本發(fā)明屬于食品深加工領(lǐng)域，特別涉及魔芋飛粉的深加工方法，具體涉及一種風(fēng)味蛋白酶酶解制備ACE抑制肽的方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)是世界上最大的魔芋生產(chǎn)國(guó)，精粉年產(chǎn)量超過(guò)5000噸。在魔芋精粉加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生重量輕、顆粒小的粉末，稱為魔芋飛粉，占精粉的30％-40％，即全國(guó)年產(chǎn)飛粉1500-2000噸。目前對(duì)魔芋的利用主要集中在魔芋精粉(葡甘聚糖)，而魔芋飛粉大多以低價(jià)作為飼料或干燥劑出售，利用價(jià)值低。因此，開(kāi)發(fā)和利用魔芋飛粉生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品成為當(dāng)務(wù)之急。魔芋蛋白質(zhì)經(jīng)酶解可得到具有抗衰老、抗癌、降血壓、免疫等功能的生物活性多肽，是生產(chǎn)功能性保健食品的良好原料。
ACE抑制肽是一類能夠抑制ACE活性的肽段，一般由2-10個(gè)氨基酸殘基組成。ACE抑制肽通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性與ACE發(fā)生結(jié)合，阻斷了具有升血壓活性的血管緊張素Ⅱ的生成，同時(shí)促進(jìn)了具有降血壓活性的舒緩肽和腦啡肽的生成，從而起到降血壓的作用。食品蛋白源的ACE抑制肽因具有安全性高、毒副作用小、可長(zhǎng)期食用、易于吸收等優(yōu)點(diǎn)，從而越來(lái)越受到學(xué)者們的廣泛重視。
目前，已經(jīng)有人從沙丁魚(yú)、牦牛乳液蛋白、雪菊、玉米、綠豆、燕麥等食品中得到ACE抑制肽，具有良好的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用前景。魔芋飛粉中蛋白質(zhì)含量較高，如果對(duì)其進(jìn)行充分利用，通過(guò)酶解法加工魔芋蛋白獲取ACE抑制肽，人們將會(huì)得到較大的社會(huì)效益和經(jīng)技效益。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供了一種風(fēng)味蛋白酶酶解制備ACE抑制肽的方法，本方法的原料易得，工藝簡(jiǎn)單，可以提高魔芋蛋白利用率及拓寬ACE抑制肽的來(lái)源，提高其使用率和經(jīng)濟(jì)效益。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
一種風(fēng)味蛋白酶酶解制備ACE抑制肽的方法，將魔芋蛋白溶液的pH值調(diào)節(jié)為5-7后，在溫度為40-60℃下加入風(fēng)味蛋白酶，酶解3-6h，得到酶解液；再將酶解液滅酶、冷卻、調(diào)節(jié)pH值至魔芋蛋白等電點(diǎn)，經(jīng)過(guò)離心后收集上清液；上清液經(jīng)冷凍干燥后純化得到ACE抑制肽。
本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，魔芋蛋白溶液通過(guò)以下方法制得：將魔芋蛋白加入到純凈水中，配成質(zhì)量濃度為2-10％的魔芋蛋白溶液。
本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，每1g魔芋蛋白溶液中加入風(fēng)味蛋白酶的量為1000-5000U。
本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，滅酶的溫度為80-100℃，時(shí)間為10-20min。
本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，離心的轉(zhuǎn)速為6000-10000rpm，時(shí)間為10-30min。
本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，冷凍干燥的溫度為-50～-110℃，冷凍干燥的時(shí)間為10-24h。
本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，純化過(guò)程為：將冷凍干燥后得到的產(chǎn)品利用大孔吸附樹(shù)脂D101、陰離子交換樹(shù)脂D201層析進(jìn)行分離。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果：
