本發(fā)明涉及Sortase A介導(dǎo)的(S)-羰基還原酶寡聚體高效催化(S)-苯基乙二醇的合成，屬于生物催化不對(duì)稱轉(zhuǎn)化術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
手性化合物在醫(yī)藥、農(nóng)藥、激素、食品添加劑等精細(xì)化工品的生產(chǎn)上得到了越來越廣泛的應(yīng)用，如光學(xué)純苯基乙二醇不僅是液晶材料中不可缺少的重要手性添加劑，而且是制備具有光學(xué)活性的醫(yī)藥、農(nóng)藥和功能材料的重要中間體。
氧化還原酶是一種具有高度立體選擇性的生物催化劑，常用于生物轉(zhuǎn)化光學(xué)活性的手性化合物。在眾多的微生物氧化還原酶源中，來源于近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011的(S)-羰基還原酶SCRII催化2-羥基苯乙酮的還原反應(yīng)，產(chǎn)生(S)-苯基乙二醇。然而該酶在催化不對(duì)稱反應(yīng)時(shí)存在時(shí)間周期長(zhǎng)，效率低的缺點(diǎn)。雖然釀酒酵母和畢赤酵母都曾用于其同工酶的表達(dá)宿主，效果仍是不佳。最近，發(fā)明人實(shí)現(xiàn)了該酶在近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011中進(jìn)行就地表達(dá)，并將其活性提高了2倍，產(chǎn)物光學(xué)純度和產(chǎn)率均超過99％，但整個(gè)轉(zhuǎn)化過程卻需要24小時(shí)。因此，有必要尋求利用蛋白質(zhì)工程對(duì)(S)-羰基還原酶SCRII進(jìn)行改造，獲得功能加強(qiáng)的氧化還原酶。
近幾年來，蛋白質(zhì)連接在生物化學(xué)領(lǐng)域得到越來越多的應(yīng)用，人們可以將多肽類似物，小分子探針等等特異性地添加到蛋白質(zhì)的末端，給蛋白質(zhì)賦予了特定的功能。目前常用的方法是來自金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus中的sortase A(SrtA)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)連接，該方法具有溫和性、特異性、高效性等優(yōu)點(diǎn)。通過識(shí)別特定的信號(hào)序列LPXTG(X可以為任何氨基酸)，并切開蘇氨酸與甘氨酸之間的酰胺鍵，形成一個(gè)硫酯中間體，接下來由一個(gè)寡聚甘氨酸序列作為親核試劑來進(jìn)攻這個(gè)硫酯中間體，最終完成寡聚甘氨酸與蛋白質(zhì)之間的連接。如果將寡聚甘氨酸添加至熒光素、生物素等一些小分子探針上，就能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)的定點(diǎn)標(biāo)記。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明已經(jīng)利用(S)-專一性羰基還原酶的重組菌株催化不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(S)-苯基乙二醇，在此基礎(chǔ)上，從金黃色葡萄球菌(S.aureus)中克隆出sortase A基因srtA，將其在大腸桿菌宿主中進(jìn)行表達(dá)。同時(shí)，利用基因工程技術(shù)在SCRII的C末端添加信號(hào)序列LPETG，其N末端原本存在的甘氨酸作為親核試劑，在sortase A的介導(dǎo)下成功實(shí)現(xiàn)了SCRII寡聚化。生成的寡聚體，克服了SCRII本身的空間位阻效應(yīng)，相比于原始酶SCRII在熱穩(wěn)定性和催化效率方面均有比較大的提高，并且在3小時(shí)內(nèi)的轉(zhuǎn)化率和得率均達(dá)到了99％，相對(duì)于原始酶時(shí)間縮短了16倍。此外，發(fā)明人將該方法應(yīng)用于其它幾種氧化還原酶如羰基還原酶2(CR2，基因編號(hào)AB183149)、羰基還原酶4(CR4，基因編號(hào)E59061)、(S)-羰基還原酶(SCR，基因編號(hào)FJ939565)、(S)-羰基還原酶3(SCR3，基因編號(hào)FJ939564)等，酶活和熱穩(wěn)定性都有顯著提高，說明本發(fā)明方法有利于強(qiáng)化氧化還原酶的強(qiáng)化酶學(xué)性質(zhì)、提高催化效率。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種氧化還原酶寡聚體，所述氧化還原酶寡聚體是先制備在C末端添加了sortase A識(shí)別序列的氧化還原酶，然后使該氧化還原酶發(fā)生通過轉(zhuǎn)肽酶SrtA介導(dǎo)的連接反應(yīng)而得到氧化還原酶寡聚體。
在一種實(shí)施方式中，所述連接反應(yīng)是在Ca2+存在的條件下進(jìn)行。
在一種實(shí)施方式中，所述連接反應(yīng)是在含有Ca2+的緩沖體系中加入轉(zhuǎn)肽酶SrtA和C末端添加了sortase A識(shí)別序列的氧化還原酶，反應(yīng)一段時(shí)間即得到氧化還原酶寡聚體。
在一種實(shí)施方式中，所述連接反應(yīng)是在10℃–35℃下反應(yīng)12h–36h。
在一種實(shí)施方式中，所述連接反應(yīng)是在25℃下反應(yīng)36h。
在一種實(shí)施方式中，所述氧化還原酶寡聚體為羰基還原酶寡聚體。
