結(jié)合附圖3所得出的評(píng)分結(jié)果列于表3。其中，所述評(píng)分方法參照的文獻(xiàn)包括：（劉順枝,鄧劍鋒,田長恩等.基因工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中PCR反應(yīng)條件的正交優(yōu)化[J]，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(24):12276-12278；）及（何正文,劉運(yùn)生,陳立華等.正交設(shè)計(jì)直觀分析法優(yōu)化PCR條件[J]，湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1998,23(4):403-404）等。

如圖1所示，從右起，分別是試驗(yàn)號(hào)1、2、3、4、5、6、7、8、9，M是作為對(duì)照的標(biāo)尺。從圖1可以看出，實(shí)驗(yàn)序號(hào)1、2、4目的條帶不清晰，因此，表3中A項(xiàng)評(píng)分較低；實(shí)驗(yàn)序號(hào)5、6、9目的條帶較為清晰，因此，表3中A項(xiàng)評(píng)分較高，實(shí)驗(yàn)序號(hào)5、6、9雜帶較淺或數(shù)量較少，因此，表3中評(píng)分較高；而實(shí)驗(yàn)序號(hào)3、7、8雜帶較多且顏色亮，因此，表3中評(píng)分較低。

因此，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果分析，即得出10 uL反應(yīng)體系的較佳反應(yīng)條件為DMSO 0.6uL，引物總量0.6uL，退火溫度56℃，退火時(shí)間20s。將正交試驗(yàn)結(jié)果列于表4，

表4

需要說明的是，所述表4結(jié)合表3的數(shù)據(jù)進(jìn)一步整理所得。其中，T1為該項(xiàng)的第一個(gè)水平的分?jǐn)?shù)相加之和，T2為該項(xiàng)的第二個(gè)水平分?jǐn)?shù)相加之和，T3為該項(xiàng)第三個(gè)水平分?jǐn)?shù)相加之和（所述水平表如表1，所述得分表如表3）。、、分別為T1、T2、T3的平均數(shù)，比較、、即可得出不探求交互因素的情況下該因素的最佳水平，得分最高的為該水平的最好條件。因此，將各個(gè)因素的最佳水平組合，即得出本發(fā)明所提供的10 uL反應(yīng)體系中的較佳反應(yīng)條件為DMSO 0.6uL，引物總量0.6uL，退火溫度56℃，退火時(shí)間20s。

進(jìn)一步地，將本發(fā)明所述的酰胺酶PCR的方法所得的樣品按照以上正交試驗(yàn)法的操作步驟進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，所得出的電泳圖像如圖2所示。具體為，將本發(fā)明中所述樣品2.5uL加水稀釋至15uL，然后上樣7uL于瓊脂糖凝膠，在60V電壓下進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，電泳1h。參照?qǐng)D1和圖2可以看出，本發(fā)明所述10uL反應(yīng)體系所得樣品的條帶較圖1中9個(gè)反應(yīng)體系的各個(gè)正交實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)條件組合都亮，證明擴(kuò)增效率較正交實(shí)驗(yàn)中各個(gè)反應(yīng)條件組合都高。

進(jìn)一步地，為了更好地呈現(xiàn)本發(fā)明所述的酰胺酶PCR的方法，進(jìn)行了梯度稀釋的電泳試驗(yàn)。具體的，將本發(fā)明所得的PCR樣品按照2.5uL加水稀釋至15uL，記為第一次稀釋液，然后分別取第一次稀釋液1、3、5、7uL再次稀釋至10uL，再分別取7uL上樣至瓊脂糖凝膠泳道1、2、3、4，而泳道5則取第一次稀釋液3uL上樣，在60V電壓下電泳1小時(shí)。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)得到圖3所示的結(jié)果。如圖3所示，從右起，分別是試驗(yàn)號(hào)1、2、3、4、5。1000-2000bp中間的1500bp為目標(biāo)條帶，圖3中3號(hào)的目標(biāo)條帶與圖1中目標(biāo)條帶最亮的9號(hào)亮度相似，甚至更亮。圖1中9號(hào)PCR樣品含量為16.7%，圖3中3號(hào)PCR樣品含量為8.35%，兩者擴(kuò)增效果相似，說明本發(fā)明中經(jīng)正交試驗(yàn)法優(yōu)化后的反應(yīng)條件擴(kuò)增效率至少為各條件隨機(jī)組合的2倍，而梯度試驗(yàn)結(jié)果表明按不同的梯度倍數(shù)稀釋后得到的條帶亮度仍和原來相似，間接說明基于正交試驗(yàn)法優(yōu)化得出的酰胺酶PCR最佳條件有效。

