本發(fā)明涉及生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及生產(chǎn)L-亮氨酸菌株和生產(chǎn)L-亮氨酸的方法。
背景技術(shù)：
：L-亮氨酸即α-氨基-γ-甲基戊酸或α-氨基異己酸，屬于支鏈氨基酸，是人體必須依賴外源供給的八大必需氨基酸之一。L-亮氨酸是亮氨酸的左旋體，在醫(yī)藥、食品、化妝品、及飼料等行業(yè)中具有非常廣泛的應(yīng)用。在L-亮氨酸的生產(chǎn)中常用提取法、化學(xué)合成法、酶催化法和微生物發(fā)酵法。其中，微生物發(fā)酵法以其環(huán)保、條件溫和、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)成為L-亮氨酸生產(chǎn)的主要方法。在L-亮氨酸生產(chǎn)行業(yè)中日本企業(yè)占主導(dǎo)地位，尤其是日本味之素公司，其在亮氨酸生產(chǎn)中具有非常明顯的優(yōu)勢。目前，隨著生物學(xué)的不斷發(fā)展進(jìn)步，L-亮氨酸在棒桿菌屬中的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制已掌握清楚。谷氨酸棒桿菌模式菌株ATCC13869基因組測序的完成及谷氨酸棒桿菌基因操作技術(shù)的不斷完善，使得通過基因工程手段對谷氨酸棒桿菌進(jìn)行改造成為現(xiàn)實(shí)。研究表明，在L-亮氨酸的合成途徑中，存在多個關(guān)鍵酶，其中，leuA編碼α-異丙基蘋果酸合酶，催化α-酮異戊酸合成α-異丙基蘋果酸，是L-亮氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶，受終產(chǎn)物L(fēng)-亮氨酸的反饋抑制。ilvBN編碼乙酰羥酸合酶，受L-亮氨酸、L-纈氨酸及L-異亮氨酸的反饋抑制，其中ilvB編碼乙酰羥酸合酶的大亞基，起催化作用。解除反饋抑制有助于提高L-亮氨酸等支鏈氨基酸的產(chǎn)量。現(xiàn)有的亮氨酸生物合成菌株和方法已經(jīng)逐漸不能滿足日益加大的市場需求，因此，利用生物工程方法，進(jìn)一步開發(fā)能夠大量生成亮氨酸的菌株和生產(chǎn)方法成為了研究的熱點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供生產(chǎn)L-亮氨酸菌株和生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，本發(fā)明提供的菌株產(chǎn)亮氨酸的量可達(dá)4.7g/L。本發(fā)明提供了突變的leuA蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明提供了編碼突變的leuA蛋白的DNA分子。編碼突變的leuA蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本發(fā)明還提供了突變的ilvB蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。本發(fā)明提供了編碼突變的ilvB蛋白的DNA分子。編碼突變的ilvB蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。所述突變是指遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，其可為點(diǎn)突變或片段突變。具體為氨基酸或堿基的添加、缺失或替換。其為紫外誘變后以亞硝基胍誘變獲得。紫外誘變的條件為紫外15W，30cm，20分鐘；亞硝基胍誘變的條件為0.5mg/mL，33℃，30分鐘；誘變后，篩選對4-氮雜亮氨酸最具有抗性的突變菌株。培養(yǎng)基中，4-氮雜亮氨酸的濃度為1g/L。含有1g/L的4-氮雜亮氨酸瓊脂板基本培養(yǎng)基中還包括：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO42.0g/L、MgSO4·7H2O0.4g/L、CaCl2·2H2O0.01g/L、FeSO4·7H2O0.02g/L、Na2HPO4·12H2O1.5g/L、生物素0.02mg/L、維生素B10.02mg/L、ZnSO40.01g/L、MnSO40.01g/L、KH2PO41.5g/L、瓊脂18g/L。pH值為7.0～7.3。leuA編碼α-異丙基蘋果酸合酶，催化α-酮異戊酸合成α-異丙基蘋果酸，是L-亮氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶。本發(fā)明中l(wèi)euA蛋白的突變是指在野生型leuA蛋白的氨基酸序列中發(fā)生突變，具體的：突變的leuA蛋白為，天冬氨酸取代野生型leuA蛋白的序列中561位的甘氨酸。實(shí)驗(yàn)表明，leuA蛋白中發(fā)生G561D突變后，L-亮氨酸合成途徑中的反饋機(jī)制得到解除，L-亮氨酸的產(chǎn)量得到提高。ilvBN編碼乙酰羥酸合酶，受L-亮氨酸、L-纈氨酸及L-異亮氨酸的反饋抑制，其中ilvB編碼乙酰羥酸合酶的大亞基，起催化作用。本發(fā)明中ilvB蛋白的突變是指在野生型ilvB蛋白的氨基酸序列中發(fā)生突變，具體的：突變的ilvB蛋白為，絲氨酸取代野生型ilvB蛋白的序列中235位的甘氨酸。實(shí)驗(yàn)表明，ilvB蛋白中發(fā)生G235S突變后，L-亮氨酸合成途徑中的反饋機(jī)制得到解除，L-亮氨酸的產(chǎn)量得到提高。本發(fā)明提供了一種重組菌株，其表達(dá)編碼突變的leuA蛋白的DNA分子。這一重組菌株的起始菌株為谷氨酸棒桿菌。表達(dá)編碼突變的leuA蛋白的DNA分子的重組菌株在生產(chǎn)L-亮氨酸中的應(yīng)用。該菌株的構(gòu)建方法為：以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，拼接PCR獲得起始表達(dá)編碼突變的leuA蛋白的DNA分子，構(gòu)建入質(zhì)粒載體后，電穿孔法轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌，獲得重組菌株。