在一種實(shí)施方式中，所述羰基還原酶寡聚體為(S)-羰基還原酶II寡聚體、羰基還原酶II寡聚體、羰基還原酶IV寡聚體、(S)-羰基還原酶寡聚體、(S)-羰基還原酶III寡聚體。
在一種實(shí)施方式中，所述氧化還原酶為氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的(S)-羰基還原酶，或者NCBI上gene ID為AB183149的CR2、gene ID為E59061的CR4、gene ID為FJ939565的SCR、gene ID為FJ939564的SCR3等。
在一種實(shí)施方式中，所述sortase A識(shí)別序列為L(zhǎng)PXTG(如SEQ ID NO:2所示)，其中X為任意一種氨基酸。
在一種實(shí)施方式中，所述sortase A識(shí)別序列與氧化還原酶之間通過柔性連接肽連接。
在一種實(shí)施方式中，所述柔性連接肽為GGGGS(如SEQ ID NO:9所示)。
在一種實(shí)施方式中，所述sortase A識(shí)別序列為L(zhǎng)PETG(如SEQ ID NO:3所示)。
在一種實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)肽酶SrtA是來源于金黃色葡萄球菌的SrtA。
在一種實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)肽酶SrtA的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在一種實(shí)施方式中，所述氧化還原酶寡聚體的制備，是先在氧化還原酶的C端添加sortase A識(shí)別序列，然后分別表達(dá)并純化C端添加了sortase A識(shí)別序列的氧化還原酶和轉(zhuǎn)肽酶SrtA，再在Ca+存在的條件下加入C端添加了sortase A識(shí)別序列的氧化還原酶和轉(zhuǎn)肽酶SrtA，使氧化還原酶發(fā)生連接反應(yīng)，得到氧化還原酶寡聚體。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種重組菌，所述重組菌表達(dá)在C末端添加了sortase A識(shí)別序列的氧化還原酶。
在一種實(shí)施方式中，所述羰基還原酶寡聚體為(S)-羰基還原酶II寡聚體、羰基還原酶II寡聚體、羰基還原酶IV寡聚體、(S)-羰基還原酶寡聚體、(S)-羰基還原酶III寡聚體。
在一種實(shí)施方式中，所述氧化還原酶為氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的(S)-羰基還原酶II。
在一種實(shí)施方式中，所述sortase A識(shí)別序列為L(zhǎng)PXTG，其中X為任意一種氨基酸。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種催化不對(duì)稱轉(zhuǎn)化制備(S)-苯基乙二醇的方法，所述方法是以本發(fā)明的(S)-羰基還原酶寡聚體作為催化劑。
在一種實(shí)施方式中，所述方法是以2-HAP為底物制備(S)-苯基乙二醇。
在一種實(shí)施方式中，所述方法具體是：用SCRII寡聚體轉(zhuǎn)化2-HAP；反應(yīng)體系：100mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)，5g/L 2-HAP和等摩爾的NADPH，適量的SCRII寡聚體純酶液；反應(yīng)在35℃、200r/min的條件下反應(yīng)3h。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述氧化還原酶寡聚體在制備手性化合物方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供所述氧化還原酶寡聚體在醫(yī)藥、農(nóng)藥、激素、食品添加劑等領(lǐng)域的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果：
(1)本發(fā)明成功建立了一種獲得氧化還原酶寡聚體的方法，相比于原始酶，通過這種方法連接的寡聚體具有顯著提高的催化活性和熱穩(wěn)定性；用該寡聚體催化不對(duì)稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間3小時(shí)，產(chǎn)物(S)-苯基乙二醇光學(xué)純度達(dá)到100％e.e.，產(chǎn)率為99％；相比于原始酶，寡聚體的催化效率提高了6倍，熱穩(wěn)定性提高了10℃。
(2)本發(fā)明從S.aureus中克隆出SrtA，實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中的高效表達(dá)，同時(shí)，通過基因工程手段在SCRII的C末端添加SrtA的識(shí)別序列，構(gòu)建SCRII-mtf，然后分別純化得到SrtA和SCRII-mtf的純酶，在Ca2+存在的條件下進(jìn)行連接反應(yīng)，得到SCRII-mtf寡聚體。
(3)羰基還原酶SCRII特異性催化轉(zhuǎn)化底物2-羥基苯乙酮為(S)-苯基乙二醇，但酶活較低。通過SrtA介導(dǎo)的連接反應(yīng)，構(gòu)建了其寡聚體，酶活檢測(cè)結(jié)果顯示，相比于原始酶酶活提高了6倍，同時(shí)熱穩(wěn)定性也有了較大提高，在50℃條件下孵育一小時(shí)，酶活仍保持原來的90％以上；另外，在相同底物濃度的情況下，不對(duì)稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間縮短了16倍。這些工作很好地解決了羰基還原酶催化活性低和熱穩(wěn)定性差的缺陷，為高效制備苯基乙二醇提供了有效途徑，為蛋白質(zhì)改造提供了一個(gè)新的應(yīng)用方向。