本發(fā)明以魔芋蛋白質(zhì)為原料，用風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解，其酶解條件為：底物濃度2-10％，加酶量1000-5000U/g，酶解溫度為40-60℃，pH值5-7，反應(yīng)時(shí)間為3-6h，經(jīng)滅酶、離心、得到魔芋ACE抑制肽酶解液，將酶解液經(jīng)分離純化、濃縮、冷凍干燥，純化，即得ACE抑制肽，經(jīng)紫外分光光度法檢測(cè)，魔芋ACE抑制肽的抑制活性是10％-60％。本發(fā)明采用風(fēng)味蛋白酶酶解制備ACE抑制肽，縮減了成本，工藝簡(jiǎn)單，可進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。該魔芋ACE抑制肽來(lái)源于天然植物蛋白，分子量小，穩(wěn)定、安全、人體易吸收。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
一種風(fēng)味蛋白酶酶解制備ACE抑制肽的方法，包括以下步驟：
將魔芋蛋白加入到純凈水中，配成質(zhì)量濃度為2-10％的魔芋蛋白溶液；調(diào)節(jié)其pH值為5-7，在溫度為40-60℃下加入風(fēng)味蛋白酶，酶解3-6h，得到酶解液；再將酶解液滅酶、冷卻、調(diào)pH至魔芋蛋白等電點(diǎn)，經(jīng)過(guò)離心后收集上清液；測(cè)上清液的ACE抑制率，上清液經(jīng)冷凍干燥后即得粗品。粗品依次利用大孔吸附樹(shù)脂、離子交換層析進(jìn)行分離，得到純度較高的ACE抑制肽，檢測(cè)魔芋ACE抑制肽活性。
其中，每1g魔芋蛋白溶液中加入風(fēng)味蛋白酶的量為1000-5000U。
滅酶的溫度80-100℃，時(shí)間為10-20min；
離心的轉(zhuǎn)速為8000-10000rpm，時(shí)間為10-30min。
冷凍干燥的溫度為為-50～-110℃，冷凍干燥的時(shí)間為10-24h。
測(cè)定ACE的抑制率：
利用Cushman檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè):取75uL、HHL(馬尿酰-組氨酰-亮氨酸)與25uL、ACE抑制劑(多肽液)充分混勻。在37℃水浴鍋中溫育5min，加入25uL、25mu/mL ACE硼酸鹽溶液，在37℃水浴鍋中反應(yīng)40min。結(jié)束后加入200uL、1.0moL/L鹽酸溶液破壞反應(yīng)環(huán)境，終止反應(yīng)進(jìn)程。然后于各試管中加入乙酸乙酯1.7mL，使其混勻；吸取1.2mL乙酸乙酯層于另一試管中，放入100℃烘箱中，揮發(fā)溶劑40min。拿出冷卻后加入去離子水3mL，混勻后在波長(zhǎng)228nm下測(cè)定其吸光度。
表1 ACE抑制率檢測(cè)方法
計(jì)算公式為：
ACE抑制率
式中：A1—ACE抑制肽和ACE都存在溶液的吸光度值
A2—不加ACE抑制肽存在溶液的吸光度值
A3—ACE與HHL存在空白溶液的吸光度值
魔芋ACE抑制肽活性檢測(cè)
紫外分光光度法檢測(cè)魔芋ACE抑制肽活性。
配制反應(yīng)液與空白液，兩者其他條件均相同，給反應(yīng)液中加入魔芋ACE抑制肽。以吸光度為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)繪制馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品曲線方程，得出空白液及反應(yīng)液中馬尿酸含量，計(jì)算魔芋ACE抑制肽的抑制活性。
實(shí)施例1
(1)將4g魔芋蛋白，加入50mL的純凈水，配成濃度為8％魔芋蛋白溶液；
(2)調(diào)節(jié)魔芋蛋白溶液的pH值至5，置于恒溫磁力攪拌器上使溫度恒定在40℃，加入風(fēng)味蛋白酶，酶解3h，得到酶解液，酶解期間保持其pH值不變；其中，每1g魔芋蛋白溶液中加入風(fēng)味蛋白酶的量為1000U。
(3)將酶解液置于85℃水浴鍋中滅酶20min，冷卻至室溫、調(diào)pH值至魔芋蛋白等電點(diǎn)后離心，轉(zhuǎn)速為10000rpm，時(shí)間10min，收集上清液；
(4)收集得到上清液測(cè)其ACE抑制率>30％，-50℃、冷凍干燥24h即得ACE抑制肽粗品。
(5)將ACE抑制肽粗品依次利用大孔吸附樹(shù)脂D101、陰離子交換樹(shù)脂D201層析進(jìn)行分離，得到純度較高的ACE抑制肽。
(6)檢測(cè)結(jié)果顯示：魔芋ACE抑制肽的抑制活性為18.9％。
實(shí)施例2
(1)將1g魔芋蛋白，加入50mL的純凈水，配成濃度為2％魔芋蛋白溶液；
(2)調(diào)節(jié)魔芋蛋白溶液的pH值至6，置于恒溫磁力攪拌器上使溫度恒定在50℃，加入風(fēng)味蛋白酶，酶解3h，得到酶解液，酶解期間保持其pH值不變；其中，每1g魔芋蛋白溶液中加入風(fēng)味蛋白酶的量為5000U。