所述谷氨酸棒桿菌為ATCC13869；其感受態(tài)細(xì)胞的獲得方式參照谷棒經(jīng)典方法。獲得起始表達(dá)編碼突變的leuA蛋白的DNA分子的方法為：采用SEQIDNO:5～6所示引物對和SEQIDNO:7～8所示引物對分別對谷氨酸棒桿菌ATCC13869的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得上游片段(leuA-up)和下游片段(leuA-dn)；以leuA-up、leuA-dn兩片段混合物為模板，以SEQIDNO:5所示引物和SEQIDNO:8所示引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得起始表達(dá)編碼突變的leuA蛋白的DNA分子(SEQIDNO:2)。所述質(zhì)粒載體為pK18mobsacB。所述構(gòu)建入質(zhì)粒載體的酶切位點(diǎn)為XbaI、SalI。構(gòu)得載體記為pK18mobsacB-leuAG561D。表達(dá)編碼突變的leuA蛋白的DNA分子的重組菌株獲得后，參照谷棒經(jīng)典方法制備其感受態(tài)細(xì)胞。本發(fā)明提供了一種重組菌株，其表達(dá)編碼突變的ilvB蛋白的DNA分子。其起始菌株為谷氨酸棒桿菌。本發(fā)明提供的重組菌株在生產(chǎn)L-亮氨酸中的應(yīng)用。該菌株的構(gòu)建方法為：以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，拼接PCR獲得起始表達(dá)編碼突變的ilvB蛋白的DNA分子，構(gòu)建入質(zhì)粒載體后，電穿孔法轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌，獲得重組菌株。所述谷氨酸棒桿菌為ATCC13869；其感受態(tài)細(xì)胞的獲得方式參照谷棒經(jīng)典方法。獲得起始表達(dá)編碼突變的ilvB蛋白的DNA分子的方法為：采用SEQIDNO:9～10所示引物對和SEQIDNO:11～12所示引物對分別對谷氨酸棒桿菌ATCC13869的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得上游片段(ilvB-up)和下游片段(ilvB-dn)；以ilvB-up、ilvB-dn兩片段混合物為模板，以SEQIDNO:9所示引物和SEQIDNO:12所示引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得起始表達(dá)編碼突變的ilvB蛋白的DNA分子(SEQIDNO:4)。所述質(zhì)粒載體為pK18mobsacB。所述構(gòu)建入質(zhì)粒載體的酶切位點(diǎn)為XbaI、SalI。構(gòu)得載體記為pK18mobsacB-ilvBG235S。表達(dá)編碼突變的ilvB蛋白的DNA分子的重組菌株獲得后，參照谷棒經(jīng)典方法制備其感受態(tài)細(xì)胞。本發(fā)明提供了一種重組菌株，其表達(dá)編碼突變的leuA蛋白的DNA分子，且表達(dá)編碼突變的ilvB蛋白的DNA分子。其起始菌株為谷氨酸棒桿菌。本發(fā)明提供的重組菌株在生產(chǎn)L-亮氨酸中的應(yīng)用。該菌株的構(gòu)建方法為：以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，拼接PCR獲得起始表達(dá)編碼突變的leuA蛋白的DNA分子，構(gòu)建入質(zhì)粒載體，電穿孔法轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌，獲得leuAG561D重組菌株；所述谷氨酸棒桿菌為ATCC13869；感受態(tài)細(xì)胞的獲得方式參照谷棒經(jīng)典方法。以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，拼接PCR獲得起始表達(dá)編碼突變的ilvB蛋白的DNA分子，構(gòu)建入質(zhì)粒載體，電穿孔法轉(zhuǎn)化入leuAG561D重組菌株，獲得ilvBG235S突變和leuAG561D突變的重組菌株?；蛘撸阂怨劝彼岚魲U菌基因組為模板，拼接PCR獲得起始表達(dá)編碼突變的ilvB蛋白的DNA分子，構(gòu)建入質(zhì)粒載體，電穿孔法轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌，獲得ilvBG235S重組菌株；以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，拼接PCR獲得起始表達(dá)編碼突變的leuA蛋白的DNA分子，構(gòu)建入質(zhì)粒載體，電穿孔法轉(zhuǎn)化入ilvBG235S重組菌株，獲得ilvBG235S突變和leuAG561D突變的重組菌株。其起始菌株為谷氨酸棒桿菌，優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌ATCC13869。優(yōu)選的，本發(fā)明提供的重組菌株的保藏編號為CGMCCNO.13408。本發(fā)明提供的重組菌株在生產(chǎn)L-亮氨酸中的應(yīng)用。上述菌株的投建方法中，電穿孔轉(zhuǎn)化后，細(xì)胞經(jīng)過選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)和普通液體腦心浸液培養(yǎng)，獲得重組菌株。所述選擇性培養(yǎng)基中，含有濃度為15mg/L的卡那霉素；培養(yǎng)的溫度為33℃，倒置培養(yǎng)。所述普通液體腦心浸液培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為33℃，回轉(zhuǎn)搖床220rpm振蕩培養(yǎng)。