(4)本發(fā)明方法應(yīng)用于其他氧化還原酶(比如SCR、SCR3、CR2、CR4等)，都具有顯著的提高催化效率的效果。
具體實(shí)施方案
下面是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。
實(shí)施例1：金黃色葡萄球菌S.aureus基因組的獲得
LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0。固體培養(yǎng)基添加1.5％瓊脂粉。將S.aureus菌種接種于裝有5mL LB液體培養(yǎng)基(無抗)和5mL LB液體培養(yǎng)基(50μg/mL卡那霉素)的試管中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)10h。培養(yǎng)結(jié)束后，將菌體于6,000rpm、20min下離心，用生理鹽水洗滌兩次后收集細(xì)胞，利用基因組DNA提取試劑盒Genomic DNA Extraction Miniprep System(VIOGENE公司)提取基因組。
實(shí)施例2：Sortase A基因的獲得
合成擴(kuò)增Sortase A基因srtA的兩端引物(如SEQ ID NO:5–SEQ ID NO:6所示)：
srtA_F CGCCATATGCAAGCTAAACCTCAAATTC
srtA_R CCGCTCGAGTTTGACTTCTGTAGCTAC
PCR反應(yīng)體系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，dNTP(25mmol/L)0.5μL，引物(50pmol/μL)1μL，基因組DNA 5μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.5μL。
PCR條件為：98℃1min；98℃30s，55℃30s，72℃30s，30次循環(huán)；72℃10min。以實(shí)施例1獲得的S.aureus基因組為模板，PCR擴(kuò)增srtA基因(氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)純化DNA片斷。
實(shí)施例3：含srtA基因的重組大腸桿菌的構(gòu)建
(1)基因srtA及質(zhì)粒pET21a的酶切
利用質(zhì)粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒pET21a。
按照水、緩沖液、基因或質(zhì)粒DNA、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機(jī)內(nèi)離心2s使液體集中于管底，37℃水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或?qū)⒐苤糜?5℃保溫10min，終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，切膠回收并濃縮。
反應(yīng)體系組成：10×Buffer H 4μL，DNA 10μL，Nde I 2μL，XhoI 2μL，ddH2O將體系補(bǔ)足40μL。
(2)基因srtA與質(zhì)粒pET21a的連接
反應(yīng)體系組成如下：質(zhì)粒pET21a 0.8μL，基因srtA 4.2μL，Ligation Solution 5μL，將混合連接液置于16℃培養(yǎng)箱中連接12–16h。
(3)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli JM109
在每管的100μL E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入10μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴中靜置30min。轉(zhuǎn)入42℃水浴中，熱擊90s。快速轉(zhuǎn)移至冰浴中冷卻2min。每管中加入700μL LB液體培養(yǎng)基，37℃100rpm搖床溫育培養(yǎng)1h。培養(yǎng)后菌液3,000rpm離心2min，棄上清600μL，剩余菌液混勻后涂布到含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。
陽性克隆的選擇
挑取4個(gè)克隆，轉(zhuǎn)接入裝有3mL的含有100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h，利用質(zhì)粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒。用以下反應(yīng)體系進(jìn)行酶切驗(yàn)證：10×Buffer H 2μL，DNA 5μL，Nde I 0.5μL，XhoI 0.5μL，ddH2O將體系補(bǔ)足20μL。獲得陽性質(zhì)粒pET21a-srtA。
(4)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)