現(xiàn)在有技術(shù)中，PCR反應(yīng)最大的難題就是PCR最優(yōu)條件的探索，尤其是G-C含量高的樣品，難度更加大，最佳條件難以確定，耗時(shí)長而影響后續(xù)一系列實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)小組曾對(duì)所述菌株材料的PCR最優(yōu)條件進(jìn)行了大量的研究探索，但花費(fèi)時(shí)間漫長仍未摸索出理想的條件?，F(xiàn)有技術(shù)中也有對(duì)此作出詳細(xì)探索的報(bào)道，如（劉順枝,鄧劍鋒,田長恩等.基因工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中PCR反應(yīng)條件的正交優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(24):12276-12278），但其數(shù)理運(yùn)算過多，實(shí)驗(yàn)繁復(fù)，不利于實(shí)際操作；也有研究者曾探究簡便的正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化PCR的方法，如（何正文,劉運(yùn)生,陳立華等.正交設(shè)計(jì)直觀分析法優(yōu)化PCR條件[J].湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1998,23(4):403-404），但其沒有對(duì)PCR結(jié)果影響更大的退火時(shí)間和退火溫度進(jìn)行探究。

本實(shí)驗(yàn)采用L₉（3⁴）正交實(shí)驗(yàn)法探索Salinispora arenicola菌株的最佳PCR條件，操作簡便，對(duì)快速找到較佳PCR條件有相當(dāng)強(qiáng)的可操作性，對(duì)GC堿基對(duì)含量較高的放線菌的PCR很有參考價(jià)值。本發(fā)明中的酰胺酶PCR方法的目標(biāo)條帶擴(kuò)增量較正交實(shí)驗(yàn)中的各條件組合都高，證明基于正交實(shí)驗(yàn)探究所得的結(jié)果相當(dāng)可靠。

但同時(shí)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)存在一定局限性，如不能說明各因素的交互作用，難以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差等。在探究PCR各項(xiàng)條件的交互關(guān)系時(shí)，可采用更大的正交試驗(yàn)表，更細(xì)致地設(shè)定梯度，設(shè)置重復(fù)等。但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中，可以通過L934正交實(shí)驗(yàn)，快速找到最適條件以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展。

綜上所述，本發(fā)明所述的酰胺酶PCR的方法，具體為：在PCR反應(yīng)管中加入模板DNA 0.4 uL、5*快速高保真PCR 緩沖溶液2 uL、 20*快速 PCR 增強(qiáng)劑0.5 uL、引物1 0.3 uL、引物2 0.3 uL、DMSO 0.6 uL、快速高保真聚合酶0.2 uL、水5.7 uL，組成10 uL反應(yīng)體系，升溫至95℃，保持2min，95℃ 下DNA 變性 ，保持30s，然后于56℃下退火20 s，最后于72℃ 下引物延伸，保持2min；循環(huán)30次，于72℃下保持10min，最后于12℃保存樣品，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明操作簡單，可參考性強(qiáng)，對(duì)于快速獲得較佳PCR的條件具有很強(qiáng)的可操作性。此外，對(duì)于G-C堿基對(duì)含量較高的放線菌的PCR條件的探究也具有較高的參考價(jià)值，且經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證所述酰胺酶PCR的方法能大大提高目標(biāo)條帶擴(kuò)增量，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。