在選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程中，突變基因由于同源性被插入到染色體中。液體腦心浸液培養(yǎng)過程中，轉(zhuǎn)化子發(fā)生第二次重組，通過基因交換將載體序列從基因組中除去。普通液體腦心浸液培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物做連續(xù)梯度稀釋(10-2連續(xù)稀釋至10-4)，稀釋液涂布在含有10％蔗糖的普通固體腦心浸液培養(yǎng)基上，33℃靜置培養(yǎng)48h，獲得目的重組菌株蔗糖培養(yǎng)基上長出的菌株在其基因組中不攜帶插入的載體序列。通過PCR擴(kuò)增目的序列，和核苷酸測序分析，鑒定重組菌株。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，發(fā)酵本發(fā)明提供的重組菌株。本發(fā)明中，發(fā)酵的溫度為33℃、搖床110rpm，發(fā)酵培養(yǎng)基包括水和：本發(fā)明中，發(fā)酵前還經(jīng)過活化的步驟。所述活化的培養(yǎng)基包括水和：活化后種子液的接種量為10％。本發(fā)明以紫外線和亞硝基胍對谷氨酸棒桿菌進(jìn)行誘變，獲得了兩個有利于L-亮氨酸產(chǎn)生的關(guān)鍵突變leuAG561D和ilvBG235S，研究表明，leuAG561D和/或ilvBG235S突變條件下，L-亮氨酸的合成途徑中的反饋抑制被解除，L-亮氨酸的產(chǎn)量得到大幅提高，獲得了能夠大量產(chǎn)生L-亮氨酸的菌株，保藏編號為CGMCCNO.13408，該菌株能夠?qū)崿F(xiàn)發(fā)酵過程中L-亮氨酸的高效積累，L-亮氨酸可達(dá)4.7g/L。生物保藏說明生物材料MHZ-1200-5，分類命名：谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum，于2016年11月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNO.13408。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了生產(chǎn)L-亮氨酸菌株和生產(chǎn)L-亮氨酸的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明采用的試材皆為普通市售品，皆可于市場購得。本發(fā)明中涉及的基因名稱解釋如下：leuA：α-異丙基蘋果酸合酶；ilvB：乙酰羥酸合酶大亞基；以下實(shí)施例中使用的引物序列信息如表1所示：表1、引物序列信息下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1:制備具有亮氨酸類似物4-氮雜亮氨酸抗性的突變菌株ATCC13869菌株先用紫外15W，30cm，20分鐘進(jìn)行常規(guī)誘變處理，再用亞硝基胍(0.5mg/mL，33℃，30分鐘)進(jìn)行常規(guī)的誘變處理，然后涂布在含有1g/L的4-氮雜亮氨酸瓊脂板基本培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L、(NH4)2SO42.0g/L、MgSO4·7H2O0.4g/L、CaCl2·2H2O0.01g/L、FeSO4·7H2O0.02g/L、Na2HPO4·12H2O1.5g/L、生物素0.02mg/L、維生素B10.02mg/L、ZnSO40.01g/L、MnSO40.01g/L、KH2PO41.5g/L、瓊脂18g/L，pH7.0-7.3)，在33℃靜置2-6天后，挑選對4-氮雜亮氨酸最具有抗性的突變菌株MHZ-1200-1。將獲得的MHZ-1200-1在腦心浸液固體培養(yǎng)基上活化，33℃培養(yǎng)16-20h；將菌體從平板上刮下一環(huán)，接種于30mL的種子培養(yǎng)基中(葡萄糖20g/L、尿素5g/L、酵母粉10g/L、MgSO4·7H2O1.0g/L、豆粕水解液10g/L、HCl調(diào)pH4.0)，33℃轉(zhuǎn)速110rpm培養(yǎng)5-8h，OD562控制在1；2mL種子液轉(zhuǎn)接到20mL的發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖60g/L、(NH4)2SO425g/L、KH2PO42.0g/L、MgSO4·7H2O1.0g/L、豆粕水解液10g/L、CaCO330g/L、NaOH調(diào)pH7.0)，往復(fù)搖床33℃、110rpm發(fā)酵培養(yǎng)直至殘?zhí)呛谋M，測MHZ-1200-1發(fā)酵產(chǎn)L-亮氨酸結(jié)果見表2。表2、誘變菌株的L-亮氨酸生產(chǎn)組別菌株OD562L-亮氨酸(g/L)對照組ATCC1386954.70.05實(shí)驗(yàn)組MHZ-1200-150.63.8由表1可知，ATCC13869菌株發(fā)酵不產(chǎn)L-亮氨酸，誘變菌株MHZ-1200-1產(chǎn)L-亮氨酸，從無到有具有顯著進(jìn)步。利用比較基因組學(xué)分析誘變菌株MHZ-1200-1，發(fā)現(xiàn)其具有兩個關(guān)鍵突變leuAG561D和ilvBG235S發(fā)生。在L-亮氨酸的合成途徑中，leuA編碼α-異丙基蘋果酸合酶，催化α-酮異戊酸合成α-異丙基蘋果酸，是L-亮氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶，受終產(chǎn)物L(fēng)-亮氨酸的反饋抑制。ilvBN編碼乙酰羥酸合酶，受L-亮氨酸、L-纈氨酸及L-異亮氨酸的反饋抑制，其中ilvB編碼乙酰羥酸合酶的大亞基，起催化作用。這兩個位點(diǎn)的突變可能有助于解除了L-亮氨酸的合成途徑中反饋抑制。