在E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入重組質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴中靜置30min。轉(zhuǎn)入42℃水浴中，熱擊90s。快速轉(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻2min。每管中加入700μL LB液體培養(yǎng)基，37℃100rpm搖床溫育培養(yǎng)1h。培養(yǎng)后菌液3,000rpm離心2min，棄上清600μL，剩余菌液混勻后涂布到含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。經(jīng)測(cè)序(上海生工生物工程股份有限公司)后獲得陽性克隆E.coli BL21/pET21a-srtA。
實(shí)施例4：SCRII-GGGGSLPETGG(簡(jiǎn)稱SCRII-mtf)基因的獲得
合成SCRII-mtf兩端引物(如SEQ ID NO:7–SEQ ID NO:8所示)
scrII-mtf_F：CCCATGGGCGAAATCGAATC
scrII-mtf_R：CCCTCGAGGCCGCCGGTTTCCGGAAGGCTGCCACCGCCACCTGGAC
AAGTGTAACCACCATC
PCR反應(yīng)體系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，dNTP(25mmol/L)0.5μL，引物(50pmol/μL)1μL，基因組DNA 5μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.5μL。
PCR條件為：98℃1min；98℃30s，55℃30s，72℃30s，30次循環(huán)；72℃10min。以實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的含有scrII基因的pET-SCRII質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增scrII基因，條件為：98℃1min；98℃30s，55℃30s，72℃45s，30次循環(huán)；72℃10min。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)純化DNA片斷。
實(shí)施例5：含scrII-mtf基因的重組大腸桿菌的構(gòu)建
(1)基因scrII-mtf及質(zhì)粒pET28a的酶切
利用質(zhì)粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒pET28a。
按照水、緩沖液、基因或質(zhì)粒DNA、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機(jī)內(nèi)離心2s使液體集中于管底，37℃水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或?qū)⒐苤糜?5℃保溫10min，終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，切膠回收并濃縮。
反應(yīng)體系組成：10×Buffer H 4μL，DNA 10μL，NcoI 2μL，XhoI 2μL，ddH2O將體系補(bǔ)足40μL。
(2)基因scrII與質(zhì)粒pET28a的連接
反應(yīng)體系組成如下：質(zhì)粒pET28a 0.8μL，基因srtA 4.2μL，Ligation Solution 5μL，將混合連接液置于16℃培養(yǎng)箱中連接12–16h。
(3)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli JM109
在每管的100μL E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入10μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴中靜置30min。轉(zhuǎn)入42℃水浴中，熱擊90s?？焖俎D(zhuǎn)移至冰浴中冷卻2min。每管中加入700μL LB液體培養(yǎng)基，37℃100rpm搖床溫育培養(yǎng)1h。培養(yǎng)后菌液3,000rpm離心2min，棄上清600μL，剩余菌液混勻后涂布到含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。
陽性克隆的選擇
挑取4個(gè)克隆，轉(zhuǎn)接入裝有3mL的含有100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h，利用質(zhì)粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒。用以下反應(yīng)體系進(jìn)行酶切驗(yàn)證：10×Buffer H 2μL，DNA 5μL，Nco I 0.5μL，Xho I 0.5μL，ddH2O將體系補(bǔ)足20μL。獲得陽性質(zhì)粒pET28a-scrII-mtf。
(4)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)
