本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及擬南芥基因COLD1在植物抗干旱脅迫方面的新應(yīng)用。

背景技術(shù)：

旱災(zāi)是我國乃至世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)長期面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一，干旱造成的損失幾乎是其它自然災(zāi)害造成損失的總和。加之當(dāng)前全球氣候變暖、生態(tài)環(huán)境不斷惡化、降水量分布不均及供需錯(cuò)位，今后農(nóng)業(yè)生產(chǎn)遭受干旱的威脅將更加嚴(yán)重，因而研究植物抗旱過程中主效基因及其表達(dá)調(diào)控，深入闡明植物對(duì)干旱信號(hào)的感知和信號(hào)傳遞過程、揭示植物適應(yīng)和忍耐干旱的分子機(jī)理、從而最大限度上挖掘植物的抗旱潛力，不僅是現(xiàn)代生命科學(xué)亟需解決的重大基礎(chǔ)科學(xué)問題，而且對(duì)提高干旱地區(qū)的植被覆蓋及糧食產(chǎn)量跨越式增長都有重要意義。

事實(shí)上，植物95％以上的水分通過蒸騰作用從氣孔散失。分布于葉片表皮的氣孔是植物進(jìn)行氣體的交換必要門戶：光合作用必需的CO₂和其副產(chǎn)物O₂由此出入，同時(shí)水分以水蒸氣的形式通過氣孔蒸發(fā)。作為這一對(duì)矛盾的平衡體，氣孔需要維持實(shí)時(shí)適度動(dòng)態(tài)變化，一方面保持足夠量的CO₂進(jìn)入，滿足光合作用的需要，而同時(shí)維持合適水分散失。由于保衛(wèi)細(xì)胞能夠在單細(xì)胞水平上對(duì)外部環(huán)境和內(nèi)部刺激迅速做出反應(yīng)，是研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的非常有價(jià)值的模式系統(tǒng)。綜合包括分子遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和功能基因組學(xué)等多學(xué)科強(qiáng)有力的技術(shù)，開展保衛(wèi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的遺傳學(xué)分析，建立植物氣孔運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)的生物物理和細(xì)胞生物學(xué)模型，在此基礎(chǔ)上發(fā)展以提高植物水分利用效率為目的植物遺傳改造，是提高作物抗旱性的根本途徑。因此，利用和開發(fā)植物體自身的生理和基因潛力，通過遺傳操作改造作物，減少作物的蒸騰作用或者減少植物必需水，提高植物的水分利用效率在同等供水條件下獲得更多的農(nóng)業(yè)產(chǎn)出，是發(fā)展我國作物生產(chǎn)的重大戰(zhàn)略性課題之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供擬南芥基因COLD1在植物抗干旱脅迫方面的新應(yīng)用，拓展基因COLD1的應(yīng)用范圍。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了擬南芥基因COLD1突變，研究突變體在植物抗逆過程中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因缺失之后的植物抗旱能力顯著減弱，表現(xiàn)出對(duì)干旱的高度敏感。所述突變體從擬南芥資源中心(ABRC，Ohio State University)獲得。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明首先提供擬南芥基因COLD1在植物抗干旱脅迫方面的應(yīng)用，所述擬南芥基因COLD1，其在Genbank中的編號(hào)為AT1G32230，該基因的CDS序列全長為1770bp，編碼589個(gè)氨基酸的蛋白。為RCD1的同源基因，是SRO1家族成員之一，分布于細(xì)胞核中，在植物氧化脅迫中起到重要作用，可以調(diào)節(jié)許多轉(zhuǎn)錄因子。

為了驗(yàn)證該基因在植物干旱脅迫反應(yīng)中的作用，本發(fā)明對(duì)在正常條件下生長10天的野生型和該基因突變體cold1施行干旱處理，斷水12天后野生型擬南芥可耐受干旱脅迫，而cold1則表現(xiàn)出干旱癥狀，枯萎死亡。同時(shí)，進(jìn)行模式干旱實(shí)驗(yàn)(滲透脅迫)，用含有甘露醇的MS培養(yǎng)基上觀察野生型和cold1根伸長及生長發(fā)育的變化，則發(fā)現(xiàn)cold1根的伸長表現(xiàn)出比野生型對(duì)甘露醇更加敏感，生長受阻。在50mM甘露醇上cold1被抑制大約34.2％而野生型的根伸長大約只抑制8.42％，在高濃度甘露醇上(100～250mM)，cold1和野生型的根伸長均被抑制，但是cold1的抑制程度比野生型更嚴(yán)重。這些結(jié)果表明，COLD1在植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫中扮演重要角色。本發(fā)明進(jìn)一步利用失水實(shí)驗(yàn)證明，cold1葉片和離體植物失水較野生型較快，表現(xiàn)出突變體的干旱敏感性。