實(shí)施例2：重組質(zhì)粒pK18mobsacB-leuAG561D的構(gòu)建及在ATCC13869菌株中引leuAG561D突變以ATCC13869基因組為模板，用leuA-1f/leuA-1r引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到上游片段leuA-up；以ATCC13869基因組為模板，用leuA-2f/leuA-2r引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到下游片段leuA-dn。以leuA-up、leuA-dn兩片段的混合物為模板，leuA-1f/leuA-2r引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得leuAG561D突變目的片段。leuAG561D突變目的片段與pK18mobsacB載體用XbaI、SalI進(jìn)行雙酶切。將兩個酶切產(chǎn)物以T4DNALigase連接1h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1T1感受態(tài)細(xì)胞，得到重組質(zhì)粒pK18mobsacB-leuAG561D。按照C.glutamicumHandbook，Charpter23中的方法制備ATCC13869感受態(tài)，用電穿孔法將重組質(zhì)粒pK18mobsacB-leuAG561D轉(zhuǎn)化到該感受態(tài)細(xì)胞中，在含有15mg/L卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選一次重組轉(zhuǎn)化子，并將篩得的轉(zhuǎn)化子在普通液體腦心浸液培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為33℃、220rpm振蕩培養(yǎng)。在此培養(yǎng)的過程中，一次重組轉(zhuǎn)化子發(fā)生二次重組，通過基因交換將載體序列從基因組中除去。連續(xù)梯度稀釋培養(yǎng)物10-2至10-4，稀釋液涂布在含有10％蔗糖的普通固體腦心浸液培養(yǎng)基上，33℃倒置培養(yǎng)48h。此時，在蔗糖培養(yǎng)基上生長的菌株基因組中不攜帶插入載體序列。利用Pid-leuAG561D/leuA-2r兩個引物PCR擴(kuò)增及核苷酸測序分析，獲得leuAG561D突變菌株，命名MHZ-1200-2，按實(shí)施例1中方法發(fā)酵測產(chǎn)酸，結(jié)果見表3。表3、leuAG561D突變菌株的L-亮氨酸生產(chǎn)組別菌株OD562L-亮氨酸(g/L)對照組ATCC1386957.30.08實(shí)驗(yàn)組MHZ-1200-253.32.3由表3可知，ATCC13869菌株發(fā)酵不產(chǎn)L-亮氨酸，leuAG561D突變菌株具有生產(chǎn)L-亮氨酸的能力，leuAG561D突變有助于解除L-亮氨酸合成途徑中的反饋抑制。實(shí)施例3：重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ilvBG235S的構(gòu)建及在ATCC13869菌株中引ilvBG235S突變以ATCC13869基因組為模板，用ilvB-1f/ilvB-1r引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到上游片段ilvB-up；ATCC13869基因組為模板，用ilvB-2f/ilvB-2r引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到下游片段ilvB-dn。以ilvB-up、ilvB-dn兩片段的混合物為模板，ilvB-1f/ilvB-2r引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得ilvBG235S突變目的片段。ilvBG561D突變目的片段與pK18mobsacB載體用XbaI、SalI進(jìn)行雙酶切。將兩個酶切產(chǎn)物以T4DNALigase連接1h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1T1感受態(tài)細(xì)胞，得到重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ilvBG235S。按照C.glutamicumHandbook，Charpter23中的方法制備ATCC13869感受態(tài)，用電穿孔法將重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ilvBG235S轉(zhuǎn)化該感受態(tài)細(xì)胞，在含有15mg/L卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選一次重組轉(zhuǎn)化子，并將篩得的轉(zhuǎn)化子在普通液體腦心浸液培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為33℃、220rpm振蕩培養(yǎng)。在此培養(yǎng)的過程中，一次重組轉(zhuǎn)化子發(fā)生二次重組，通過基因交換將載體序列從基因組中除去。連續(xù)梯度稀釋培養(yǎng)物10-2至10-4，稀釋液涂布在含有10％蔗糖的普通固體腦心浸液培養(yǎng)基上，33℃倒置培養(yǎng)48h。此時，在蔗糖培養(yǎng)基上生長的菌株基因組中不攜帶插入載體序列。利用Pid-ilvBG235S/ilvB-2r兩個引物PCR擴(kuò)增及核苷酸測序分析，獲得ilvBG235S突變菌株，命名MHZ-1200-3，按實(shí)施例1中方法發(fā)酵測產(chǎn)酸，結(jié)果見表4。