在每管100μL E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入1Μl重組質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴中靜置30min。轉(zhuǎn)入42℃水浴中，熱擊90s?？焖俎D(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻2min。每管中加入700μL LB液體培養(yǎng)基，37℃100rpm搖床溫育培養(yǎng)1h。培養(yǎng)后菌液3,000rpm離心2min，棄上清600μL，剩余菌液混勻后涂布到含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。經(jīng)測(cè)序(上海生工生物工程股份有限公司)后獲得陽性克隆E.coli BL21/pET28a-scrII-mtf。其中scrII的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其C端添加的信號(hào)序列mtf的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
實(shí)施例6：重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)
LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0。需要時(shí)使用前加入氨芐青霉素(100μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)，固體培養(yǎng)基添加1.5％瓊脂粉。挑取陽性克隆單菌落接種于10mL含100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取10mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于1L含100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6。向培養(yǎng)物中加入終濃度為0.1mM誘導(dǎo)物異丙基-Β-D-硫代半乳糖苷，在培養(yǎng)溫度30℃下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)10h。
實(shí)施例7：SrtA和SCRII-mtf的純化
將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液離心，收集菌體，用生理鹽水洗滌3次后重懸于20mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)，超聲破碎。12,000r/min，4℃離心收集上清液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后的濾液即為粗酶液。純化方法的原理是利用Ni離子與組氨酸特異性吸附的特點(diǎn)使目的蛋白與雜蛋白得到分離，在低溫條件下，先后用5個(gè)柱體積的超純水和5個(gè)柱體積的Binding buffer(20mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH 8.0)沖洗和平衡Ni柱，然后將粗酶液緩慢通過柱子，以線性洗脫的方式流加Elution buffer(20mM Tris-HCl、150mM NaCl、1M咪唑，pH 8.0)，收集目標(biāo)蛋白，經(jīng)超濾濃縮后，所得蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢驗(yàn)其純度。
實(shí)施例8：SrtA介導(dǎo)SCRII-mtf寡聚化
(1)SCRII寡聚體制備：
向連接體系(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，10mM CaCl2，pH 7.5)中加入SrtA(25μmol/L)和SCRII-mtf(30μmol/L)分別在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的條件下進(jìn)行反應(yīng)，同時(shí)，在相同的體系中加入同等量的SrtA和SCRII作為對(duì)照，反應(yīng)時(shí)間為8h。連接產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析后確定最佳連接溫度為25℃。然后在25℃下將反應(yīng)進(jìn)行12h，24h和36h，觀察連接產(chǎn)物產(chǎn)量的變化，最終確定36h時(shí)產(chǎn)物的量最多，因此，確定反應(yīng)時(shí)間為36h。
(2)SCRII寡聚體的分離：
連接反應(yīng)結(jié)束后，將連接體系超濾濃縮至500μL，用50mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH8.0的緩沖平衡凝膠柱Superdex 200，接下來將濃縮后的樣品過柱，根據(jù)分子篩效應(yīng)分離得到SCRII寡聚體，SDS-PAGE鑒定純度。
實(shí)施例9：酶活測(cè)定體系
100μL體系中含有100mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)，0.5mM NADPH，5mM 2-HAP，35℃恒溫3min，加入適量酶液混勻后，酶標(biāo)儀掃描340nm處的吸光值變化。酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。定義1個(gè)酶活單位(U)為每分鐘催化氧化1μmol輔酶NADPH的酶量。蛋白含量的測(cè)定：采用Bradford法測(cè)定，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。比活計(jì)算公式：比活(U/mg)＝酶活(U)/蛋白量(mg)。