(3)將酶解液置于90℃水浴鍋中滅酶15min，冷卻至室溫、調(diào)pH值至魔芋蛋白等電點(diǎn)后離心，其轉(zhuǎn)速為8000rpm，時(shí)間20min，收集上清液；
(4)收集得到上清液測(cè)其ACE抑制率>60％，-80℃、冷凍干燥18h即得ACE抑制肽粗品。
(5)將ACE抑制肽粗品依次利用大孔吸附樹(shù)脂D101、陰離子交換樹(shù)脂D201層析進(jìn)行分離，得到純度較高的ACE抑制肽。
(6)檢測(cè)結(jié)果顯示：魔芋ACE抑制肽的抑制活性為38.7％。
實(shí)施例3
(1)將2g魔芋蛋白，加入50mL的純凈水，配成濃度為4％魔芋蛋白溶液；
(2)調(diào)節(jié)魔芋蛋白溶液的pH值至5.5，置于恒溫磁力攪拌器上使溫度恒定在45℃，加入風(fēng)味蛋白酶，酶解4h，得到酶解液，酶解期間保持其pH值不變；其中，每1g魔芋蛋白溶液中加入風(fēng)味蛋白酶的量為2000U。
(3)將酶解液置于97℃以上的水浴鍋中滅酶10min，冷卻至室溫、調(diào)pH值至魔芋蛋白等電點(diǎn)后離心，其轉(zhuǎn)速為9000rpm，時(shí)間15min，收集上清液；
(4)收集得到上清液測(cè)其ACE抑制率>40％，-90℃、冷凍干燥12h即得ACE抑制肽粗品。
(5)將ACE抑制肽粗品依次利用大孔吸附樹(shù)脂D101、陰離子交換樹(shù)脂D201層析進(jìn)行分離，得到純度較高的ACE抑制肽。
(6)檢測(cè)結(jié)果顯示：魔芋ACE抑制肽的抑制活性為25.3％。
實(shí)施例4
(1)將3g魔芋蛋白，加入50mL的純凈水，配制成濃度為6％魔芋蛋白溶液；
(2)調(diào)節(jié)魔芋蛋白溶液的pH值至6.5，置于恒溫磁力攪拌器上使溫度恒定在55℃，加入風(fēng)味蛋白酶，酶解5h，得到酶解液，酶解期間保持其pH值不變；其中，每1g魔芋蛋白溶液中加入風(fēng)味蛋白酶的量為3000U。
(3)將酶解液置于95℃以上的水浴鍋中滅酶10min，冷卻至室溫、調(diào)pH值至魔芋蛋白等電點(diǎn)后離心，其轉(zhuǎn)速為9500rpm，時(shí)間10min，收集上清液；
(4)收集得到上清液測(cè)其ACE抑制率>50％，-110℃、冷凍干燥10h即得ACE抑制肽粗品。
(5)將ACE抑制肽粗品依次利用大孔吸附樹(shù)脂D101、陰離子交換樹(shù)脂D201層析進(jìn)行分離，得到純度較高的ACE抑制肽。
(6)檢測(cè)結(jié)果顯示：魔芋ACE抑制肽的抑制活性為32.1％。
實(shí)施例5
(1)將5g魔芋蛋白，加入50mL的純凈水，配制成濃度為10％魔芋蛋白溶液；
(2)調(diào)節(jié)魔芋蛋白溶液的pH值至7.0，置于恒溫磁力攪拌器上使溫度恒定在60℃，加入風(fēng)味蛋白酶，酶解4h，得到酶解液，酶解期間保持其pH值不變；其中，每1g魔芋蛋白溶液中加入風(fēng)味蛋白酶的量為4000U。
(3)將酶解液置于80℃水浴鍋中滅酶20min，冷卻至室溫、調(diào)pH值至魔芋蛋白等電點(diǎn)后離心，其轉(zhuǎn)速為10000rpm，時(shí)間20min，收集上清液；
(4)收集得到上清液測(cè)其ACE抑制率>20％，-110℃、冷凍干燥10h即得ACE抑制肽粗品。
(5)將ACE抑制肽粗品依次利用大孔吸附樹(shù)脂D101、陰離子交換樹(shù)脂D201層析進(jìn)行分離，得到純度較高的ACE抑制肽。
(6)檢測(cè)結(jié)果顯示：魔芋ACE抑制肽的抑制活性為14.9％。
實(shí)施例6
將魔芋蛋白加入到純凈水中，配成質(zhì)量濃度為2％的魔芋蛋白溶液。將魔芋蛋白溶液的pH值調(diào)節(jié)為5后，在溫度為40℃下加入風(fēng)味蛋白酶，酶解6h，得到酶解液；其中，每1g魔芋蛋白溶液中加入風(fēng)味蛋白酶的量為1000U；
再將酶解液再100℃下滅酶10min、冷卻、調(diào)節(jié)pH值至魔芋蛋白等電點(diǎn)，在6000rpm下離心10min后收集上清液；上清液經(jīng)-50℃冷凍干燥20h后，得到粗品，將粗品利用大孔吸附樹(shù)脂D101、陰離子交換樹(shù)脂D201層析進(jìn)行分離，得到ACE抑制肽。
實(shí)施例7
將魔芋蛋白加入到純凈水中，配成質(zhì)量濃度為5％的魔芋蛋白溶液。將魔芋蛋白溶液的pH值調(diào)節(jié)為7后，在溫度為50℃下加入風(fēng)味蛋白酶，酶解5h，得到酶解液；其中，每1g魔芋蛋白溶液中加入風(fēng)味蛋白酶的量為2000U；
再將酶解液再85℃下滅酶20min、冷卻、調(diào)節(jié)pH值至魔芋蛋白等電點(diǎn)，在8000rpm下離心30min后收集上清液；上清液經(jīng)-50℃冷凍干燥20h后，得到粗品，將粗品利用大孔吸附樹(shù)脂D101、陰離子交換樹(shù)脂D201層析進(jìn)行分離，得到ACE抑制肽。