基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了擬南芥基因COLD1在培育抗干旱脅迫轉(zhuǎn)基因植物方面的應(yīng)用。

更進(jìn)一步地，所述培育轉(zhuǎn)基因植物旨在將外源基因利用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物中獲得抗干旱脅迫的轉(zhuǎn)基因植物；

所述外源基因?yàn)椋?/p>

(1)COLD1基因或其CDS序列，

或(2)由COLD1基因或其CDS序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸且具有同等功能的衍生的核苷酸序列。

作為優(yōu)選，在轉(zhuǎn)基因植物中進(jìn)行擬南芥基因COLD1的超表達(dá)，可獲得更加耐旱的轉(zhuǎn)基因植物。

為了實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物中擬南芥基因COLD1的超表達(dá)，優(yōu)選構(gòu)建由CaMV35S啟動(dòng)子控制的超表達(dá)COLD1轉(zhuǎn)基因植株。即，將前述外源基因首先構(gòu)建到帶有CaMV35S啟動(dòng)子的載體中獲得重組表達(dá)載體，再將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物中獲得超表達(dá)擬南芥基因COLD1的轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明利用擬南芥干旱反應(yīng)突變體研究植物抗旱應(yīng)答的主效基因，揭開植物復(fù)雜抗旱機(jī)制的重要途徑，以氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的開閉能調(diào)節(jié)葉片表面水分的蒸發(fā)引起葉片表面溫度微小變化作為監(jiān)控指標(biāo)，利用高分辨率的溫度敏感成像系統(tǒng)，從擬南芥突變體庫中成功地篩選并克隆到一個(gè)干旱敏感基因COLD1，該基因突變會(huì)導(dǎo)致葉片溫度明顯低于野生型，失水較野生型快，不耐干旱；同時(shí)突變體幼苗對(duì)干旱及模擬干旱甘露醇處理的滲透脅迫均表現(xiàn)出超敏感，生長發(fā)育受阻較野生型嚴(yán)重。超表達(dá)COLD1的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出耐干旱的特征。以上結(jié)果證明COLD1在植物抗干旱脅迫中扮演重要角色，對(duì)該基因深入研究其在干旱信號(hào)感受、傳遞和耐旱基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用，有望在植物抗旱的分子機(jī)制研究中取得重要進(jìn)展。

附圖說明

圖1為干旱條件下篩選得到的擬南芥葉片溫度低的突變體cold1(箭頭指示為篩選得到的cold1突變體)；A圖為遠(yuǎn)紅外篩選的干旱敏感突變體cold1，B圖為用于遠(yuǎn)紅外篩選的擬南芥M2幼苗的普通照片。

圖2為正常生長10天的野生型和cold1進(jìn)行斷水12天的干旱處理后表型；A圖為對(duì)照，B圖為干旱12天后的表型圖。

圖3為模擬干旱脅迫實(shí)驗(yàn)，將生長在MS培養(yǎng)基第5天的幼苗，移到MS和含有200mM甘露醇的MS培養(yǎng)基上，生長10天后的表型；A圖為MS培養(yǎng)基上生長的幼苗作為對(duì)照，B圖為含有200mM的MS培養(yǎng)基上生長10天的幼苗表型，C為統(tǒng)計(jì)分析。

圖4為離體葉片的遠(yuǎn)紅外實(shí)驗(yàn)和失水實(shí)驗(yàn)，A圖為離體植株，B圖為離體植株的遠(yuǎn)紅外圖，C圖為失水率統(tǒng)計(jì)分析。

圖5為超表達(dá)COLD1轉(zhuǎn)基因植物的耐旱實(shí)驗(yàn)，A圖為對(duì)照，B圖為干旱15天的植物生長表型。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1 cold1突變體的篩選、鑒定以抗旱反應(yīng)