測(cè)定SCRII和SCRII-mtf和SCRII寡聚體對(duì)底物2-HAP的比酶活。三種酶的活性在同一條件下進(jìn)行測(cè)定，SCRII對(duì)2-羥基苯乙酮的比活為6.3U/mg，與之前文獻(xiàn)當(dāng)中報(bào)道的結(jié)果基本一致；而在C端添加了GGGGSLPETGG序列的SCRII-mtf的比活較之有所增加，為8.7U/mg；SCRII寡聚體對(duì)2-羥基苯乙酮的活性比較高，為38.5U/mg，與SCRII相比提高了6倍。
實(shí)施例10：
分別在不同溫度梯度(20–70℃)和pH梯度(4.0–9.0)下測(cè)定SCRII、SCRII-mtf及SCRII寡聚體的酶活，確定三者的最適pH和最適溫度。將三種酶置于不同溫度(10–60℃)下1h后進(jìn)行酶活的測(cè)定，評(píng)估溫度穩(wěn)定性。在4℃條件下將三種酶放置在不同pH梯度(4.0–9.0)的緩沖溶液中，24h后測(cè)定酶活，確定三者的pH耐受性。
酶最適溫度的測(cè)定結(jié)果顯示，SCRII和SCRII-mtf的趨勢(shì)基本一致，隨著溫度的升高，活性逐漸增加，在35℃時(shí)達(dá)到最大，隨后溫度升高，活性迅速降低；SCRII寡聚體在20–60℃，相對(duì)酶活都比較接近，隨著溫度升高，相對(duì)酶活有所增加，并在50℃時(shí)達(dá)到最大值，高于60℃時(shí)活性迅速降低。酶最適pH的測(cè)定在4.0–9.0的范圍內(nèi)，三種酶幾乎有相同的趨勢(shì)，SCRII和SCRII-mtf在pH為6.0時(shí)活性最高，而SCRII寡聚體在pH為6.0和6.5同時(shí)具有最大活性。
溫度穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果顯示，SCRII和SCRII-mtf在40℃放置1h后，活性保留原來的80％，而在50℃時(shí)則迅速降低，活性不足20％，SCRII寡聚體在10–50℃放置1h，活性仍舊維持在90％以上。三種酶的pH耐受性結(jié)果區(qū)別不大，在pH5.0–9.0的范圍內(nèi)活性都在75％以上。
實(shí)施例11：動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定
測(cè)定SCRII和SCRII-mtf和SCRII寡聚體對(duì)底物2-HAP的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，測(cè)定體系：100mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)，5mM NADPH，0.5–20mM 2-HAP以及適量的純酶液，總體積100μL。每個(gè)測(cè)定實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，利用Michaelis-Menten和Lineweaver-Burk方程求出動(dòng)力學(xué)參數(shù)。SCRII、SCRII-mtf和SCRII寡聚體的Km(mmol/L)分別為4.52、3.98和1.40，與原始酶SCRII相比，SCRII寡聚體的變化比較明顯，在數(shù)值上降低了3.3倍；Vmax值的測(cè)定結(jié)果顯示，SCRII-mtf與SCRII的最大反應(yīng)速率非常接近，分別為32.17U/mg和33.00U/mg，因此相應(yīng)的kcat值也很相近，而SCRII寡聚體相比前兩者有所提高，達(dá)到了42.72U/mg。動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果表明SCRII寡聚體有著更低的Km值和更高的kcat值。
實(shí)施例12：不對(duì)稱轉(zhuǎn)化
用SCRII、SCRII-mtf、SCRII寡聚體分別轉(zhuǎn)化2-HAP，對(duì)比轉(zhuǎn)化結(jié)果。反應(yīng)體系：100mM磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)，5g/L 2-HAP和等摩爾的NADPH，以及適量的純酶液(約1mg蛋白)，總體積2mL。反應(yīng)在35℃、200r/min的條件下反應(yīng)3h。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。
反應(yīng)結(jié)束后，上清液加入2倍體積乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用于分析。產(chǎn)物通過手性固定相高效液相色譜(Agillent HP1100)進(jìn)行分析，條件為Chiralcel OB-H柱(4.6mm×25cm；Daicel Chemical Ind.,Ltd.,Japan)，流動(dòng)相為正己烷/異丙醇(9/1)，流速0.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。產(chǎn)物的光學(xué)純度通過對(duì)映過量值來衡量。
產(chǎn)物(S)-苯基乙二醇對(duì)映過量值的計(jì)算：對(duì)映過量值(e.e.％)＝[(CS-CR)/(CS+CR)]×100％
產(chǎn)物(S)-苯基乙二醇產(chǎn)率的計(jì)算：產(chǎn)率(％)＝CS/C0×100％
式中CS為反應(yīng)后(S)-對(duì)映體的濃度，CR為反應(yīng)后(R)-對(duì)映體的濃度，C0為反應(yīng)前底物2-羥基苯乙酮的濃度。
結(jié)果顯示，SCRII轉(zhuǎn)化(S)-苯基乙二醇的產(chǎn)率為43％，SCRII-mtf為45％，SCRII寡聚體的產(chǎn)率>99％。