表4、ilvBG235S突變菌株的L-亮氨酸及支鏈氨基酸生產(chǎn)組別菌株OD562L-亮氨酸(g/L)L-異亮氨酸(g/L)L-纈氨酸(g/L)對照組ATCC1386954.30.10.050.08實(shí)驗(yàn)組MHZ-1200-352.42.11.71.9由表4可知，ATCC13869菌株發(fā)酵不產(chǎn)支鏈氨基酸L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸，經(jīng)過改造后的ilvBG235S突變菌株可產(chǎn)支鏈氨基酸L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-纈氨酸，從無到有，具有非常顯著的進(jìn)步，ilvBG235S突變有助于解除支鏈氨基酸合成途徑中的反饋抑制。實(shí)施例4：在MHZ-1200-2中引ilvBG235S突變按照C.glutamicumHandbook，Charpter23中的方法制備MHZ-1200-2感受態(tài)，用電穿孔法將重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ilvBG235S轉(zhuǎn)化該感受態(tài)細(xì)胞，在含有15mg/L卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選一次重組轉(zhuǎn)化子，并將篩得的轉(zhuǎn)化子在普通液體腦心浸液培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為33℃、220rpm振蕩培養(yǎng)。在此培養(yǎng)的過程中，一次重組轉(zhuǎn)化子發(fā)生二次重組，通過基因交換將載體序列從基因組中除去。連續(xù)梯度稀釋培養(yǎng)物10-2至10-4，稀釋液涂布在含有10％蔗糖的普通固體腦心浸液培養(yǎng)基上，33℃倒置培養(yǎng)48h。此時，在蔗糖培養(yǎng)基上生長的菌株基因組中不攜帶插入載體序列。利用Pid-ilvBG235S/ilvB-2r兩個引物PCR擴(kuò)增及核苷酸測序分析，獲得ilvBG235S突變菌株，命名MHZ-1200-5，按實(shí)施例1中方法發(fā)酵測產(chǎn)酸，結(jié)果見表5。表5、leuAG561D突變和ilvBG235S突變菌株的L-亮氨酸生產(chǎn)由表5可知，leuAG561D突變和ilvBG235S突變疊加菌株MHZ-1200-5的L-亮氨酸產(chǎn)量為4.7g/L，較leuAG561D突變菌株MHZ-1200-2的L-亮氨酸生產(chǎn)增加1.35倍，較ilvBG235S突變菌株MHZ-1200-3的L-亮氨酸生產(chǎn)增加約1.24倍。綜上所述，利用leuAG561D突變、ilvBG235S突變對菌株進(jìn)行改造，有助于增加支鏈氨基酸特別是L-亮氨酸的產(chǎn)量，對該菌株進(jìn)行生物保藏，保藏編號為CGMCCNO.13408。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司<120>生產(chǎn)L-亮氨酸的菌株和生產(chǎn)L-亮氨酸的方法<130>MP1623786<160>14<170>PatentInversion3.3<210>1<211>616<212>PRT<213>人工序列<400>1MetSerProAsnAspAlaPheIleSerAlaProAlaLysIleGluThr151015ProValGlyProArgAsnGluGlyGlnProAlaTrpAsnLysGlnArg202530GlySerSerMetProValAsnArgTyrMetProPheGluValGluVal354045GluAspIleSerLeuProAspArgThrTrpProAspLysLysIleThr505560ValAlaProGlnTrpCysAlaValAspLeuArgAspGlyAsnGlnAla65707580LeuIleAspProMetSerProGluArgLysArgArgMetPheGluLeu859095LeuValGlnMetGlyPheLysGluIleGluValGlyPheProSerAla100105110SerGlnThrAspPheAspPheValArgGluIleIleGluLysAspMet115120125IleProAspAspValThrIleGlnValLeuValGlnAlaArgGluHis130135140LeuIleArgArgThrPheGluAlaCysGluGlyAlaLysAsnValIle145150155160ValHisPheTyrAsnSerThrSerIleLeuGlnArgAsnValValPhe165170175ArgMetAspLysValGlnValLysLysLeuAlaThrAspAlaAlaGlu180185190LeuIleLysThrValAlaGlnAspTyrProAspThrAsnTrpArgTrp195200205GlnTyrSerProGluSerPheThrGlyThrGluValGluTyrAlaLys210215220GluValValAspAlaValValGluValMetAspProThrProGluAsn225230235240ProMetIleIleAsnLeuProSerThrValGluMetIleThrProAsn245250255ValTyrAlaAspSerIleGluTrpMetHisArgAsnLeuAsnArgArg260265270AspSerIleIleLeuSerLeuHisProHisAsnAspArgGlyThrGly275280285ValGlyAlaAlaGluLeuGlyTyrMetAlaGlyAlaAspArgIleGlu290295300GlyCysLeuPheGlyAsnGlyGluArgThrGlyAsnValCysLeuVal305310315320ThrLeuAlaLeuAsnMetLeuThrGlnGlyValAspProGlnLeuAsp325330335PheThrAspIleArgGlnIleArgSerThrValGluTyrCysAsnGln340345350LeuArgValProGluArgHisProTyrGlyGlyAspLeuValPheThr355360365AlaPheSerGlySerHisGlnAspAlaValAsnLysGlyLeuAspAla370375