利用遠(yuǎn)紅外成像技術(shù)，在干旱條件先篩選得到擬南芥葉片溫度較低的擬南芥突變體，命名為cold1；根據(jù)http://signal.salk.edu和http://www.arabidopsis.org網(wǎng)上提供的信息和引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)所述擬南芥突變體的COLD1基因的第一個(gè)外顯子內(nèi)部插入一段T-DNA序列，導(dǎo)致該基因表達(dá)受阻。干旱脅迫下，該突變體的葉片溫度明顯低于野生型，隨著干旱脅迫的時(shí)間延長，突變體表現(xiàn)出萎焉與死亡，生長發(fā)育受阻等不敏感特征(圖1)。

實(shí)施例2 COLD1基因的干旱脅迫分析

本實(shí)施例為深入探討COLD1基因的生物學(xué)功能，利用干旱和模擬干旱策略對(duì)COLD1基因進(jìn)行功能分析。

幼苗在光/暗周期為8/16h，溫度22℃，黑暗溫度18℃，相對(duì)濕度80％，光照強(qiáng)度90mol·m^-2·s^-1的條件下生長10天后終止?jié)菜M(jìn)行干旱脅迫處理。

多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：

正常生長條件下，野生型生長良好，cold1生長較弱，但兩者均能完成生活史；而持續(xù)干旱12天后野生型和cold1植株生長狀況對(duì)比明顯，野生型植株仍然存活，生長良好，而cold1植株仍然萎焉死亡(圖2)。

利用甘露醇模擬干旱脅迫發(fā)現(xiàn)cold1根的伸長表現(xiàn)出比野生型對(duì)甘露醇更加敏感，生長發(fā)育受到抑制。這些試驗(yàn)結(jié)果表明cold1功能缺失以后，植物表現(xiàn)出干旱敏感性。超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物則表現(xiàn)出對(duì)干旱脅迫的具有抗性作用。暗示COLD1在植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫反應(yīng)中起著重要的作用(圖3)。

實(shí)施例3 COLD1基因?qū)χ参锉Ｋ芰Φ淖饔梅治?/p>

植物對(duì)干旱的反應(yīng)主要表現(xiàn)在對(duì)水分的利用效率和保水能力兩方面。利用遠(yuǎn)紅外成像技術(shù)能準(zhǔn)確檢測(cè)植物通過地上部分喪失水分的能力。干旱2周后發(fā)現(xiàn)擬南芥突變體cold1葉片溫度明顯偏低，表明其通過地上部分喪失水分能力較高，也就是地上部分保水能力較弱。失水率統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)也證明了這一結(jié)果(圖4)。

以上結(jié)果證明COLD1基因缺失后，植物表現(xiàn)出地方部分保水能力降低，利用水分的效率減弱，從而使植物耐旱能力喪失。

實(shí)施例4 COLD1基因的體內(nèi)表達(dá)和定位分析

從擬南芥基因組中利用PCR擴(kuò)增分離得到的COLD1的啟動(dòng)子區(qū)序列和CDS序列，克隆得到pCAMBIA1381的GUS報(bào)告載體和pEGAD的GFP細(xì)胞定位載體，轉(zhuǎn)化擬南芥植株并獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株。GUS組織化學(xué)染色和熒光定位分析表明，COLD1具有普表達(dá)的特性，主要分布在莖、葉及花中，亞細(xì)胞定位展示定位在細(xì)胞核中，這表明該基因可能作為干旱脅迫的調(diào)節(jié)因子起作用。

本發(fā)明比較了野生型擬南芥(作為對(duì)照)及超表達(dá)COLD1轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱脅迫的耐性，將同時(shí)種植在土壤中的兩種植株幼苗干旱15天，結(jié)果展示干旱脅迫下野生型植株表現(xiàn)為明顯的失水萎蔫表型、生長發(fā)育受阻，而超表達(dá)COLD1轉(zhuǎn)基因植物植物則表現(xiàn)為更為良好的生長態(tài)勢(shì)，對(duì)植物的生長發(fā)育影響相對(duì)較小，表明超表達(dá)COLD1基因可以增強(qiáng)植物的耐旱性(圖5)。這些結(jié)果證實(shí)COLD1基因在擬南芥應(yīng)對(duì)干旱脅迫中發(fā)揮重要作用。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。