以SCRII-mtf和SCRII寡聚體為催化劑，不對(duì)稱生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)后，產(chǎn)物均為(S)-苯基乙二醇，且SCRII寡聚體相對(duì)于原始酶SCRII將反應(yīng)時(shí)間縮短了16倍。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
序列表
<110> 江南大學(xué)
<120> Sortase A介導(dǎo)的（S）-羰基還原酶寡聚體高效催化（S）-苯基乙二醇的合成
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Gly Glu Ile Glu Ser Tyr Cys Asn Lys Glu Leu Gly Pro Leu Pro
1 5 10 15
Thr Lys Ala Pro Thr Leu Ser Lys Asn Val Leu Asp Leu Phe Ser Leu
20 25 30
Lys Gly Lys Val Ala Ser Val Thr Gly Ser Ser Gly Gly Ile Gly Trp
35 40 45
Ala Val Ala Glu Ala Tyr Ala Gln Ala Gly Ala Asp Val Ala Ile Trp
50 55 60
Tyr Asn Ser His Pro Ala Asp Glu Lys Ala Glu His Leu Gln Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Gly Val Arg Ser Lys Ala Tyr Lys Cys Asn Ile Ser Asp Pro Lys
85 90 95
Ser Val Glu Glu Thr Ile Ser Gln Gln Glu Lys Asp Phe Gly Thr Ile
100 105 110
Asp Val Phe Val Ala Asn Ala Gly Val Pro Trp Thr Glu Gly Pro Glu
115 120 125
Ile Asn Val Asp Asn Tyr Asp Ser Trp Asn Lys Ile Ile Asn Leu Asp
130 135 140
Leu Asn Gly Val Tyr Tyr Cys Ala His Thr Val Gly Lys Ile Phe Lys
145 150 155 160
Lys Asn Gly Lys Gly Ser Leu Val Ile Thr Ser Ser Met Ser Gly Thr
165 170 175
Ile Val Asn Val Pro Gln Leu Gln Ala Ala Tyr Asn Ala Ala Lys Ala
180 185 190
Ala Cys Thr His Leu Thr Lys Ser Leu Ala Val Glu Trp Ala Pro Phe
195 200 205
Ala Arg Val Asn Cys Val Ser Pro Gly Tyr Ile Ala Thr Glu Ile Ser
210 215 220
Asp Phe Val Glu Lys Asp Met Lys Ala Lys Trp Trp Gln Leu Thr Pro
225 230 235 240
Leu Gly Arg Glu Gly Leu Ala Gln Glu Leu Val Gly Ala Tyr Leu Tyr
245 250 255
Leu Ala Ser Asn Ala Ser Thr Tyr Thr Thr Gly Ala Asn Leu Ala Val
260 265 270
Asp Gly Gly Tyr Thr Cys Pro
275
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 2
Leu Pro Xaa Thr Gly
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Leu Pro Glu Thr Gly
1 5
<210> 4
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
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1 5 10 15
Tyr Ile Glu Ile Pro Asp Ala Asp Ile Lys Glu Pro Val Tyr Pro Gly
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145
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgccatatgc aagctaaacc tcaaattc 28
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccgctcgagt ttgacttctg tagctac 27
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cccatgggcg aaatcgaatc 20
<210> 8
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccctcgaggc cgccggtttc cggaaggctg ccaccgccac ctggacaagt gtaaccacca 60
tc 62
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5