380MetAlaAlaLysValGlnProGlyAlaSerSerThrGluValSerTrp385390395400GluGlnLeuArgAspThrGluTrpGluValProTyrLeuProIleAsp405410415ProLysAspValGlyArgAspTyrGluAlaValIleArgValAsnSer420425430GlnSerGlyLysGlyGlyValAlaTyrIleMetLysThrAspHisGly435440445LeuGlnIleProArgSerMetGlnValGluPheSerThrValValGln450455460AsnValThrAspAlaGluGlyGlyGluValAsnSerLysAlaMetTrp465470475480AspIlePheAlaThrGluTyrLeuGluArgThrAlaProValGluGln485490495IleAlaLeuArgValGluAsnAlaGlnThrGluAsnGluAspAlaSer500505510IleThrAlaGluLeuIleHisAsnGlyLysAspValThrValAspGly515520525HisGlyAsnGlyProLeuAlaAlaTyrAlaAsnAlaLeuGluLysLeu530535540GlyIleAspValGluIleGlnGluTyrAsnGlnHisAlaArgThrSer545550555560AspAspAspAlaGluAlaAlaAlaTyrValLeuAlaGluValAsnGly565570575ArgLysValTrpGlyValGlyIleAlaGlySerIleThrTyrAlaSer580585590LeuLysAlaValThrSerAlaValAsnArgAlaLeuAspValAsnHis595600605GluAlaValLeuAlaGlyGlyVal610615<210>2<211>1851<212>DNA<213>人工序列<400>2atgtctcctaacgatgcattcatctccgcacctgccaagatcgaaaccccagttgggcct60cgcaatgaaggccagccagcatggaataagcagcgtggctcctcaatgccagttaaccgc120tacatgcctttcgaggttgaggtagaagatatttctctgccggaccgcacttggccagat180aaaaaaatcaccgttgcacctcagtggtgtgctgttgacctgcgtgacggcaaccaggct240ctgattgatccgatgtctcctgagcgtaagcgccgcatgtttgagctgctggttcagatg300ggattcaaggaaatcgaggtcggtttcccttcagcttcccagactgattttgatttcgtt360cgtgagatcatcgaaaaggacatgatccctgacgatgtcaccattcaggttctggttcag420gctcgtgagcacctgattcgccgtacttttgaagcttgcgaaggcgcaaaaaacgttatc480gtgcacttctacaactcaacctccatcctgcagcgcaacgtggtgttccgcatggacaag540gtgcaggtgaagaagctggctaccgatgccgctgaactgatcaagaccgtcgctcaggat600tacccagacaccaactggcgctggcagtactcccctgagtccttcaccggcactgaggtt660gagtacgccaaggaagttgtggacgcagttgttgaggtcatggatccaactcctgagaac720ccaatgatcatcaacctgccttccaccgttgagatgatcacccctaacgtttacgcagac780tccattgaatggatgcaccgcaatctaaaccgtcgtgattccattatcctgtccctgcac840ccgcacaatgaccgtggcaccggcgttggcgcagctgagctgggctacatggctggcgct900gaccgcatcgaaggctgcctgttcggcaacggcgagcgcaccggcaacgtctgcctggtc960accctggcactgaacatgctgacccagggcgttgaccctcagctggacttcaccgatata1020cgccagatccgcagcaccgttgaatactgcaaccagctgcgcgttcctgagcgccaccca1080tacggcggcgacctggtcttcaccgctttctccggttcccaccaggacgctgtgaacaag1140ggtctggacgccatggctgccaaggttcagccaggtgctagctccactgaagtttcttgg1200gagcagctgcgcgacaccgaatgggaggttccttacctgcctatcgatccaaaggatgtc1260ggtcgcgactacgaggctgttatccgcgtgaactcccagtccggcaagggcggcgttgct1320tacatcatgaagaccgatcacggtctgcagatccctcgctccatgcaggttgagttctcc1380accgttgtccagaacgtcaccgacgctgagggcggcgaggtcaactccaaggcaatgtgg1440gatatcttcgccaccgagtacctggagcgcaccgcaccagttgagcagatcgcgctgcgc1500gtcgagaacgctcagaccgaaaacgaggatgcatccatcaccgccgagctcatccacaac1560ggcaaggacgtcaccgtcgatggccacggcaacggcccactggctgcttacgccaacgcg1620ctggagaagctgggcatcgacgttgagatccaggaatacaaccagcacgcccgcacctcg1680gacgacgatgcagaagcagccgcctacgtgctggctgaggtcaacggccgcaaggtctgg1740ggcgtcggcatcgctggctccatcacctacgcttcgctgaaggcagtgacctccgccgta1800aaccgcgcgctggacgtcaaccacgaggcagtcctggctggcggcgtttaa1851<210>3<211>626<212>PRT<213>人工序列<400>3ValAsnValAlaAlaSerGlnGlnProThrProAlaThrValAlaSer151015ArgGlyArgSerAlaAlaProGluArgMetThrGlyAlaGlnAlaIle202530ValArgSerLeuGluGluLeuAsnAlaAspIleValPheGlyIlePro354045GlyGlyAlaValLeuProValTyrAspProLeuTyrSerSerThrLys505560ValArgHisValLeuValArgHisGluGlnGlyAlaGlyHisAlaAla65707580ThrGlyTyrAlaGlnValThrGlyArgValGlyValCysIleAlaThr859095SerGlyProGlyAlaThrAsnLeuValThrProIleAlaAspAlaAsn100105110LeuAspSerValProMetValAlaIleThrGlyGlnValGlySerSer115120125LeuLeuGlyThrAspAlaPheGlnGluAlaAspIleArgGlyIleThr130135140MetProValThrLysHisAsnPheMetValThrAsnProAsnAspIle145150155160ProGlnAlaLeuAlaGluAlaPheHisLeuAlaIleThrGlyArgPro165170175GlyProValLeuValAspIleProLysAspValGlnAsnAlaGluLeu180185190AspPheValTrpProProLysIleAspLeuProGlyTyrArgProVal195200205SerThrProHisAlaArgGlnIleGluGlnAlaValLysLeuIleGly210215220GluSerLysLysProValLeuTyrValGlySerGlyValIleLysAla225230235240AspAlaHisGluGluLeuArgAlaPheAlaGluHisThrGlyIlePro245250255ValValThrThrLeuMetAlaLeuGlyThrPheProGluSerHisGlu260265270LeuHisMetGlyMetProGlyMetHisGlyThrValSerAlaValGly275280285AlaLeuGlnArgSerAspLeuLeuIleAlaIleGlySerArgPheAsp290295300AspArgValThrGlyAspValAspThrPheAlaProAspAlaLysIle305310315320IleHisAlaAspIleAspProAlaGluIleGlyLysIleLysGlnVal325330335GluValProIleValGlyAspAlaArgGluValLeuAlaArgLeuLeu340345350GluThrThrLysAlaSerLysAlaGluSerGluAspIleSerGluTrp355360365ValAspTyrLeuLysGlyLeuLysAlaArgPheProArgGlyTyrAsp370375380GluGlnProGlyAspLeuLeuAlaProGlnPheValIleGluThrLeu385390395400SerLysGluValGlyProAspAlaIleTyrCysAlaGlyValGlyGln405410415HisGlnMetTrpAlaAlaGlnPheValAspPheGluLysProArgThr420425430TrpLeuAsnSerGlyGlyLeuGlyThrMetGlyTyrAlaValProAla435440445AlaLeuGlyAlaLysAlaGlyAlaProAspLysGluValTrpAlaIle450455460AspGlyAspGlyCysPheGlnMetThrAsnGlnGluLeuThrThrAla465470475480AlaValGluGlyPheProIleLysIleAlaLeuIleAsnAsnGlyAsn485490495LeuGlyMetValArgGlnTrpGlnThrLeuPheTyrGluGlyArgTyr500505510SerAsnThrLysLeuArgAsnGlnGlyGluTyrMetProAspPheVal515520525ThrLeuSerGluGlyLeuGlyCysValAlaIleArgValThrLysAla530535540GluGluValLeuProAlaIleGlnLysAlaArgGluIleAsnAspArg545550555560ProValValIleAspPheIleValGlyGluAspAlaGlnValTrpPro565570575MetValSerAlaGlySerSerAsnSerAspIleGlnTyrAlaLeuGly580585590LeuArgProPhePheAspGlyAspGluSerAlaAlaGluAspProAla595600605AspIleHisGluAlaValSerAspIleAspAlaAlaValGluSerThr610615620GluAla625<210>4<211>1881<212>DNA<213>人工序列<400>4gtgaatgtggcagcttctcaacagcccactcccgccacggttgcaagccgtggtcgatcc60gccgcccctgagcggatgacaggtgcacaggcaattgttcgatcgctcgaggagcttaac120gccgacatcgtgttcggtattcctggtggtgcggtgctaccggtgtatgacccgctctat180tcctccacaaaggtgcgccacgtcctagtgcgccacgagcagggcgcaggccacgcagca240accggctacgcgcaggttactggacgcgttggcgtctgcattgcaacctctggcccaggc300gcaaccaacttggttaccccaatcgctgatgcaaacttggactccgttcccatggttgcc360atcaccggccaggtcggaagtagcctgctgggtaccgatgctttccaggaagccgatatc420cgcggcatcaccatgccagtgaccaagcacaacttcatggtcaccaaccccaacgacatt480ccacaggcattggctgaggcattccacctcgcgattactggtcgccctggtcctgttcta540gtggatatccccaaggatgttcagaacgctgaattggatttcgtctggccaccaaagatc600gacctgccaggctaccgcccagtttcaacaccgcatgctcgacagattgagcaggctgtc660aaactgatcggtgagtctaagaagcctgtcctttacgttggcagcggcgttatcaaggct720gatgcccacgaagagcttcgtgcgttcgctgagcacaccggcattccagttgtcaccaca780ttgatggcgctgggaaccttcccagagtcccacgagctgcacatgggtatgccaggcatg840catggcactgtgtccgctgttggtgcactgcagcgcagcgacctgctgattgctatcggc900tcccgctttgatgaccgcgtcaccggtgacgttgacactttcgcacctgatgccaagatc960attcacgccgacattgatcctgccgaaatcggcaagatcaagcaggttgaggttccaatc1020gtgggcgatgcccgcgaggttcttgctcgtctgctcgaaaccaccaaggcaagcaaggca1080gagtctgaggacatctccgagtgggttgactacctcaagggcctcaaggcacgtttccca1140cgtggctacgacgagcagccaggcgatctgctggcaccacagtttgtcattgaaaccctg1200tccaaggaagttggccccgacgcaatttactgcgccggcgttggccagcaccagatgtgg1260gcagctcagttcgttgacttcgaaaagccacgcacctggctcaactccggtggactgggc1320accatgggctacgcagttcctgcggctcttggagcaaaggctggcgcacctgacaaggaa1380gtctgggctatcgacggcgacggctgtttccagatgaccaaccaggaactcaccaccgcc1440gcagttgaaggtttccccattaagatcgcactaatcaacaacggaaacctgggtatggtt1500cgccaatggcagaccctattctatgaaggacggtactcaaatactaaacttcgtaaccag1560ggcgagtacatgcccgactttgttaccctttctgagggacttggctgtgttgccatccgc1620gtcaccaaagcggaggaagtactgccagccatccaaaaggctcgagagatcaacgaccgc1680ccagtagtcatcgacttcatcgtcggtgaagacgcacaggtatggccaatggtgtctgct1740ggatcatccaactccgatatccagtacgcactcggattgcgcccattctttgatggtgat1800gaatctgcagcagaagatcctgccgacattcacgaagccgtcagcgacattgatgccgcc1860gttgaatcgaccgaggcataa1881<210>5<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>5gctctagactccactgaagtttcttgggagca32<210>6<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>6cggctgcttctgcatcgtcgtccgaggtgcgggcgtgctgg41<210>7<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>7cgcacctcggacgacgatgcagaagcagccg31<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>8tctgtcgacccgaccccaacttcaccacag30<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>9gctctagatcctagtgcgccacgagcag28<210>10<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>10atcagccttgataacgccgctgccaacgtaaaggacaggct41<210>11<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>11ttacgttggcagcggcgttatcaaggctgat31<210>12<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>12tctgtcgacggacagggtttcaatgacaaac31<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>13ccagcacgcccgcacctcgta21<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>14gaagcctgtcctttacgttggta23當(dāng)前第1頁1 2 3